Summary
Her beskriver vi en mikrodissektion teknik efterfulgt af fluorescerende farvestof injektion i den akustiske ganglion af tidlige kyllingefostre til selektiv sporing af auditive axon fibre i nerve-og baghjernen.
Abstract
Den embryoniske kylling er en udbredt model til undersøgelsen af perifere og centrale gangliecelle fremspring. I høresystemet, vil selektiv mærkning af auditive axoner inden for VIIIth kranienerve øge studiet af centrale auditive kredsløb udvikling. Denne fremgangsmåde er udfordrende, fordi multiple sanseorganer i det indre øre bidrage til VIIIth nerve 1. Desuden markører, der pålideligt skelne auditive versus vestibulære grupper af axoner i den aviær VIIIth nerve er endnu ikke identificeret. Auditive og vestibulære veje kan ikke skelnes funktionelt i tidlige embryoner, som sensorisk-fremkaldte responser ikke er til stede før kredsløb formes. Centralt fremspringende VIIIth nerveaxoner er blevet sporet i nogle undersøgelser, men auditive axon mærkning blev ledsaget af mærkning fra andre VIIIth nerve-komponenter 2,3. Her beskriver vi en fremgangsmåde til anterograd sporing fra den akustiske ganglion til selektivt Label auditive axoner inden for udvikling VIIIth nerve. Først efter delvis dissektion af den forreste cephalic region af en 8-dages kyllingeembryo nedsænket i oxygeneret kunstig cerebrospinalvæske, er ductus cochlearis identificeret ved anatomiske kendetegn. Dernæst er et fint trukket glas mikropipette anbragt til at injicere en lille mængde rhodamin dextran amin ind i kanalen og tilstødende dybe område, hvor de akustiske ganglieceller er placeret. Inden for 30 minutter efter injektion auditive axoner spores centralt i baghjerne, og senere kan visualiseres efter histologisk præparat. Denne metode giver et nyttigt redskab for udviklingsmæssige undersøgelser af perifer til central auditive kredsløb dannelse.
Protocol
1. Lav følgende Dissektionsværktøj og reagenser
- Kunstig cerebrospinalvæske (aCSF; 130 mM NaCI, 3 mM KCI, 1,2 mM KH 2 PO 4, 20 mM NaHCO3, 3 mM HEPES, 10 mM glucose, 2 mM CaCl2, 1,3 mM MgSO4) kontinuerligt infuseret med 95% O 2/5% CO2 ved stuetemperatur. Til infusion, fyldes til 2/3 a 500 ml bredhalset Nalgene krukke med et hul boret i låget. Tank vil være fastgjort ved hjælp af rør til et glas stamceller bobleapparat, som trænger ind i aCSF gennem hullet i beholderen låget. Justere tryk for at opnå en konstant strøm af bobler, der når omkring 1/3 af væsken, men er ikke stærk nok til at forårsage sprøjt over kanten. Nedsænkes 5 ml hætteglas (op til 6) ind i Nalgene krukken for at adskille individuelle prøver fra hinanden og fra gasstrømmen turbulens. ACSF skal oxygeneres i mindst 20 min før ethvert væv inkubation.
- Lille silikone dissektion fad (35 mm x 10mm Petri belagt med Sylgard elastomer Kit) med to dissektion stifter placeret i små sekskantede polystyren (47 mm nederst) vejer båd.
- To fine-tip pincet, en krum-tip pincetter, et 50 ml bægerglas, og en beholder til vævsdele.
- Trukket glasmikropipette (1,2 OD / 0,9 ID) brydes til ca 20 til 50 um åbning ved spidsen og er fyldt med rhodamin dextran amine (RDA, MW = 3000, Invitrogen) i en 6,25% opløsning med 0,4% Triton X-100 i PBS . Vedhæft med fine slange til picospritzer og stabilisere til mikromanipulator.
2. Micro-dissektion at Reveal basilaris Papilla ved E8 4,5
- Med buede pincet, skære E8 embryo lige under hjernestammen, placere hovedet direkte på silicone-coated dissektion fad indenfor veje båd.
- Ved hjælp af dissektion pins, hovedet placere med en ventral visning, så øret på siden af interesse er svagt synlig, hovedet vippes lidt dorsalt og peger 10-30 grader væk fra ceadministration af inter (figur 2A). Umiddelbart sikre hovedet med knappenåle. Hvis bilateral tracing er ønsket, center hovedet ved 0 grader, eller en fuld ventral visning, så begge parter kan få adgang til. Tilsvarende for en venstre-sidet injektion, fastgøre hovedet ved -10 til -30 grader fra centrum, så venstre side er tilgængelig.
- Ved hjælp af 50 ml bægerglas, overføres 30 ml oxygeneret aCSF i skålen, fuldt neddyppet vævet.
- Klem forsigtigt og skræl ned underkæben med fin-spids pincet, fjern det nederste øjenlåg på siden af interesse.
- Tag den overliggende vaskulære væv, herunder eventuel resterende gane og spiserør. Disse bløde væv skal skrælle væk afsløre den glatte overflade af udviklingen chondrocranium med de karakteristiske vertebrale arterier på dens overflade. Ved dette punkt bør det karakteristiske hvide otoconial masse være synlige.
- Forsigtigt dissekere huden omkring den ydre øregang, brusk fra kæben fælles, og mellemøret samtidig lade iNER øre intakt. Bruge tangen til forsigtigt bortskåret disse bruskagtige strukturer.
- Fjern vertebrale arterier og samle blod ved hjælp af en blid fejende bevægelse med de fine pincet tips. Blod kan skjule visning og koagulering kan slutte indsprøjtning pipette åbning.
- Ductus cochlearis med tilstødende sensoriske epithel (basilar papilla) og akustisk ganglion ligger direkte under chondrocranium 6, og kan visualiseres som en langstrakt finger-lignende fremspring strækker sig fra det indre øre ventralt, med den mest distale spids (apex) nær den forreste midterlinjen 5. Der kan være en lille opsamling af blod (rød) fra dissektion og / eller otolithic forkalkninger (hvide) ved spidsen af ductus cochlearis (figur 2B), som kan hjælpe til visualisering. Ved toppunktet er lagenar macula, en sensorisk plaster menes at være af vestibulær funktion 7,8.
3. Selektiv mærkning af KN VIII Auditory Fibers
- Sænk langsomt mikropipetten til første punktering kraniet. Denne skallepartiet er tyndere end omkringliggende områder og kræver mindre kraft til at trænge igennem. Den mikropipette skulle nu være inde i cochlear kanal. Valgfrit: en lille indsprøjtning af sporing farvestof kan her henvises til hjælp til at visualisere basilar papilla.
- Uden repositionering af mikropipetten fortsætte sænkning indtil den netop brud den dybe kant af cochlear kanal (Figur 1). Udføre en indsprøjtning her og gentages i flere områder langs længden af den basilar papilla (figurerne 2C, 2D), bortset fra den mest proksimale ende, hvor den vestibulære lagena er placeret. Med picospritzer indstilles mellem 10-30 psi, er flere injektioner foretages. Mængden af injiceret farvestof væske varierer og afhænger af omfanget af mærkning ønskes. Hver injektion bør resultere i et fluorescerende farvestof-laBeled plet på ca 200 til 400 um diameter (figur 2D).
- Når injektionen er fuldført med pincet for transektere prøven over hjernestammen og overfører dem pipette for at placere den caudale del i en lille krukke inden i beholderen i aCSF stadighed perfunderet med 95% O2 / 5% CO2.
- For hvert embryo, tillader 20-30 min for farveoverføring, afhængigt af den ønskede afstand centrale sporing.
- Fjern væv og forberede til histologisk sektionering. I det viste eksempel er vævet nedsænket i 4% paraformaldehyd (i 1X PBS) natten over, 30% saccharose (i 1X PBS) natten over.
4. Kontrastfarvning og analyse
- Kontrastfarvning er nyttigt at hjælpe orientere observatør til anatomiske placering samt identificere særlige områder af interesse. En effektiv kontrastfarve i dette præparat er neurofilament immunolabeling (figur 1, 3B, 3E), der kraftigt LEtiketterne axoner og muliggør afgrænsning af axonale skrifter i CNS.
- Analysen bør udføres under hele den mærkede region, som fremspringene kan strække sig flere hundrede mikrometer eller mere langs rostrocaudal akse. Nogle eksempler på basale analyser er: målretning fejlprocenter, timing og / eller ændringer i divergerende projektion mønstre. RDA-mærkede axoner visualiseres i det perifere og centrale nervesystem med høj opløsning (fig. 3A, 3D).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Komponenterne i VIIIth nerve og anatomien af nerven selv er komplekse og indviklede (figur 1, 3). Ved selektivt at spore fibre som følge af akustiske ganglieceller, kan segmenter af VIIIth nerve samt primære auditive afferenter i hjernestammen omhyggelig spores og skelnes fra de vestibulære modstykker (figur 2, 3). Ligeledes kunne denne teknik anvendes til at undersøge perifere fremspring af de akustiske ganglieceller (figur 3G), eller modificeret for at studere fremspring vedrørende individuelle vestibulære organer. Fordi axoner rent spores i hele deres længde, kan nøjagtige kvantitative analyser udføres skelne auditive fra vestibulære fremskrivninger under udvikling, herunder præcis timing og mønstre af initial innervation, rettet fejlprocenter mv Derudover i modsætning til den tidligere anvendte metode med auditiv fiber mærkning, denne fremgangsmåde er performancewith om ikke-faste, levende væv og kan således anvendes samtidigt til andre in vitro forsøg.
Selvom denne teknik er velegnet til embryoner fra E6-E9, bedste resultater begynde på E8 når auditive axoner har innerverede deres primære centrale mål 3. I modsætning hertil ankommer vestibulære fremskrivninger i hjernestammen tidligere 9,10 og dermed tjene som bedre kandidater til tidligere opsporing, men teknisk udfordrende på grund af den lille størrelse og relative umodenhed i det vestibulære apparat i denne alder. Histologiske snit bør undersøges for at bekræfte placeringen af farvestof injektion, som den apikale-største område af basilære papil indeholder en lille sensorisk plaster menes at være af vestibulær funktion, og mærket kan potentielt kontaminere resultaterne.
Når investigator er bekendt med anatomi, tre af de mest hyppige problemer er som følger:
- Den cochleære duct er fyldt med sporing farvestof, men gangliecelle axoner er ikke mærket. Dette problem sandsynligvis indikerer, at injektionen ikke blev udført dyb til ductus cochlearis, hvor gangliecellerne og nervefibre bor. Dette problem kan afhjælpes ved at sikre, at injektion mikropipette 1. Punkterer chondrocranium, derefter forsigtigt frem, således at netop punktere gennem den anden side af kanalen. Alternativt kan injektionen pipetten er blevet anbragt korrekt, men leveres utilstrækkelige mængder af farvestof. Stigende indsprøjtningstryk eller antallet af injektioner kan også afhjælpe dette problem.
- Nerven ved et uheld transected som følge af overdreven trække i det bruskagtige labyrint under dissektion. Denne vanskelighed kan undgås ved at anvende fine dissektion teknikker og begrænset dissektion af mellemøret.
- Injektionen er for omfattende og uforvarende mærker andre sensoriske ganglieceller eller fibre som følge af andre nerve komponenter. Ther problem kan minimeres ved at optimere injektion protokoller og kan kræve reduktion af indsprøjtningstryk, eller antallet af impulser, eller flytte placeringen af injektioner.
To eksempler på mulige analyser er:
- Afvigelse af projektions mønstre: afgør omfanget af mærkede axoner langs en bestemt akse, og hvordan de kan blive påvirket efter eksperimenter. Rostrocaudal divergens kan beskrives som:
(Antal sektioner indeholdende mærkede axoner) x (Tykkelse af hver sektion) Denne foranstaltning kan korrigeres for omfanget af farvestof mærke som en del af basilar papilla, eller i kontrastfarvet væv, for andelen af VIIIth nerve mærkede axoner. Det er et nyttigt værktøj til at analysere topografiske fremskrivninger, som de mærkede axoner kan rent spores til deres terminale felter i baghjernen. Til måling af tonotopy bør farvning injektioner begrænses til området af interesse langs basilar papilla.
- Målretning fejl: bestemmer frekvensen af mistargeted axoner for hver forudbestemt område af analyserede væv (kan være i afsnit, per embryo, etc.). Forstyrrelser kan resultere i axoner efter en unormal projektion sti eller ender i en uhensigtsmæssig region. Når kvantificere fejl, bør tallene normaliseres at tage højde for forskellen i injektions beløb mellem embryoner. Mindre injektioner er mere tilbøjelige til at resultere i evnen til at score enkelte axoner. En grundlæggende målretning fejlanalyse kan beskrives som:
Figur 1. Koronal visning af E6 hjernestamme for forenkling medbilateral akustisk ganglier intakt. skematiseret rød pipette illustrerer præcis målretning af akustiske ganglieceller fra et dorsolaterale indgang. Sektioner immunolabeled med anti-neurofilament at fremhæve axonale projektioner. Vestibulære organer er rostralt for viste sektioner. Region af ADT injektion til selektiv auditiv fiber sporing demonstreret med rød pipette illustration. VIII = vestibulocochlear nerve, AG = akustiske ganglion, VG = vestibulære ganglion. Dorsal er op. Scale bar = 300 | jm.
Figur 2. Mikrodissektion og injektion af målområde. (A) passende stilling fostret dissektion fad, ventral visning med hovedet vippes dorsalt og vendte lidt til side for at give bedre adgang til den højre side. Højre eAr er vist og underliggende basilære papil er angivet med en stiplet linie. Pilespids i (A) og (B) illustrerer udgangsstillingen for pipette insertion (B) Efter dissektion, et hvidt otoconial masse er synlig, afgrænser den apikale grænse basilar papilla (pil). (C, D) bør Første injektion tilvejebringe en omrids af den cochlear kanalen. (D) Efterfølgende injektioner bør gøres bare dybt til cochlear kanal og basilaris papilla i den akustiske ganglion regionen. RDA fluorescens er nyttige i at øge injektion dybde perception og hver enkelt injektion bør skabe et fluorescerende farvestof-mærket plet på ca 200 til 400 um diameter som det ses her. Scale bar = 2 mm.
Figur 3. Repræsentative billeder af selektiv auditive fiber sporing i en E8 foster. (AC) lavt strømforbrug og (DG) high power 25 um kronafsnit indsamlet fra samme embryo på forskellige planer. (A) RDA mærkede axoner kan spores fra injektionsstedet (pilespids ), gennem kranienerver (pil) og caudalt mod de primære auditive kerner mål (dobbelt pilehoved). (B) Immunolabeling med anti-neurofilament antistof fremhæver alle axonale projektioner og RDA-spores fibre fra (A) ligger inden for den auditive fremspring pathway. Overlejring af separate (A) og (B) kanaler er vist som en farve fusionere i (C). (DF) med høj effekt billede af den samme embryo på en mere caudal position viser (A) med høj opløsning af fibre på nerven indgangssted ( pil) og langs den centrale pathway (dobbelt pilehoved). (E) </ Strong> neurofilament plet af alle axoner muliggør afgrænsning af PNS-CNS såvel som formodet auditive versus vestibulære fremskrivninger. Ap og Vp indikerer henholdsvis auditive og vestibulære komponenter perifere til nerven indgangspunktet, hvorimod Ac og Vc indikerer henholdsvis auditive og vestibulære fremskrivninger centrale for nerve indgang. Overlejring af separate (D) og (E)-kanaler er vist som en farve fusionere i (F). (G) Histologisk undersøgelse af den akustiske ganglion viser placeringen af mærkede akustiske ganglieceller fra sporing vist i (AF) og deres perifere fremspring ( asterisk), er spores retrogradt til den basilar papilla. (H) Illustration af en 700 um sporing vej forventes med auditory-specifik VIII etikettering på E8. Injektionsstedet (rød cirkel) er caudal til nerve indgang, og centrale fremskrivninger rejse rostral og caudalt gang i baghjernen. Vp = perifer vestibular, Ap = perifere auditive, Vc = central vestibulære, Ac = centrale auditive, AG = akustisk ganglion, BP = basilære papilla, LM = lagenar macula, SVG = overlegen vestibulære ganglion, IVG = ringere vestibulære ganglion. Scale bar = 300 um for AC, 100 um til DF, 100 ìm i G og 500 ìm i H.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Undersøgelser af den tidlige udvikling af VIIIth nerve har været begrænset til dels på grund af vanskelighederne med at identificere embryonale axoner som følge af flere særskilte ganglier. Adskillige undersøgelser har udforsket de molekylære signaler vejledende auditiv og vestibulær sensorisk celle og ganglion celleskæbner under den tidlige udvikling, 5,11,12, men de processer, der regulerer central innervation er endnu ikke fastlagt. Rapporter om akustiske gangliecelle fremskrivninger typisk beskriver perifere processer til sensoriske epithel 13-15, hvorimod mindre vides om de centrale processer rager til primær kerner. Undersøgelser af centralt fremspringende VIII underopdelinger under embryogenese er ofte elektrofysiologisk, såsom optiske optagelser i embryonale chick baghjernen 16 eller calcium imaging i et pattedyrvæv skive 17, men kan ikke udføres inden afslutningen af neurale kredsløb. Anvendelse af immunologiske markører til at mærkeauditive axoner i chick VIIIth nerve ikke i øjeblikket er muligt. Mens forskellige grupper af transskriptionsfaktorer er blevet identificeret, der korrelerer med auditive versus vestibulære neuroner 18-23 er ekspressionen af disse faktorer udelukkes fra axoner. Hos mus er forskelle fundet mellem spiral ganglier og vestibulære ganglier i genekspression, herunder nogle lovende kandidater, der kunne differentiere Axon vækst blandt modaliteter. 23 Yderligere undersøgelse af disse genprodukter kan give vigtige redskaber for både pattedyr og fugle undersøgelser. De metoder, der er beskrevet her, kan auditive fibre i levende embryoniske væv med en intakt auditive kredsløb selektivt spores til deres centrale mål.
Kylling embryo er en særdeles nyttig vertebrat for udviklingsmæssige biologer og er i stand til at overvinde nogle af begrænsningerne som findes i mammale systemer. Regulering af tidlig indre øre mønster og morfogenese ifugle viser bemærkelsesværdig lighed til pattedyr 1,12, mens kyllingefostre er større og lettere tilgængelige end gnavere embryoner i de tidlige stadier, når det perifere auditive system er ved at blive dannet. Den metode, der præsenteres her til selektiv opsporing af auditive fibre letter tidligt forsøg på de centrale fremskrivninger af udviklingen indre øre.
Vi har udviklet denne protokol i et forsøg på at differentielt identificere centrale auditive fremskrivninger af VIIIth nerve, men også det kan modificeres til selektivt at mærke fibre fra andre sanseorganer i det indre øre. I modsætning til tidligere beskrevne fremgangsmåder, er denne procedure udføres på levende væv med hele kredsløbet intakt. En lignende udførte fremgangsmåde blev anvendt til at beskrive timingen af VIII auditive afferent innervation i aviær embryogenese, dog blev vestibulære fibre også utilsigtet mærket 3 Her tilvejebringe en fremgangsmåde til tydeligt at identificere region eller.igin og opsigelse samt høj enkelt fiber opløsning af udvalgte centralt fremspringende auditive afferenter under hvirveldyr embryogenese.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter deklareres.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Dr. Candace Hsieh for forslag og hjælp med billeddiagnostiske teknikker og Dr. Doris Wu for ekspertise på chick indre øre anatomi under tidlig embryogenese. Dette arbejde blev støttet af NSF IOS-0642346, NIH T32-DC010775, NIH T32-GM008620, NIH R01-DC010796, og DOE GAANN P200A120165.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polystyrene Weigh Dish | Fisher Scientific | 02-202-101 | |
| Petri Dish, 35 X 10 mm | Fisher Scientific | 50820644 | Use to make silicone dissection dish |
| Sylgard Silicone Elastomer Kit | World Precision Instruments | SYLG184 | Coat Petri to make dissection dish |
| Dissection Pins | Various | Holds embryo in place during dissection | |
| NaCL | Various | part of aCSF recipe | |
| KCl | Various | part of aCSF recipe | |
| KH2PO4 | Various | part of aCSF recipe | |
| NaHCO3 | Various | part of aCSF recipe | |
| Glucose | Various | part of aCSF recipe | |
| CaCl2 | Various | part of aCSF recipe | |
| MgSO4 | Various | part of aCSF recipe | |
| Container for aCSF. Suggest translucent wide-mouth Nalgene jar, 500 ml (16 oz) with lid. | CPLabSafety | QP-PLC-03717 | Drill hole opening in top of lid for glass bubling stem to penetrate liquid |
| Empty 5 ml glass vial or comparable transparent vial | American Pharmaceutical Partners, Inc | 6332300105 | Use during aCSF incubation to keep samples separate from each other and from the bubbling stream |
| Tank of carbogen (95%O2 / 5%CO2) connected by tubing to bubbler | Various | Attach by tubing to glass stem bubbler for infusion into aCSF | |
| Glass stem bubbler | Various | To infuse carbogen into aCSF | |
| Curved-tip forceps | World Precision Instruments | 501008 | To remove embryo head from egg |
| Two fine-tip forceps | World Precision Instruments | 501985 | For micro-dissection |
| 50 ml Beaker | various | ||
| Rhodamine Dextran Amine (RDA) | Invitrogen | various | Fluorescent axon tracer |
| Triton X-100 | ICN Biomedicals | ||
| Phosphate Buffered Saline, (1X PBS) | Various | Standard lab reagent | |
| Thin Wall Glass Capillaries, 1.2 OD, .9 ID 4" (100 mm) length | World Precision Instruments | TW120F-4 | Load with RDA. Each capillary makes two glass micropipettes |
| Needle / Pipette puller | David Kopf Instruments | Model 720 | Settings used: Heat 16.4, Solenoid 2.2 |
| Picospritzer | Parker Instrumentation | various | Attach by fine tubing to glass micropipette |
| Micromanipulator | Narishige | various | |
| Dissection microscope with fluorescence | Various | ||
| 4% Paraformaldehyde | Various | Standard lab reagent | |
| anti-Neurofilament antibody, optional | Millipore | AB1991 | Follow histological protocol recommended by manufacturer |
| Cryostat and associated materials for sectioning | Leica | various | |
| Epifluorescent microscope for imaging | Zeiss, various |
References
- Groves, A. K., Fekete, D. M. Shaping sound in space: the regulation of inner ear patterning. Development. 139, 245-257 (2012).
- Pflieger, J. F., Cabana, T. The vestibular primary afferents and the vestibulospinal projections in the developing and adult opossum, Monodelphis domestica. Anatomy and Embryology. 194, 75-88 (1996).
- Molea, D., Rubel, E. W. Timing and topography of nucleus magnocellularis innervation by the cochlear ganglion. The Journal of Comparative Neurology. 466, 577-591 (2003).
- Bissonnette, J. P., Fekete, D. M. Standard atlas of the gross anatomy of the developing inner ear of the chicken. The Journal of Comparative Neurology. 368, 620-630 (1996).
- Brigande, J. V., Kiernan, A. E., Gao, X., Iten, L. E., Fekete, D. M. Molecular genetics of pattern formation in the inner ear: do compartment boundaries play a role. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 11700-11706 (1073).
- Bellairs, R., Osmond, M. The atlas of chick development. , 2nd Edn, Elsevier. (2005).
- Manley, G. A., Haeseler, C., Brix, J. Innervation patterns and spontaneous activity of afferent fibres to the lagenar macula and apical basilar papilla of the chick's cochlea. Hearing Research. 56, 211-226 (1991).
- Code, R. A. Efferent neurons to the macular lagena in the embryonic chick. Hearing Research. 82, 26-30 (1995).
- Maklad, A., Fritzsch, B. Development of vestibular afferent projections into the hindbrain and their central targets. Brain Research Bulletin. 60, 497-510 (2003).
- Rubel, E. W., Fritzsch, B. Auditory system development: primary auditory neurons and their targets. Annual Review of Neuroscience. 25, 51-101 (2002).
- Satoh, T., Fekete, D. M. Lineage analysis of inner ear cells using genomic tags for clonal identification. Methods Mol. Biol. 493, 47-63 (2009).
- Bok, J., Chang, W., Wu, D. K. Patterning and morphogenesis of the vertebrate inner ear. The International Journal of Developmental Biology. 51, 521-533 (2007).
- Appler, J. M., Goodrich, L. V. Connecting the ear to the brain: Molecular mechanisms of auditory circuit assembly. Progress in Neurobiology. 93, 488-508 (2011).
- Bulankina, A. V., Moser, T. Neural circuit development in the mammalian cochlea. Physiology (Bethesda). 27, 100-112 (2012).
- Fekete, D. M., Campero, A. M. Axon guidance in the inner ear. The International Journal of Developmental Biology. 51, 549-556 (2007).
- Momose-Sato, Y., Glover, J. C., Sato, K. Development of functional synaptic connections in the auditory system visualized with optical recording: afferent-evoked activity is present from early stages. Journal of Neurophysiology. 96, 1949-1962 (2006).
- Marrs, G. S., Spirou, G. A. Embryonic assembly of auditory circuits: spiral ganglion and brainstem. The Journal of Physiology. 590, 2391-2408 (2012).
- Milo, M., et al. Genomic analysis of the function of the transcription factor gata3 during development of the mammalian inner ear. PloS One. 4, e7144 (2009).
- Fritzsch, B., Eberl, D. F., Beisel, K. W. The role of bHLH genes in ear development and evolution: revisiting a 10-year-old hypothesis. Cellular and Molecular Life Sciences : CMLS. 67, 3089-3099 (2010).
- Jahan, I., Kersigo, J., Pan, N., Fritzsch, B. Neurod1 regulates survival and formation of connections in mouse ear and brain. Cell and Tissue Research. 341, 95-110 (2010).
- Huang, E. J., et al. Brn3a is a transcriptional regulator of soma size, target field innervation and axon pathfinding of inner ear sensory neurons. Development. 128, 2421-2432 (2001).
- Jones, J. M., Warchol, M. E. Expression of the Gata3 transcription factor in the acoustic ganglion of the developing avian inner ear. The Journal of Comparative Neurology. 516, 507-518 (2009).
- Lu, C. C., Appler, J. M., Houseman, E. A., Goodrich, L. V. Developmental profiling of spiral ganglion neurons reveals insights into auditory circuit assembly. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 31, 10903-10918 (2011).
