Summary
Nous décrivons ici une technique de microdissection suivie par l'injection de colorant fluorescent dans le ganglion acoustique des embryons de poulet au début de traçage sélective des fibres axonales auditives dans le nerf et du cerveau postérieur.
Abstract
Le poussin embryonnaire est un modèle largement utilisé pour l'étude des périphériques et centraux projections des cellules ganglionnaires. Dans le système auditif, marquage sélectif des axones du nerf auditif dans VIIIe crânienne améliorerait l'étude du développement central circuit auditif. Cette approche est difficile en raison de multiples organes sensoriels de l'oreille interne contribuer à la VIIIe nerf 1. De plus, des marqueurs qui distinguent de manière fiable contre les groupes auditif vestibulaires des axones dans le nerf VIII aviaire doivent encore être identifiés. Voies auditives et vestibulaires peuvent pas être distinguées fonctionnellement dans les embryons précoces, comme sensorielles-réponses évoquées ne sont pas présents avant que les circuits sont formés. Idéalement saillie axones VIIIe ont été tracées dans certaines études, mais auditives axone étiquetage a été accompagnée par l'étiquetage des autres composants nerveuses VIIIe 2,3. Ici, nous décrivons une méthode de traçage antérograde du ganglion acoustique de façon sélective labeaxones auditives l sein du VIIIe nerf développement. Tout d'abord, après dissection partielle de la région céphalique antérieure d'un embryon de poulet 8-jour immergé dans le liquide céphalorachidien artificiel oxygéné, le canal cochléaire est identifié par des repères anatomiques. Ensuite, une micropipette de verre fine tiré est positionnée pour injecter une petite quantité de rhodamine dextrane aminé dans la région de canal adjacent et profonde, où les cellules ganglionnaires acoustiques sont situés. Dans les trente minutes qui suivent l'injection, les axones auditives sont tracées de manière centrale dans le cerveau postérieur et peuvent ensuite être visualisées après une préparation histologique. Cette méthode fournit un outil utile pour les études sur le développement de la formation auditive périphérique circuit central.
Protocol
1. Préparer les outils de dissection et réactifs suivants
- Liquide céphalo-rachidien artificiel (ACSF, 130 mM NaCl, 3 mM de KCl, 1,2 mM KH 2 PO 4, 20 mM NaHCO 3, 3 mM HEPES, 10 mM de glucose, 2 mM de CaCl2, 1,3 mM MgSO 4) perfusion continue avec 95% 2/5% de CO 2 à la température ambiante. Pour la perfusion, remplir au 2/3 de 500 ml à large ouverture Nalgene pot avec un trou percé dans le couvercle. Réservoir sera fixé par une tubulure à une tige de verre barboteur, qui pénètre dans la aCSF à travers le trou dans le couvercle du bocal. Régler la pression afin d'obtenir un flux constant de bulles qui atteignent environ 1/3 du liquide, mais ne sont pas suffisamment puissants pour provoquer des éclaboussures au-dessus de la jante. Submerger 5 ml flacons de verre (jusqu'à 6) dans le pot Nalgene pour séparer les échantillons individuels les uns des autres et de la turbulence de l'écoulement de gaz. ACSF doit être oxygéné pendant au moins 20 min avant l'une incubation de tissus.
- Petit plat dissection de silicone (35 x 10 mmPetri mm revêtu en utilisant Sylgard Elastomere Kit) avec deux broches de dissection placés en polystyrène hexagonale petite (47 mm en bas) pèsent bateau.
- Deux pinces à pointe fine, une pointe recourbée-pinces, un bécher de 50 ml, et un récipient pour les déchets de tissu.
- Tiré de verre micropipette (1,2 OD / 0,9 ID) rompu à environ 20-50 um d'ouverture à l'extrémité et rempli avec de la rhodamine dextrane aminé (RDA, MW = 3.000, Invitrogen) dans une solution de 6,25% avec 0,4% de Triton X-100 dans du PBS . Fixer par un tube fin pour picospritzer et stabiliser à micromanipulateur.
2. Micro-dissection pour révéler Papille basilaire à 4,5 E8
- Avec des pinces courbes, couper E8 embryon juste en dessous du tronc cérébral, en plaçant directement sur la tête de dissection plat enduit de silicone à l'intérieur de peser bateau.
- Utilisant des broches de dissection, positionner la tête avec une vue ventrale afin de l'oreille sur le côté de l'intérêt est légèrement visible, la tête légèrement inclinée sur le dos et pointant 10-30 degrés loin de CEnter (figure 2A). Immédiatement fixer la tête avec des épingles. Si bilatérale traçage est désiré, un centre de la tête à 0 degrés, ou une vue plein ventrale afin que les deux côtés peuvent être consultées. De même, pour une injection du côté gauche, fixer la tête de -10 à -30 degrés à partir du centre de sorte que le côté gauche est accessible.
- En utilisant le bécher de 50 ml, 30 ml de transférer aCSF oxygéné dans le plat, entièrement immerger le tissu.
- Saisissez doucement vers le bas et le zeste de la mâchoire inférieure en utilisant une pince fine pointe, puis retirez la paupière inférieure sur le côté de l'intérêt.
- Retirez le tissu vasculaire sus-jacente, y compris tous les palais restant et l'œsophage. Ces tissus mous devrait décoller révélant la surface lisse de développer chondrocrâne avec les artères vertébrales distinctifs à sa surface. À ce stade, la caractéristique masse blanche otoconial doit être visible.
- Disséquer soigneusement la peau autour du conduit auditif externe, le cartilage de l'articulation de la mâchoire et l'oreille moyenne, tout en laissant l'enner l'oreille intacte. Utilisez la pince pour couper délicatement ces structures cartilagineuses.
- Retirer artères vertébrales et l'accumulation de sang à l'aide d'un léger mouvement de balayage avec les extrémités de la pince fine. Le sang peut obscurcir vue et la coagulation peut boucher l'ouverture pipette d'injection.
- Le canal cochléaire avec épithélium sensoriel adjacente (papille basilaire) et le ganglion acoustique se trouve directement sous le chondrocrâne 6 et peut être visualisée comme une forme allongée en forme de doigt saillie s'étendant à partir de l'oreille interne ventralement, avec la pointe la plus distale (apex) près de la partie antérieure médiane 5. Il peut y avoir une petite accumulation de sang (rouge) de la dissection et / ou des calcifications otolithiques (blanc) à l'apex de la cochlée conduit (figure 2B) qui peuvent aider à visualiser. Au sommet se trouve la macula lagenar, un patch sensorielle pensé pour être de la fonction vestibulaire 7,8.
3. Étiquetage sélective des fibres NC VIII auditif
- Abaissez lentement la micropipette à première ponction du crâne. Cette région crânienne est plus mince que les zones environnantes et nécessite moins de force pour pénétrer. La micropipette devrait maintenant être à l'intérieur du canal cochléaire. En option: une petite injection de colorant de traçage peut être faite ici pour aider à la visualisation de la papille basilaire.
- Sans avoir à repositionner la micropipette, continuer à baisser jusqu'à ce qu'il seulement à l'atteinte de la frontière profondeur du canal cochléaire (Figure 1). Effectuer une injection ici et répéter dans de multiples régions le long de la longueur de la papille basilaire (figures 2C, 2D), à l'exclusion de la pointe la plus proximale où le lagena vestibulaire est situé. Avec le picospritzer mis entre 10-30 psi, plusieurs injections sont faites. Le volume de fluide injecté de colorant varie, et dépend du degré de marquage souhaitée. Chaque injection doit se traduire par un colorant fluorescent-laBeled place d'environ 200 à 400 um de diamètre (figure 2D).
- Une fois l'injection terminée, utilisez une pince pour sectionner l'échantillon au-dessus du tronc cérébral et d'utiliser une pipette de transfert pour placer la partie caudale dans un petit pot dans le conteneur de aCSF continuellement perfusés avec 95% O 2/5% de CO 2.
- Pour chaque embryon, 20-30 min pour permettre le transfert de colorant, selon la distance du centre de traçage souhaitée.
- Éliminer les tissus et préparer pour la coupe histologique. Dans l'exemple présenté ici, le tissu est immergé dans du paraformaldéhyde à 4% (dans du PBS 1X) pendant une nuit, le saccharose 30% (dans du PBS 1X) pendant une nuit.
4. La contre et analyse
- La contre est utile pour aider à orienter l'observateur de la localisation anatomique ainsi que d'identifier les régions d'intérêt particulier. Une contre-coloration efficace dans cette préparation est immunomarquage neurofilaments (figures 1, 3b, 3e), où L vivementAbel axones et permet de délimitation des voies axonales dans le SNC.
- L'analyse doit être effectuée dans toute la région étiqueté, comme les saillies peuvent s'étendre sur plusieurs centaines de microns ou plus long de l'axe rostro-caudal. Quelques exemples d'analyses de base sont les suivants: taux d'erreur de ciblage, le calendrier et / ou des changements dans la divergence des modèles de projections. Axones RDA-étiquetés sont visualisées dans le système nerveux périphérique et central à haute résolution (figures 3A, 3D).
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Representative Results
Les composants du nerf VIII et l'anatomie du nerf lui-même sont complexes et alambiquées (figures 1, 3). Par sélectivement le traçage des fibres provenant de cellules ganglionnaires acoustiques, les segments du nerf VIII ainsi que les afférences auditives primaires dans le tronc cérébral peuvent être tracées et proprement distinguent de leurs homologues vestibulaires (Figures 2, 3). De même, cette technique pourrait être utilisée pour étudier les projections périphériques des cellules ganglionnaires acoustiques (figure 3G), ou modifiés pour étudier les projections provenant de différents organes vestibulaires. Parce que les axones sont proprement tracée sur toute leur longueur, des analyses quantitatives précises peuvent être effectuées auditive distinction entre les projections vestibulaires au cours du développement, y compris un timing précis et les modes d'innervation initial, taux d'erreur de ciblage, etc En outre, contrairement à l'approche précédente de l'étiquetage fibres auditives, cette approche est performed sur la non-fixe, tissu vivant et peut donc être utilisé simultanément avec d'autres expérimentation in vitro.
Bien que cette technique est adaptée pour les embryons de E6-E9, les meilleurs résultats lorsque débutera à E8 axones auditives ont innervé leurs principaux objectifs centraux 3. En revanche, les projections vestibulaires arrivent dans le tronc cérébral antérieur 9,10 et donc servirait de meilleurs candidats pour le traçage plus tôt, bien que techniquement difficile en raison de la petite taille et de l'immaturité relative de l'appareil vestibulaire à cet âge. Des coupes histologiques devraient être examinés pour confirmer l'emplacement de l'injection de colorant, comme la région apicale plus de la papille basilaire contient un petit patch sensorielle pensé pour être de la fonction vestibulaire et s'ils sont étiquetés pourraient contaminer les résultats.
Une fois que l'enquêteur est familier avec l'anatomie, trois des problèmes les plus fréquemment rencontrés sont les suivants:
- Le cochléaire duct est rempli de traçage colorant, mais axones des cellules ganglionnaires ne sont pas étiquetés. Ce problème indique probablement que l'injection n'a pas été réalisée à la profondeur cochléaire conduit, où les cellules ganglionnaires et des fibres nerveuses de résidence. Ce problème peut être corrigé en veillant à ce que les piqûres micropipette première injection chondrocrâne, est ensuite doucement progressé de façon juste ponction par l'autre côté du canal. Alternativement, la pipette d'injection peut avoir été correctement positionné, mais livré des quantités insuffisantes de colorant. L'augmentation de la pression d'injection ou le nombre d'injections peut également résoudre ce problème.
- Le nerf est sectionné par inadvertance à la suite de traction excessive sur le labyrinthe cartilagineuse lors de la dissection. Cette difficulté peut être évitée en utilisant des techniques de dissection fine et de dissection limitée de l'oreille moyenne.
- L'injection est trop vaste et étiquette par inadvertance d'autres cellules ganglionnaires sensoriels ou des fibres nerveuses provenant de composants autres. Thest problème peut être minimisé par l'optimisation des protocoles d'injection, et peut nécessiter de réduire la pression d'injection ou le nombre d'impulsions, ou le déplacement de l'emplacement des injections.
Deux exemples d'analyses possibles sont les suivantes:
- Divergence des modèles de projection: détermine l'étendue des axones marqués le long d'un axe particulier et comment ils pourraient être affectés expérimentation suivante. Rostrocaudal divergence peut être décrit comme suit:
(Sections contenant les axones Nombre étiquetés) x (épaisseur de chaque section) Cette mesure peut être corrigée pour la mesure de l'étiquette colorant en proportion de la papille basilaire, ou dans les tissus contre-coloration, la proportion des axones VIIIe étiquetés. Il s'agit d'un outil utile pour analyser les projections topographiques, comme les axones marqués peuvent être proprement attribués à leurs champs terminaux dans le cerveau postérieur. Pour les mesures de tonotopie, les injections de colorant devrait être limitée à la région d'intérêt le long du basblable papille.
- Des erreurs de ciblage: détermine la fréquence des axones mistargeted pour chaque région prédéterminée du tissu analysé (peut-être par section, par l'embryon, etc.) Peut entraîner des perturbations dans les axones suite à une trajectoire de projection anormale ou se terminant dans une région inappropriée. Pour quantifier les erreurs, les chiffres doivent être normalisées pour tenir compte des différences dans les quantités d'injection entre les embryons. Les petites injections sont plus susceptibles de se traduire par la capacité de marquer des axones isolés. Une analyse des erreurs de base ciblage peut être décrit comme suit:
Figure 1. Coupe coronale de E6 tronc cérébral pour la simplification desganglions acoustique bilatérale intacte. Schématisation pipette rouge illustre le ciblage précis des cellules ganglionnaires acoustiques à partir d'un point d'entrée dorsolatéral. Les articles sont immunomarquées anti-neurofilaments de mettre en évidence les projections axonales. Organes vestibulaires sont rostrale des articles présentés. Région de l'injection RDA pour la fibre auditive sélective traçage démontré avec l'illustration de la pipette rouge. VIII = nerf vestibulo-cochléaire, AG = ganglion acoustique, VG = ganglion vestibulaire. Dorsale est en place. Barre d'échelle = 300 um.
Figure 2. Microdissection et l'injection de la région cible. (A) la position appropriée de l'embryon sur le plat de dissection, vue ventrale, la tête inclinée sur le dos et se tourna légèrement sur le côté pour permettre un meilleur accès sur le côté droit. E droitar est représenté et sous-jacente papille basilaire est indiquée par une ligne pointillée. Arrowhead (A) et (B) illustre la position initiale de la pipette d'insertion (B) Après dissection, une masse blanche otoconial est visible, la démarcation de la frontière apicale de la papille basilaire (flèche). (C, D) Première injection devrait fournir une aperçu du canal cochléaire. (D) injections ultérieures doivent être faites juste profond de la papille basilaire et conduit cochléaire dans la région ganglion acoustique. Fluorescence RDA est utile dans la perception de profondeur d'injection et améliorer chaque injection devrait créer un endroit colorant fluorescent marqué d'environ 200 à 400 um de diamètre comme on le voit ici. Barre d'échelle = 2 mm.
Faigure 3. Des images représentatives de la fibre auditive sélective traçage dans un embryon E8. (AC) de faible puissance et (DG) de forte puissance 25 pm coupes coronales recueillies à partir du même embryon à des plans différents. (A) axones RDA marqués peuvent être tracées à partir du site d'injection (flèche ), par l'intermédiaire du nerf crânien (flèche) et vers le bas en direction des cibles principales des noyaux auditifs (double flèche). (B) immunomarquage avec des reflets d'anticorps anti-neurofilaments toutes les projections axonales et les fibres RDA-tracées à partir de (A) sont inclus dans la projection auditive voie. Superposition de séparé (A) et (B) canaux indiqués comme une couleur fusionner (C). (DF) image haute puissance de l'embryon même à une position plus caudale montre (A) haute résolution de fibres au niveau du point d'entrée du nerf ( flèche) et le long de l'allée centrale (double flèche). (E) </ Strong> Neurofilament tache de tous les axones du SNP permet la démarcation de-CNS ainsi que auditive putatif contre les projections vestibulaires. Ap et Vp indiquer auditif respectif et composants vestibulaire périphérique au point d'entrée du nerf, alors que Ac et Vc indiquer auditif respectif et projections vestibulaires centraux au point d'entrée du nerf. Superposition de séparé (D) et (E) canaux indiqués comme une couleur fusionner (F). (G) L'examen histologique du ganglion acoustique révèle l'emplacement de cellules ganglionnaires marqués acoustiques de l'(traçage montre (AF) et leurs projections périphériques astérisque) sont tracées rétrograde de la papille basilaire. (H) Illustration d'une voie de 700 um traçage prévu avec auditive spécifique VIII étiquetage à E8. Au site d'injection (cercle rouge) est caudale au point d'entrée du nerf, et les projections centrales voyager rostrale et caudale fois dans le cerveau postérieur. Vp = gilet périphériqueibular, Ap = périphérique auditif, Vc = vestibulaire central, Ac = auditif central, AG = ganglion acoustique, BP = basilaire papille, LM = lagenar macula, SVG = ganglion vestibulaire supérieur, IVG = ganglion vestibulaire inférieur. Barre d'échelle = 300 um pour AC, 100 um pour DF, 100 um à 500 um G et H dans.
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Discussion
Les études sur le développement précoce du nerf VIII ont été limitées, en partie à cause de la difficulté d'identifier les axones embryonnaires provenant de ganglions distincts multiples. Plusieurs études ont exploré les signaux moléculaires directeurs auditif et vestibulaire cellule sensorielle et destins des cellules ganglionnaires au cours du développement précoce, 5,11,12, mais les processus de régulation innervation centrale n'ont pas encore été déterminés. Rapports des acoustiques projections des cellules ganglionnaires périphériques généralement décrire les processus à l'épithélium sensoriel 13-15, alors on en sait moins sur les processus centraux en saillie à noyaux primaires. Etudes de manière centralisée saillie subdivisions VIII cours de l'embryogenèse sont souvent électrophysiologique, tels que les enregistrements optiques dans le cerveau postérieur de poulet embryonnaire 16 ou imagerie calcique dans une tranche de tissus de mammifères 17, mais ne peut pas être effectué avant l'achèvement des circuits neuronaux. L'utilisation de marqueurs immunologiques de l'étiquetteaxones du nerf auditif dans chick VIIIe n'est pas possible actuellement. Alors que les groupes distincts de facteurs de transcription ont été identifiés en corrélation avec auditive contre les neurones vestibulaires 18-23, l'expression de ces facteurs est exclu de l'axone. Chez les souris, les différences ont été trouvées entre les ganglions de spirale et les ganglions vestibulaires dans l'expression des gènes, y compris certains candidats prometteurs qui pourraient différencier la croissance axonale parmi modalités 23. Une étude plus approfondie de ces produits de gènes peuvent produire des outils importants pour les études à la fois mammifères et d'oiseaux. Avec les méthodes décrites ici, fibres auditives dans les tissus vivants embryonnaire avec un circuit auditif intact peut être sélectivement tracé de leurs objectifs centraux.
L'embryon de poulet est un système de vertébrés particulièrement utile pour les biologistes du développement et est capable de surmonter certaines des limitations rencontrées dans les systèmes mammaliens. Règlement des motifs oreille interne et de la morphogenèse précoce dansoiseaux montre une similarité remarquable pour les mammifères 1,12, tandis que les embryons de poulet sont plus grands et plus facilement accessibles que les embryons de rongeurs à des stades précoces lorsque le système auditif périphérique est formé. La méthode présentée ici pour le traçage sélective des fibres auditives facilite l'expérimentation précoce sur les projections centrales de l'oreille intérieure développement.
Nous avons développé ce protocole dans un effort pour identifier de manière différentielle des projections auditives centrales du nerf VIII, mais aussi il peut être modifié pour marquer sélectivement les fibres provenant d'autres organes sensoriels de l'oreille interne. Contrairement aux méthodes décrites précédemment, cette procédure est effectuée sur les tissus vivants avec tout le circuit intact. Une méthode similaire a été effectuée pour décrire le calendrier des VIII auditif innervation afférente cours de l'embryogenèse aviaire, mais fibres vestibulaires ont été, par inadvertance, marqué 3 Ici nous donnons une méthode pour identifier clairement région ou.Igin résolution et la résiliation, ainsi que de hautes seule fibre de sélection centrale en saillie afférences auditives cours de l'embryogenèse chez les vertébrés.
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Disclosures
Pas de conflit d'intérêts sont déclarés.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier le Dr Candace Hsieh des suggestions et de l'aide des techniques d'imagerie et Dr Doris Wu d'expertise sur l'anatomie poussin oreille interne au cours de l'embryogenèse précoce. Ce travail a été soutenu par la NSF IOS-0642346, NIH T32-DC010775, NIH T32-GM008620, NIH R01-DC010796, et le DOE GAANN P200A120165.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polystyrene Weigh Dish | Fisher Scientific | 02-202-101 | |
| Petri Dish, 35 X 10 mm | Fisher Scientific | 50820644 | Use to make silicone dissection dish |
| Sylgard Silicone Elastomer Kit | World Precision Instruments | SYLG184 | Coat Petri to make dissection dish |
| Dissection Pins | Various | Holds embryo in place during dissection | |
| NaCL | Various | part of aCSF recipe | |
| KCl | Various | part of aCSF recipe | |
| KH2PO4 | Various | part of aCSF recipe | |
| NaHCO3 | Various | part of aCSF recipe | |
| Glucose | Various | part of aCSF recipe | |
| CaCl2 | Various | part of aCSF recipe | |
| MgSO4 | Various | part of aCSF recipe | |
| Container for aCSF. Suggest translucent wide-mouth Nalgene jar, 500 ml (16 oz) with lid. | CPLabSafety | QP-PLC-03717 | Drill hole opening in top of lid for glass bubling stem to penetrate liquid |
| Empty 5 ml glass vial or comparable transparent vial | American Pharmaceutical Partners, Inc | 6332300105 | Use during aCSF incubation to keep samples separate from each other and from the bubbling stream |
| Tank of carbogen (95%O2 / 5%CO2) connected by tubing to bubbler | Various | Attach by tubing to glass stem bubbler for infusion into aCSF | |
| Glass stem bubbler | Various | To infuse carbogen into aCSF | |
| Curved-tip forceps | World Precision Instruments | 501008 | To remove embryo head from egg |
| Two fine-tip forceps | World Precision Instruments | 501985 | For micro-dissection |
| 50 ml Beaker | various | ||
| Rhodamine Dextran Amine (RDA) | Invitrogen | various | Fluorescent axon tracer |
| Triton X-100 | ICN Biomedicals | ||
| Phosphate Buffered Saline, (1X PBS) | Various | Standard lab reagent | |
| Thin Wall Glass Capillaries, 1.2 OD, .9 ID 4" (100 mm) length | World Precision Instruments | TW120F-4 | Load with RDA. Each capillary makes two glass micropipettes |
| Needle / Pipette puller | David Kopf Instruments | Model 720 | Settings used: Heat 16.4, Solenoid 2.2 |
| Picospritzer | Parker Instrumentation | various | Attach by fine tubing to glass micropipette |
| Micromanipulator | Narishige | various | |
| Dissection microscope with fluorescence | Various | ||
| 4% Paraformaldehyde | Various | Standard lab reagent | |
| anti-Neurofilament antibody, optional | Millipore | AB1991 | Follow histological protocol recommended by manufacturer |
| Cryostat and associated materials for sectioning | Leica | various | |
| Epifluorescent microscope for imaging | Zeiss, various |
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