Summary
Aqui descrevemos uma técnica de microdissecção seguido de injeção de corante fluorescente no gânglio acústico de embriões de galinha cedo para rastreamento seletivo das fibras auditivas axônios no nervo e rombencéfalo.
Abstract
O pintainho embrionário é um modelo largamente utilizado para o estudo das projecções periféricas e centrais de células ganglionares. No sistema auditivo, rotulagem seletiva de axônios auditivos dentro do nervo craniano VIII aumentaria o estudo do centro de desenvolvimento circuito auditivo. Esta abordagem é difícil porque múltiplos órgãos sensoriais do ouvido interno, contribuir para o nervo VIII 1. Além disso, os marcadores que distinguem de forma confiável auditivo versus grupos vestibulares de axónios no interior do nervo VIIIth aviária ainda têm de ser identificados. Vias auditivas e vestibulares não podem ser distinguidas funcionalmente em embriões precoces, como sensoriais evocadas respostas não estão presentes antes dos circuitos são formados. Centralmente projetando axônios VIII foram traçadas em alguns estudos, mas auditivo rotulagem axônio foi acompanhada de rotulagem de outros componentes do nervo VIII 2,3. Aqui, nós descrevemos um método para o rastreio anterógrada do gânglio acústico para selectivamente labeaxónios auditivas l dentro do nervo VIIIth desenvolvimento. Em primeiro lugar, após o esvaziamento parcial da região cefálica anterior de um embrião de pinto com 8 dias de imersão em fluido cerebrospinal artificial oxigenado, o ducto coclear é identificado por anatómicas. Em seguida, uma micropipeta de vidro fino puxado está posicionado para injectar uma pequena quantidade de rodamina dextran amina na região adesiva e profunda adjacente onde as células ganglionares acústicos estão localizados. Dentro de 30 minutos após a injeção, os axônios auditivas são rastreados centralmente na parte posterior do cérebro e posteriormente pode ser visualizado a seguir à preparação histológica. Este método proporciona uma ferramenta útil para estudos do desenvolvimento da formação periférica de circuito auditivo central.
Protocol
1. Preparar os instrumentos de dissecação seguinte e Reagentes
- Fluido cerebrospinal artificial (aCSF; 130 mM de NaCl, 3 mM KCl, 1,2 mM de KH 2 PO 4, 20 mM de NaHCO3, 3 mM de HEPES, 10 mM de glicose, 2 mM de CaCl2, 1,3 mM MgSO4) infundida continuamente com 95% de O 2/5% CO 2, à temperatura ambiente. Para a perfusão, encher a 2/3 de 500 ml de boca larga frasco Nalgene com um buraco perfurado na tampa. Tanque vai ser ligado a um tubo de um borbulhador de vidro haste, que penetra o aCSF através do orifício na tampa do frasco. Regule a pressão para se obter um fluxo constante de bolhas que alcançam de cerca de 1/3 do líquido, mas não são suficientemente forte para provocar salpicos sobre o aro. Submerge 5 ml frascos de vidro (até 6) para dentro do frasco de Nalgene para separar amostras individuais uns dos outros e da turbulência do fluxo de gás. ACSF oxigenado deve ser, pelo menos, 20 min antes de qualquer incubação de tecidos.
- Prato de dissecação pequeno silicone (35 mm x 10milímetro revestido Petri usando Sylgard elastômeros Kit) com dois pinos de dissecação colocados em poliestireno hexagonal pequena (47 fundo mm) pesam barco.
- Dois ponta fina fórceps, um tip-fórceps curvo, numa proveta de 50 ml, e um recipiente para resíduos de tecidos.
- Puxado micropipeta de vidro (1,2 OD / 0,9 ID) quebrado de aproximadamente 20-50 uM de abertura na ponta e preenchido com rodamina dextran amina (RDA, MW = 3000, Invitrogen) em uma solução de 6,25% com 0,4% de Triton X-100 em PBS . Anexar por tubos bem para picospritzer e estabilizar a micromanipulador.
2. Micro dissecção para revelar papila basilar no E8 4,5
- Com pinças curvas, corte E8 embrião logo abaixo do tronco, colocando a cabeça diretamente sobre silicone revestido prato dissecção dentro pesar barco.
- A utilização de pinos de dissecação, posicionar a cabeça com uma vista ventral de modo que o ouvido do lado de juros é um pouco visível, o cabeça ligeiramente inclinada dorsalmente e apontando 10-30 graus de distância da center (Figura 2A). Imediatamente proteger a cabeça com pinos. Se bilateral traçado é desejada, a cabeça do centro em 0 graus, ou uma visão completa ventral para que ambos os lados podem ser acessados. Da mesma forma, para uma injeção do lado esquerdo, fixar a cabeça de -10 a -30 graus do centro para o lado esquerdo é acessível.
- Usando o copo de 50 ml, transferir 30 ml de aCSF oxigenado para o prato, totalmente submergindo o tecido.
- Agarre cuidadosamente e descascar para baixo a mandíbula inferior utilizando uma pinça de ponta fina, em seguida, remover a pálpebra inferior do lado de interesse.
- Remover o tecido vascular sobrejacente, incluindo qualquer paladar restante e garganta. Estes tecidos moles deverão descascar revelar a superfície lisa de desenvolver chondrocranium com as artérias vertebrais distintas na sua superfície. Até este ponto, a massa branca característica otoconial deve ser visível.
- Dissecar cuidadosamente a pele ao redor do meato externo, cartilagem da articulação da mandíbula e do ouvido médio, deixando o emner ouvido intacto. Use a pinça para gentilmente cortar estas estruturas cartilaginosas.
- Remover artérias vertebrais e acúmulo de sangue através de um movimento de varredura suave com as pontas finas fórceps. Sangue pode obscurecer vista e de coagulação pode ligar a abertura pipeta de injeção.
- O ducto coclear com epitélio sensorial adjacente (papila basilar) e gânglio acústico encontra-se directamente por baixo do chondrocranium 6 e pode ser visualizada como uma projecção semelhante a dedo alongado que se prolonga a partir do ouvido interno ventralmente, com a ponta distal-mais (vértice) próximo do anterior linha média 5. Pode haver um pequeno agrupamento de sangue (vermelho) do dissecação e / ou calcificações otolíticos (branco) no vértice do ducto coclear (Figura 2B), que pode auxiliar na visualização. No ápice é a mácula lagenar, um adesivo sensitivo pensado para ser da função vestibular 7,8.
3. Rotulagem seletiva de CN VIII Auditivo Fibras
- Lentamente baixar a micropipeta a primeira punção do crânio. Esta região craniana é mais fino do que áreas adjacentes e requer menos força para penetrar. A micropipeta deve agora ser dentro do ducto coclear. Opcional: uma pequena injecção de rastreio corante pode ser feita aqui para ajudar a visualizar a papila basilar.
- Sem reposicionar o micropipeta, continue baixando até ele apenas violações da fronteira profunda do ducto coclear (Figura 1). Realizar uma injecção e repetir em várias regiões ao longo do comprimento da papila basilar (Figuras 2C, 2D), excluindo a extremidade mais proximal onde a lagena vestibular está localizado. Com o picospritzer definido entre 10-30 psi, várias injeções são feitas. O volume do fluido injectado varia de corante, e depende do grau de rotulagem desejada. Cada injecção deverá resultar num corante fluorescente-laponto Beled de aproximadamente 200-400 um de diâmetro (Figura 2D).
- Uma vez que a injecção está completa, utilize uma pinça para transecção da amostra acima do tronco cerebral e da utilização de uma pipeta de transferência para colocar a porção de caudal para um pequeno frasco dentro do recipiente de aCSF continuamente perfundidos com 95% O2 / 5% de CO 2.
- Para cada embrião, 20-30 min para permitir a transferência de corantes, em função da distância do centro de rastreio desejado.
- Remover o tecido e se preparar para cortes histológicos. No exemplo mostrado aqui, o tecido é imerso em paraformaldeído a 4% (em 1X PBS) durante a noite, de sacarose a 30% (em 1X PBS) durante a noite.
4. Contracoloração e Análise
- Contracoloração é útil para ajudar a orientar o observador a localização anatômica, bem como identificar as regiões de interesse particular. Um contracorante eficaz nesta preparação é de imunomarcação de neurofilamento (Figuras 1, 3B, 3E), o que fortemente l comabels axônios e permite a demarcação de vias axonais no SNC.
- Análise deveria ser realizada por toda a região marcada, tal como as saliências podem estender várias centenas de microns ou mais ao longo do eixo rostro-caudal. Alguns exemplos de análises básicas são: taxas de erro de segmentação de tempo, e / ou alterar os padrões de divergência de projecção. RDA axónios marcados são visualizados no sistema nervoso periférico e central, com alta resolução (Figuras 3A, 3D).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Os componentes do nervo VIII e a anatomia do nervo em si são complexas e tortuosas (Figuras 1, 3). Seletivamente o rastreio fibras resultantes a partir de células do gânglio acústicos, os segmentos do nervo VIII, bem como aferentes auditivos primários dentro do tronco cerebral podem ser rastreados de forma limpa e distinguidos dos seus homólogos vestibulares (Figuras 2, 3). Do mesmo modo, esta técnica pode ser utilizada para estudar as projecções periféricas das células ganglionares acústicas (Figura 3G), ou modificado para estudar as projecções resultantes de cada aparelho vestibular. Porque axônios são limpa traçada ao longo de seu comprimento inteiro, precisas análises quantitativas pode ser realizada a partir de projeções auditivo distintiva vestibulares durante o desenvolvimento, incluindo o tempo preciso e padrões de inervação inicial, taxas de erro de segmentação, etc Além disso, ao contrário da abordagem anterior de rotulagem fibra auditiva, esta abordagem é desempenhomed em não-tecido fixo, vivo e, assim, pode ser utilizado em simultâneo para outro na experimentação in vitro.
Embora esta técnica é adequada para embriões de E6-E9, os melhores resultados início às E8 quando os axônios auditivas ter enervado seus principais alvos centrais 3. Em contraste, as projeções vestibulares chegar no tronco cerebral antes 9,10 e, portanto, serviria como melhores candidatos para rastreamento mais cedo, embora tecnicamente difícil devido ao pequeno tamanho e relativa imaturidade do aparelho vestibular nesta idade. Cortes histológicos devem ser examinados para confirmar a localização da injecção do corante, tal como a região apical, a maior parte da papila basilar contém uma pequena mancha sensorial pensado para ser da função vestibular e se etiquetado pode potencialmente contaminar os resultados.
Uma vez que o investigador está familiarizado com a anatomia, três dos problemas mais comuns encontrados são como se segue:
- O du coclearct é preenchido com o rastreamento de corante, mas axônios das células ganglionares não são rotulados. Este problema provavelmente indica que a injecção, não foi realizada a profundidade do ducto coclear, onde as células ganglionares e fibras nervosas residem. Este problema pode ser corrigido através da garantia de que os furos de injecção do primeiro chondrocranium micropipeta, em seguida, é suavemente avançada, de modo a só punção através do outro lado do tubo. Alternativamente, a pipeta de injecção pode ter sido posicionado correctamente, mas forneceu quantidades insuficientes de corante. Aumentar a pressão de injeção ou o número de injeções também podem superar esse problema.
- O nervo seccionado for inadvertidamente como uma consequência do excessivo puxar o labirinto cartilaginoso durante a dissecção. Esta dificuldade pode ser evitada pelo uso de técnicas de dissecção fina e dissecção limitada do ouvido médio.
- A injeção é muito extensa e, inadvertidamente, outros rótulos células ganglionares sensoriais ou fibras nervosas decorrentes de componentes outros. ThÉ problema pode ser minimizado através da optimização de protocolos de injecção, e poderá ser necessário reduzir a pressão de injecção ou o número de impulsos, ou mudando a localização de injecções.
Dois exemplos de análises possíveis são:
- Divergência de padrões de projeção: determina a extensão dos axônios marcados ao longo de um determinado eixo, e como eles podem ser afetados experimentação seguinte. Rostrocaudal divergência pode ser descrita como:
(Número secções contendo axónios marcados) x (espessura de cada secção) Esta medida pode ser corrigido para a medida de corante marcador como uma proporção da papila basilar, ou em tecido contracorados, para a proporção de axônios VIII marcados. Esta é uma ferramenta útil para a análise topográfica projecções, enquanto os axónios podem ser marcados de forma limpa rastreados para os seus campos de terminais na parte posterior do cérebro. Para medições de tonotopia, injecções de corante deve ser limitada à região de interesse ao longo do basILAR papila.
- Segmentação erros: determina a frequência de axônios mistargeted para cada região predeterminada de tecido analisado (pode ser por secção, por embrião, etc.) Pode resultar em perturbações axônios seguem um caminho de projecção ou anormal, que termina numa região inadequado. Quando quantificar erros, os números devem ser normalizados para levar em conta a diferença na quantidade de injecção entre embriões. Injeções menores são mais propensos a resultar na capacidade de marcar axônios individuais. Uma análise erro básico focalização pode ser descrita como:
Figura 1. Coronal de E6 tronco cerebral para simplificaçãogânglios acústico bilateral intacta. pipeta vermelho esquematizado ilustra preciso direcionamento de células ganglionares acústicas de um ponto de entrada dorsolateral. As seções são immunolabeled com anti-neurofilamento para destacar projeções axonais. Órgãos vestibulares são rostral seções mostradas. Região de injeção RDA para a fibra seletiva rastreamento demonstrado com vermelho ilustração pipeta. VIII = vestibulococlear nervo, gânglio AG = acústico, VG = gânglio vestibular. Dorsal é para cima. Escala da barra = 300 uM.
Figura 2. Microdissecção e injeção de região-alvo. (A) posição adequada do embrião no prato dissecção, vista ventral com a cabeça inclinada, dorsal e virou-se ligeiramente para o lado para permitir melhor acesso para o lado direito. E direitoar é mostrado e papila basilar subjacente é indicada com uma linha tracejada. Arrowhead em (A) e (B) ilustra a posição inicial de inserção pipeta dissecção (B) A seguir, a massa branca otoconial é visível, demarcando a fronteira apical da papila basilar (seta). (C, D) Primeira injecção deve fornecer uma Esquema do ducto coclear. (D) injeções subsequentes devem ser feitos apenas profunda a papila do ducto coclear e basilar para a região gânglio acústico. Fluorescência RDA é útil para melhorar a percepção de profundidade de injecção e cada injecção individual deve criar uma mancha fluorescente marcado com corante de cerca de 200-400 um de diâmetro, como visto aqui. Barra de escala = 2 mm.
Figura 3. Imagens representativas de fibra seletiva rastreamento em um embrião E8. (AC) de baixa potência e (DG) de alta potência de 25 um cortes coronais coletadas a partir do embrião mesmo em planos diferentes. (A) axônios RDA rotulados podem ser rastreados a partir de local da injecção (seta ), através do nervo cranial (seta) e caudalmente em direção as metas auditivos primários núcleos (dupla ponta de seta). (B) imunomarcação com destaques anti-neurofilamentos anticorpos todas as projeções axonais e as fibras RDA-traçadas de (A) estão dentro da projeção auditivo pathway. Sobreposição de separada (A) e (B) os canais mostrados como uma cor de fundir em (C). (DF) de imagem de alta potência do mesmo embrião numa posição mais caudal demonstra (A) de alta resolução de fibras no ponto de entrada do nervo ( seta) e ao longo da via central (duplo ponta de seta). (E) </ Strong> neurofilamento mancha de todos os axônios permite demarcação de PNS-CNS e auditivo putativa contra projeções vestibulares. Ap e Vp indicam auditivo respectivos componentes e vestibulares periféricos para o ponto de entrada do nervo, enquanto que Ac e Vc indicam auditivo respectivas projecções e vestibulares centrais para o ponto de entrada do nervo. Sobreposição de separado (D) e (E) canais mostrados como uma cor de fundir em (F). (G) O exame histológico do gânglio acústico revela a localização de células marcadas a partir do gânglio acústicos (traçado mostrado em (AF) e as suas projecções periféricas asterisco) são rastreados retrogradamente a papila basilar. (H) Ilustração de uma via de 700 mM rastreamento auditivo esperado com rotulagem específica VIII em E8. Local da injecção (círculo vermelho) é caudal de ponto de entrada do nervo, e as projeções centrais viajar rostral e caudalmente uma vez na parte posterior do cérebro. Vp = colete periféricaibular, Ap = periférica auditiva, Vc = vestibular central, Ac = auditivo central, AG = gânglio acústico, BP = basilar papila, LM = mácula lagenar, SVG = gânglio vestibular superior, IVG = gânglio vestibular inferior. Barra de escala = 300 mm para AC, 100 mm para DF, 100 M em G e 500 mm em h.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Estudos sobre o desenvolvimento precoce do nervo VIII têm sido limitada, em parte, devido à dificuldade em identificar os axônios embrionárias resultantes de gânglios distinto múltipla. Vários estudos exploraram os sinais moleculares orientadores auditivo e vestibular célula sensorial e destinos de células ganglionares durante o desenvolvimento precoce, 5,11,12 mas os processos que regulam a inervação central têm ainda a ser determinado. Relatórios de projeções das células ganglionares acústicas normalmente descrever processos periféricos epitélio sensorial 13-15, ao passo que pouco se sabe sobre os processos centrais projetam para núcleos primário. Estudos de centralmente projetando subdivisões VIII durante a embriogênese são muitas vezes eletrofisiológico, tais como gravações ópticas em rombencéfalo pinto embrionário 16 ou imagens de cálcio em uma fatia tecidos de mamíferos 17, mas não pode ser realizada antes da conclusão dos circuitos neurais. O uso de marcadores imunológicos de etiquetaaxônios no nervo auditivo VIII garota não é actualmente possível. Enquanto grupos distintos de factores de transcrição foram identificados que se correlacionam com os neurónios vestibulares auditivo contra 18-23, a expressão destes factores é excluído axónios. Em camundongos, as diferenças foram encontradas entre gânglio espiral e gânglios vestibular da expressão do gene, incluindo alguns candidatos promissores que poderiam diferenciar o crescimento do axônio entre as modalidades. Estudo 23 posterior dos produtos de genes pode produzir ferramentas importantes para estudos tanto de mamíferos e aves. Com os métodos descritos aqui, as fibras de auditivas em tecidos vivos embrionário com um circuito auditivo intacto pode ser selectivamente rastreados para os seus alvos centrais.
O embrião de galinha é um sistema particularmente útil para vertebrado embriologistas e é capaz de ultrapassar algumas das limitações encontradas em sistemas de mamíferos. Regulamento de padronização ouvido cedo interior e morfogênese emaves mostra notável semelhança aos mamíferos 1,12, enquanto embriões de galinha são maiores e mais acessíveis do que embriões de roedores nas fases iniciais, quando o sistema auditivo periférico está sendo formado. O método aqui apresentado para a detecção selectiva de fibras auditivas facilita a experimentação precoce sobre as projecções centrais da orelha desenvolvimento interior.
Desenvolvemos este protocolo em um esforço para identificar diferencialmente projecções auditivas centrais do nervo VIII, mas, igualmente, que podem ser modificados para etiquetar selectivamente as fibras de outros órgãos sensoriais do ouvido interno. Em contraste com os métodos descritos anteriormente, este procedimento é realizado em tecido vivo com o circuito inteiro intacto. Um método semelhante realizado foi usado para descrever temporização de VIII inervação aferente auditiva durante a embriogénese aviária, no entanto, as fibras vestibulares também foram inadvertidamente rotulado 3 Aqui nós fornecemos um método para identificar claramente região de ou.igin e terminação, bem como de alta resolução única fibra de seleção central de projeção aferentes auditivas durante a embriogênese de vertebrados.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Candace Hsieh para sugestões e assistência com técnicas de imagem e Doris Dr. Wu para a perícia no pinto anatomia do ouvido interno durante a embriogênese. Este trabalho foi financiado pela NSF IOS-0642346, NIH T32-DC010775, NIH T32-GM008620, NIH R01-DC010796, e GAANN DOE P200A120165.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polystyrene Weigh Dish | Fisher Scientific | 02-202-101 | |
| Petri Dish, 35 X 10 mm | Fisher Scientific | 50820644 | Use to make silicone dissection dish |
| Sylgard Silicone Elastomer Kit | World Precision Instruments | SYLG184 | Coat Petri to make dissection dish |
| Dissection Pins | Various | Holds embryo in place during dissection | |
| NaCL | Various | part of aCSF recipe | |
| KCl | Various | part of aCSF recipe | |
| KH2PO4 | Various | part of aCSF recipe | |
| NaHCO3 | Various | part of aCSF recipe | |
| Glucose | Various | part of aCSF recipe | |
| CaCl2 | Various | part of aCSF recipe | |
| MgSO4 | Various | part of aCSF recipe | |
| Container for aCSF. Suggest translucent wide-mouth Nalgene jar, 500 ml (16 oz) with lid. | CPLabSafety | QP-PLC-03717 | Drill hole opening in top of lid for glass bubling stem to penetrate liquid |
| Empty 5 ml glass vial or comparable transparent vial | American Pharmaceutical Partners, Inc | 6332300105 | Use during aCSF incubation to keep samples separate from each other and from the bubbling stream |
| Tank of carbogen (95%O2 / 5%CO2) connected by tubing to bubbler | Various | Attach by tubing to glass stem bubbler for infusion into aCSF | |
| Glass stem bubbler | Various | To infuse carbogen into aCSF | |
| Curved-tip forceps | World Precision Instruments | 501008 | To remove embryo head from egg |
| Two fine-tip forceps | World Precision Instruments | 501985 | For micro-dissection |
| 50 ml Beaker | various | ||
| Rhodamine Dextran Amine (RDA) | Invitrogen | various | Fluorescent axon tracer |
| Triton X-100 | ICN Biomedicals | ||
| Phosphate Buffered Saline, (1X PBS) | Various | Standard lab reagent | |
| Thin Wall Glass Capillaries, 1.2 OD, .9 ID 4" (100 mm) length | World Precision Instruments | TW120F-4 | Load with RDA. Each capillary makes two glass micropipettes |
| Needle / Pipette puller | David Kopf Instruments | Model 720 | Settings used: Heat 16.4, Solenoid 2.2 |
| Picospritzer | Parker Instrumentation | various | Attach by fine tubing to glass micropipette |
| Micromanipulator | Narishige | various | |
| Dissection microscope with fluorescence | Various | ||
| 4% Paraformaldehyde | Various | Standard lab reagent | |
| anti-Neurofilament antibody, optional | Millipore | AB1991 | Follow histological protocol recommended by manufacturer |
| Cryostat and associated materials for sectioning | Leica | various | |
| Epifluorescent microscope for imaging | Zeiss, various |
References
- Groves, A. K., Fekete, D. M. Shaping sound in space: the regulation of inner ear patterning. Development. 139, 245-257 (2012).
- Pflieger, J. F., Cabana, T. The vestibular primary afferents and the vestibulospinal projections in the developing and adult opossum, Monodelphis domestica. Anatomy and Embryology. 194, 75-88 (1996).
- Molea, D., Rubel, E. W. Timing and topography of nucleus magnocellularis innervation by the cochlear ganglion. The Journal of Comparative Neurology. 466, 577-591 (2003).
- Bissonnette, J. P., Fekete, D. M. Standard atlas of the gross anatomy of the developing inner ear of the chicken. The Journal of Comparative Neurology. 368, 620-630 (1996).
- Brigande, J. V., Kiernan, A. E., Gao, X., Iten, L. E., Fekete, D. M. Molecular genetics of pattern formation in the inner ear: do compartment boundaries play a role. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 11700-11706 (1073).
- Bellairs, R., Osmond, M. The atlas of chick development. , 2nd Edn, Elsevier. (2005).
- Manley, G. A., Haeseler, C., Brix, J. Innervation patterns and spontaneous activity of afferent fibres to the lagenar macula and apical basilar papilla of the chick's cochlea. Hearing Research. 56, 211-226 (1991).
- Code, R. A. Efferent neurons to the macular lagena in the embryonic chick. Hearing Research. 82, 26-30 (1995).
- Maklad, A., Fritzsch, B. Development of vestibular afferent projections into the hindbrain and their central targets. Brain Research Bulletin. 60, 497-510 (2003).
- Rubel, E. W., Fritzsch, B. Auditory system development: primary auditory neurons and their targets. Annual Review of Neuroscience. 25, 51-101 (2002).
- Satoh, T., Fekete, D. M. Lineage analysis of inner ear cells using genomic tags for clonal identification. Methods Mol. Biol. 493, 47-63 (2009).
- Bok, J., Chang, W., Wu, D. K. Patterning and morphogenesis of the vertebrate inner ear. The International Journal of Developmental Biology. 51, 521-533 (2007).
- Appler, J. M., Goodrich, L. V. Connecting the ear to the brain: Molecular mechanisms of auditory circuit assembly. Progress in Neurobiology. 93, 488-508 (2011).
- Bulankina, A. V., Moser, T. Neural circuit development in the mammalian cochlea. Physiology (Bethesda). 27, 100-112 (2012).
- Fekete, D. M., Campero, A. M. Axon guidance in the inner ear. The International Journal of Developmental Biology. 51, 549-556 (2007).
- Momose-Sato, Y., Glover, J. C., Sato, K. Development of functional synaptic connections in the auditory system visualized with optical recording: afferent-evoked activity is present from early stages. Journal of Neurophysiology. 96, 1949-1962 (2006).
- Marrs, G. S., Spirou, G. A. Embryonic assembly of auditory circuits: spiral ganglion and brainstem. The Journal of Physiology. 590, 2391-2408 (2012).
- Milo, M., et al. Genomic analysis of the function of the transcription factor gata3 during development of the mammalian inner ear. PloS One. 4, e7144 (2009).
- Fritzsch, B., Eberl, D. F., Beisel, K. W. The role of bHLH genes in ear development and evolution: revisiting a 10-year-old hypothesis. Cellular and Molecular Life Sciences : CMLS. 67, 3089-3099 (2010).
- Jahan, I., Kersigo, J., Pan, N., Fritzsch, B. Neurod1 regulates survival and formation of connections in mouse ear and brain. Cell and Tissue Research. 341, 95-110 (2010).
- Huang, E. J., et al. Brn3a is a transcriptional regulator of soma size, target field innervation and axon pathfinding of inner ear sensory neurons. Development. 128, 2421-2432 (2001).
- Jones, J. M., Warchol, M. E. Expression of the Gata3 transcription factor in the acoustic ganglion of the developing avian inner ear. The Journal of Comparative Neurology. 516, 507-518 (2009).
- Lu, C. C., Appler, J. M., Houseman, E. A., Goodrich, L. V. Developmental profiling of spiral ganglion neurons reveals insights into auditory circuit assembly. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 31, 10903-10918 (2011).
