Summary
Een blessure paradigma met behulp van de Drosophila larven ventrale zenuw koord aan het centrale zenuwstelsel regeneratie en reparatie te onderzoeken wordt beschreven. Stekende gevolgd door laser scanning confocale microscopie in time-lapse en vaste monsters, gecombineerd met kwantitatieve analyse met doelgericht ontwikkelde software en genetica, worden gebruikt om de moleculaire mechanismen van CNS regeneratie en reparatie onderzoeken.
Abstract
Een experimentele methode ontwikkeld om de cellulaire respons te onderzoeken centrale zenuwstelsel (CNS) letsels met de fruitvlieg Drosophila. Inzicht in herstel en regeneratie bij dieren is een belangrijke vraag in de biologie. De beschadigde menselijke CNS niet regenereren, en de manier waarop de regeneratie te bevorderen is een van de belangrijkste doelen van medische neurowetenschap. De krachtige genetische toolkit van Drosophila kan worden gebruikt om het probleem van CNS regeneratie pakken.
Een laesie aan het CZS ventrale zenuw koord (VNC, wat overeenkomt met de gewervelde ruggenmerg) wordt handmatig aangebracht met een wolfraam naald. De VNC kan vervolgens gefilmd in time-lapse met laser scanning confocale microscopie tot 24 uur om de ontwikkeling van de lesie in de tijd te volgen. Als alternatief kan worden gekweekt, vervolgens gefixeerd en gekleurd met immunofluorescentie tot neuron en gliacellen te visualiseren met confocale microscopie. Met behulp van geschikte markers, change in celmorfologie en celtoestand als gevolg van letsel kan worden gevisualiseerd. Met ImageJ en doelbewust ontwikkeld plug-ins, kunnen kwantitatieve en statistische analyses worden uitgevoerd om veranderingen in de wond grootte te meten in de tijd en de effecten van letsel bij celproliferatie en celdood. Deze werkwijzen maken de analyse van grote steekproeven. Zij kunnen gecombineerd worden met de krachtige genetica van Drosophila om de moleculaire mechanismen van CNS regeneratie en reparatie onderzoeken.
Introduction
Regeneratie bij dieren blijkt dat cellen detecteren wanneer organisme groei volgorde en geheel hoe structurele integriteit van een organisme wordt bereikt en gehandhaafd. Inzicht in deze mysterieuze vermogens van cellen is van groot belang in de biologie. Het bevorderen van de regeneratie is een van de centrale doelstellingen voor medische neurowetenschap. Bij mensen is de beschadigde centrale zenuwstelsel (CNS) niet regenereren. Knaagdier modellen van dwarslaesie worden gebruikt om te begrijpen hoe cellen reageren op letsel. Echter, ethische overwegingen, hoge kosten en de trage levenscyclus van de dieren beperken vooruitgang.
De fruitvlieg Drosophila is een veel gebruikt model organisme in de ontwikkelingsbiologie en de neurowetenschappen. Dankzij de krachtige genetische tools en korte levenscyclus heeft Drosophila bij herhaling geleid tot de ontdekking van gen functies en gen-netwerken die van belang zijn voor het begrijpen van de mens en ziekte. Er is overvloedig bewijs van evolutionaire conbehoud van gen-functie van vliegen tot mensen.
De afgelopen jaren hebben verschillende paradigma's voor het zenuwstelsel letsel vastgesteld in Drosophila. Sommige bestaan uit beschadiging van perifere zenuwen die langs de vleugel of axotomie van de perifere zenuwen, met inbegrip van sensorische 1 en motorische axonen 2. De perifere en centrale zenuwstelsels verschillen in veel opzichten, en het is bekend dat veel dieren in het perifere zenuwstelsel kan regenereren dat het CNS niet. Dus om CNS regeneratie directe schade begrijpen het CNS geschikter. Steken letsel met een naald met succes is toegepast op de Drosophila volwassen hersenen om de reactie op letsel 3,4 onderzoeken. Met behulp van een andere benadering, Ayaz et al.. Doorgesneden CNS axonen in gekweekte volwassen hersenen met een piëzo kracht microdissector, en geanalyseerd hun regeneratie gedurende 4 dagen 5. Het voordeel van deze latere experimentele set ups is dat ze zich richten op de hersenen, die ongetwijfeld van groot belang. Het nadeel is dat de hersenen is veel complexer dan de VNC, die alleen betrekking motorische en sensorische controle. Werken aan de volwassen hersenen is ook meer tijd in beslag. De larve is klaar voor experimenten in 4 dagen, terwijl het duurt ongeveer 10 dagen voor volwassen verpopping, en dan nog 5 dagen voor hun rijping. De volwassen hersenen is ook moeilijk te hanteren, omdat het ingekapseld in dikke cuticula, die moeilijk te verwijderen. De VNC heeft verder aantrekking van het functioneel gelijkwaardig aan de gewervelde ruggenmerg.
De Drosophila larve wordt veel gebruikt als modelorganisme for Neuroscience 6-9. Hoewel strikt genomen de larve in een ontwikkelingsfase kan ook worden beschouwd als een volledig functionele dier. De larve heeft voortbeweging, meerdere zintuigen waaronder reukzin, smaak en nociceptie, en leren en geheugen. Dus de larven VNC wzo gekozen als het ideale model voor CNS letsel.
Larvale en popstadium VNCs worden ontleed en gekweekt in schotel, behoud cellulaire integriteit tot 24 hr 10. Dit suggereerde dat schade kan worden toegepast op de VNC, die vervolgens kan in time-lapse worden opgenomen gedurende deze periode of gekweekt en vastgesteld op elk gewenst tijdstip gedurende deze periode.
Hier presenteren we een experimentele paradigma voor CNS letsel met behulp van de Drosophila larven VNC. De VNC wordt eerst ontleed uit de larve, en steken letsel wordt handmatig aangebracht met een wolfraam naald. De VNC wordt vervolgens op een glazen bodem dekglaasje en gefilmd met time-lapse laser scanning confocale microscopie. Als alternatief kan de VNCs worden gekweekt gedurende een gewenste tijd en cellulaire effecten van schade kan worden geanalyseerd vaste specimens via immunokleuringen en confocale microscopie. De wond kan worden gemeten, en kwantitatieve analyse van cel number (celproliferatie en celdood) kan worden uitgevoerd met opzet ontwikkelde software. Grote steekproeven kan gemakkelijk worden behandeld, waardoor statistisch gevalideerde resultaten. Deze methoden zijn met succes in combinatie met de krachtige genetica van Drosophila een genetische netwerk dat de gliale regeneratieve respons op CNS schade 11 ontdekken.
Protocol
1. Het verzamelen van Geënsceneerde Larven
- Plaats 15 vrouwelijke en 15 mannelijke volwassen vliegen in een cilindrische perspex kooi om eieren te leggen op een petrischaal met agar en druivensap aangevuld met een kleine lepel van gist pasta voor 3 uur bij 25 ° C. Wijzig de plaat 3-4 keer per dag, en gooi de eerste plaat (dwz van de O / N ei-lay). Gooi ook de platen vanaf de eerste dag. Vanaf de tweede dag, houden de platen met eieren bij 25 ° C. Na 7 dagen van het verzamelen van eieren, te beginnen met een nieuwe set-up van ouders vliegen.
- Na ongeveer 24 uur, larven uit de eieren. Door het inhaken larven met een kwast of verdund met een pincet, transfer 35 larven van de druif agar aan een houder die standaard fly voedsel (10 ml) (Figuur 1A).
- Houd de injectieflacons met larven gedurende 3 dagen (96 uur na de eileg, AEL) bij 25 ° C.
2. Dissectie van larven ventrale zenuw Snoeren voor Cultuur
- Reinig wordennch en handen met 70% ethanol. Geniet van 4 vlekken blokken, 2 paar pincet en een naald met 70% ethanol, en laat drogen aan de lucht.
- Bereid 4 kleuring blokken met de volgende media: een met gedestilleerd water (DW) te reinigen en te bundelen schoongemaakt larven, een tweede met 2 ml Shield en Sang M3 insecten medium met 1% penicilline en streptomycine, Ecdysone-vrij (M3 PS medium) aan de larven ontleden en een derde met 2 ml M3 PS medium te bundelen ontleed ventrale zenuw koorden (VNCs) en een vierde met 2 ml M3 PS medium te steken de VNCs. Alle reagentia moeten worden voorverwarmd tot kamertemperatuur.
- Voeg water toe aan de injectieflacon met 96 uur AEL larven. Vervolgens met een spatel uitgespreid voedsel met larven van de flacon op een natte papieren handdoek. Breng 10 larven naar een kleuring blok met DW te wassen het voedsel. Vervang DW 6 keer. Vervang vervolgens met M3 PS medium.
- Transfereren van de larven om vlekken blok met 2 ml M3 PS medium.
- Onder een ontleedmicroscoop, dizorgvuldig ssect een schaal hersenen met behulp van standaard werkwijzen 12, maar tot weefselbeschadiging te minimaliseren, extra voorzichtig te werk gaat als volgt. Plaats de larve dorsale kant naar boven, en houd de dorsale zijde op een derde van het voorste uiteinde met 2 paar pincet (een in elke hand). Terwijl die de voorste gedeelte weg te trekken het achterste uiteinde met de tang, en scheur de opperhuid. De hersenen en de VNC moet zichtbaar vanaf de achterste rand van de voorste helft. Zorgvuldig isoleren van de hersenen en VNC complex door het verwijderen van het vet lichaam, darm en epidermis. Wanneer de VNCs te veel beschadigd is, zal de VNCs zelfs ontaarden geheel of gedeeltelijk, zonder steken letsel. Houd rekening met de volgende punten:
- Trek niet aan of scheur de imaginaire schijven en perifere zenuwen in de borst VNC omdat dit tot beschadiging van de VNC. Om de perifere zenuwen te snijden, houd de perifere zenuwen met twee paar tang dicht in de buurt van elkaar, en trek vervolgens de zenuwen met de vooreekhoorntjesbrood. Imaginal schijven en monddelen kan worden overgelaten aan de VNC.
- Laat de ring wartel en lymfeklier aan de hersenen.
- Snij de darm op het punt het dichtst bij de hersenen, waar weinig voedsel is opgenomen.
- Door gebruik te maken van een P20 Pipetman met de punt afgesneden en verbreed een beetje, de overdracht van de VNC om een kleuring blok met verse M3 PS medium. Alvorens de VNC eerste pipet omhoog en omlaag het medium gebruikt voor de dissectie om de VNC te plakken aan de tip.
3. Stabbing Letsel aan de Drosophila larven VNC
In dit gedeelte wordt beschreven hoe u steken letsel uit te voeren om de VNCs, en gestoken-VNCs voor te bereiden op time-lapse analyse en immunokleuring. Post-steken kweekomstandigheden en de duur worden beschreven in paragraaf 5 (voor time-lapse analyse) en in hoofdstuk 6 (voor immunokleuring).
- Na pooling genoeg VNCs (4-5 voor time-lapseen meer dan 24 voor immunokleuring), overdracht een VNC om een schone vlekken blok met M3 PS.
- Plaats de VNC zodat de dorsale neuropile is gezien onder de dissectiemicroscoop (Figuur 1B). Dit is de meest natuurlijke oriëntatie voor VNCs te liggen wanneer het aan de optische kwabben.
- Stab handmatig met een wolfraam naald onder de dissectie microscoop, van de rugzijde nagenoeg haaks gericht en voor de helft van de abdominale VNC (Figuur 1B).
Neem bijzondere aandacht voor het volgende:
- Stab slechts een keer.
- Stab totdat de naald de bodem van het glas. Maar wees voorzichtig dat u de naald beschadigen.
- De stam van de naaldhouder moet het medium niet aan tijdens steken.
- De wond is niet zichtbaar onder de dissectie microscoop.
Opmerking: Stab-letsel niets degeneratie
De procedurekan leiden tot cellulaire degeneratie binnen de VNC onderscheiden van de steekpartij laesie. Degeneratie resulteert in gaten in de neuropile en soms gaten waargenomen in de cortex niet-gestoken specimens. Exemplaren met degeneratie die de neuropile of wijdverspreide degeneratie van invloed zijn ook de VNC oppervlak moet worden weggegooid. Degeneratie kan als volgt worden geïdentificeerd:
- Ruw oppervlak, met name op de laterale / ventrale deel van de thorax, op 22 uur van steken. In extreme gevallen, ziet de VNC staken.
- Gaten of vacuolen in de thoracale neuropile, die zichtbaar als gaten in achtergrondsignaal met fluorescentie immunokleuring.
4. Onderhoud van Naald en Forceps
- Regelmatig te controleren of de naald is scherp genoeg. De punt van de naald kan verbogen of stomp zijn na het gebruik van het voor een aantal experimenten. In dit geval, verscherpen de punt met behulp van een Arkansas steen of gelijkwaardig.
- De uiteinden van de tang moetvoldoen perfect. De tips kan beschadigd raken met het gebruik. In dit geval stelt de spuitkop een Arkansas stenen of equivalent.
5. Cultuur en Time-lapse-opname van Gestoken VNCs
G9 13 - - de axonale neuropile in de levende VNC een GFP eiwit trap lijn die alle axonen labelt visualiseren kan worden gebruikt, en alle gliacellen (behalve de middellijn glia) visualiseren gliale driver repoGAL4 kan worden gebruikt om de expressie UASdsRed S197Y 14 reporter. Door kruising G9 vliegt naar UASdsRedS197Y,, repoGAL4 vliegen, VNCs van de nakomelingen larven worden verkregen met groene axonen en rode gliacellen die kan worden opgenomen in levend weefsel.
- Na pooling vier-vijf VNCs, breng 1 VNC om een schone vlekken blok met 2 ml van M3 PS, en steek de abdominale helft van de VNC, zoals aangegeven in paragraaf 3.
- Breng de gestoken VNC om een Poly-L-lysine gecoate 3,5 mm met glazen bodem petrischaal met 1 ml van M3PS. Plaats de te VNCs dorsale zijde. Duw de VNC met behulp van de platte kant van een pincet om de VNC te houden aan de schotel.
- Zachtjes voeg 1 ml M3 PS 15% FBS waardoor de eindconcentratie van 7,5% FBS.
- Acquire beelden met behulp van laser scanning confocale microscopie. Scan de VNC, het verzamelen van een Z-sectie serie over de gehele dikte. We gebruikten een Leica SP2 omgekeerde confocale microscoop met een temperatuur gecontroleerde klimaatkamer. Een daarmee gelijk te confocale microscoop zou moeten werken, maar het kan nodig optimalisatie van de instellingen voor het scannen. De instellingen voor onze time-lapse confocale microscopie waren als volgt: Temperatuur van klimaatkamer: 25 ° C; 20X objectief met 4 keer zoom; scanmodus xyzt, met 512x512 pixel resolutie, z = 1 micrometer stappen en 1-uur of 2 - uur.
- De Leica SP2 confocale microscoop heeft een beperking in bestandsgrootte voor het scannen. Met deze instellingen kan acht-negen tijdstippen worden gescand. Metandere confocale microscopen, het moet mogelijk zijn om beeld stacks te verwerven voor langere tijd punten, dat wil zeggen over de spanwijdte van maximaal 24 uur.
6. Cultuur en immunokleuring van Gestoken en Vaste VNCs
- Bereid een 24-well weefselkweekplaat met 500 pi M3 PS 7,5% FBS per putje.
- Herhaal dissectie van meer dan 24 VNCs voor een 24-well weefselkweekplaat.
- Door het gebruik van de P20 Pipetman met de punt cut-off, over te dragen 12 niet-gestoken VNCs van het zwembad naar de cultuur schotel, met behulp van een VNC per putje.
- Stab de rest van VNCs in het zwembad zoals beschreven in paragraaf 3. Breng elke gestoken VNC om een goed stuk.
- Plaats de 24-well schaal in de 25 ° C incubator voor een gewenste duur afhankelijk van het experiment. Celintegriteit is ongewijzigd ten minste 24 uur.
- Na cultuur brengen de 12 VNCs in 250 pi 4% formaldehyde PEM in een 1,5 ml buis met de P20 Pipetman met de punt afgesneden. Vervolgens de fixative wordt zorgvuldig gepipetteerd uit, zorg ervoor dat u de VNCs beschadigen. Een kleine hoeveelheid fixeermiddel voldoende om de monsters te dekken blijven in elke buis. Vervolgens voeg verse fixatief, en schud er voorzichtig mee voor 50 min bij RT.
- Spoelen 2 maal met 0,3% Triton X PBS, en daarna wassen 2 maal gedurende 10 min met 0,3% Triton X PBS bij kamertemperatuur.
- Block VNCs door incubatie met 10% normaal geitenserum in 0,3% Triton X PBS gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. De monsters kunnen worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende ten minste een maand.
- Incubeer VNCs met primaire antilichamen voor meer dan 20 uur bij 4 ° C.
- Spoelen 2 maal met 0,3% Triton X PBS, vervolgens 3 keer wassen gedurende 10 minuten met 0,3% Triton X PBS bij kamertemperatuur.
- Incubeer VNCs met secundaire antilichamen voor meer dan 16 uur bij 4 ° C.
- Spoelen 2 maal met 0,3% Triton X PBS, vervolgens 3 keer wassen gedurende 10 minuten met 0,3% Triton X PBS bij kamertemperatuur RT (in het donker als met fluorescerende secundaire antilichamen).
- Vervangen PBS met 50% glycerol: 50% PBS minstens eenuur.
- Vervang met 80% glycerol: 20% PBS gedurende minstens een uur.
- Monteer een VNC in een venster gemaakt op 2 lagen cello-tape (ongeveer 0,06 mm) op een microscopie glasplaatje. Stel de oriëntatie, en plaats een dekglaasje (18x18 mm) op het raam. Twee VNCs kan worden gemonteerd op een slede met deze methode.
Met behulp van een verscheidenheid aan primaire antilichamen, om letsel verschillende cellulaire reacties kan worden geanalyseerd (bijvoorbeeld veranderingen in het aantal cellen en cel vorm).
7. Gegevens analyseren Met behulp van ImageJ en een bereik van Plugins
Als de VNC geen steken los degeneratie, moet het monster worden geteld in voor de analyse, ongeacht de grootte van het defect. Zoals steken met de hand gedaan, de grootte van het defect verschilt per keer. Dus is het belangrijk om statistisch analyseren het effect van steken, zoveel mogelijk.
- Wound maat opmeten. De grootte van de wond is een indicator voor reparatie 15.De stekende laesie is zichtbaar als verstoken van GFP expressie. Laesie-oppervlakte kan worden gemeten lapse data behulp van vrij verkrijgbare software ImageJ als volgt:
- Met behulp van ImageJ, opent een stapel confocale beelden van "File" menu, selecteer "Import" en van hieruit selecteer "Afbeelding sequentie". Dit zal de verzameling van afzonderlijke beelden in een stapel.
- Vervolgens wordt het 'stapelen', te veranderen in een "HyperStack" door te gaan naar "Image" menu, "HyperStack" te selecteren en selecteer vervolgens "Stapel op HyperStack".
- Stel de voxel grootte met behulp van "Eigenschappen" in "Beeld" menu. In data verkregen met de Leica SP2 confocale microscoop kan de voxelafmeting worden verkregen van de scanning-software en de metadata tekstbestand opgeslagen samen met beelden. Met onze instelling, zoals beschreven in hoofdstuk 3, pixelafmetingen zijn xy = 0,366211 micrometer en z = 0,99709 micrometer.
- Door het onderzoeken van alle segmenten in een keer punt, trek de maximale omtrek van de laesie met de polygoon-selectie-tool in de werkbalk. Dit is deRegion Of Interest (ROI).
- Voeg de ROI van de ROI manager door te gaan naar "Analyze" menu, scroll naar beneden en selecteer "Tools" en vervolgens, "ROI manager" en vervolgens op "add".
- Herhaal dit voor de hele tijd punten.
- Klik op de "Measure" knop in de ROI-manager om het gebied grootte van elke ROI te verkrijgen.
- Correctie van de VNC beweging tijdens time-lapse-opnamen. "Stackreg" en "Turboreg" plugins 16 (vanaf de ImageJ website http://rsbweb.nih.gov/ij/ ): deze plugins laten kleine steekproef bewegingen te corrigeren tijdens het time-lapse. Bouw een stapel met een gelijkwaardig vertegenwoordiger optische gedeelte door alle tijdstippen en toepassen van de plugins. Helpt hoe de laesie veranderingen zichtbaar tijd. De details over deze methoden en de handleiding zijn verkrijgbaar bij de onderzoeksgroep die deze plugins ontwikkeld. ( http://bigwww.epfl.ch / thevenaz / stackreg /).
- Automatisch tellen van gliacellen. "DeadEasy glia" plugin ( www.biosciences-labs.bham.ac.uk/hidalgo/Software.html ): dit is ontwikkeld om het aantal REPO-positieve gliacellen tellen mee in de Drosophila larven VNC en de verandering in de gliale onderzoeken aantal wordt veroorzaakt door steken letsel 17. De plug-in werkt nauwkeurig, met een fout van 0,1% false positives en 4,3% vals negatieven 17. Om deze plug-in, first label gebruik maken van alle glia (met uitzondering van de middellijn) in het monster met behulp van immunofluorescentie met anti-REPO antilichamen. Installeer vervolgens de plug-in in ImageJ, opent een stapel confocale beelden en uit te voeren plug-in. Telt gliacellen automatisch in ongeveer 30 seconden.
- Automatisch tellen van apoptotische cellen. "DeadEasy Caspase larven" plug-in ( www.biosciences-labs.bham.ac.uk/hidalgo/Software.html) 18: Deze werd ontwikkeld om het aantal cellen gelabeld met anti-gekliefde-Caspase3 tellen, en een nieuwe versie werd aangepast voor de larven VNCs. Stekende schade veroorzaakt een toename van geprogrammeerde celdood 11. Voor het gebruik van deze plug-in, first label apoptotische cellen in het monster met behulp van immunofluorescentie met anti-gekloofd-caspase-3 antilichamen. Installeer vervolgens de plug-in in ImageJ, opent een stapel confocale beelden en uit te voeren plug-in. Telt apoptotische cellen automatisch in ongeveer 30 seconden.
8. Reagentia
- Kweekmedium: Shield en Sang M3 insect medium, 7,5% foetaal runderserum, 1% penicilline en 1% streptomycine.
- 0,01% Poly-L-lysine in steriele DW.
- Fixatief: 4% formaldehyde, ultrazuiver in PEM (0,1 M buizen, 2 mM EGTA, 1 mM MgSO4) oplossing.
- Blokkerende oplossing voor immunokleuring: 10% normaal geitenserum in 0,3% Triton X PBS.
- Anti-Glutamine Synthetase2 antilichamen: 1:250 in blokkeeroplossing.
- Anti-GFP antilichamen 1:1000 in blokkerende oplossing.
- Anti-REPO antilichamen 1:250 in blokkeeroplossing.
- Anti-ELAV antilichamen 1:250 in blokkeeroplossing.
- Anti-gekloofd Caspase 3 antilichamen 1:1000 in blokkerende oplossing.
- Secundaire antilichamen 1:250 in blokkeeroplossing.
Representative Results
Hier laten we zien hoe te steken letsel uit te voeren om de Drosophila larven VNC en analyseren van de cellulaire reacties op letsel met behulp van time-lapse en immunokleuring confocale fluorescentie microscopie.
Voor time-lapse data, de laesie wordt gevisualiseerd als een GFP-negatieve gebied binnen de neuropile van specimens met het axonale G9 marker (figuur 2). Kort na steekpartij, kleine GFP-negatieve gebieden, die eruit zien als gaten of vacuolen, beginnen te verschijnen (Figuur 2A). Dergelijke GFP-negatieve gebieden algemeen tot vergroting ongeveer 6 tot 8 uur na steken (Figuur 2A). Vervolgens de GFP-negatieve gebieden krimpen en zelfs verdwijnen (Figuur 2B). Op 22 uur na steken, de oppervlakte van de wond algemeen kleiner dan de maximum gebied was 6 tot 8 uur na steken (figuren 2A, B). Ook de DsRed-negatieve gebied gliale processen neemt aanvankelijk ook, maar Shrinks met 22 uur na steken. Interessant vaak DsRed-positieve gliale processen vullen de GFP-negatieve gaten in de neuropile vóór de verdwijning (figuur 2C).
Met behulp van immunokleuring in vaste monsters, fijne gliale processen en hun reactie op letsel kan worden gevisualiseerd met een betere resolutie dan met time-lapse beelden. Dit kan bijvoorbeeld met de repoGAL4 gliale driver om de expressie van een membraan gebonden reporter (bijvoorbeeld UAS-mCD8GFP) in vliegen alle gliacellen (behalve de middellijn glia) visualiseren induceren. Dit kan ook worden gecombineerd met andere gliale markers, zoals anti-GS2, die neuropile-geassocieerde gliacellen (Figuren 3A, B) aanbrengt. Hier laten we zien dat, hoewel de ventrale zenuw koord gestoken van de dorsale zijde, stekende letsel resulteert in een deuk ventraal (figuur 3A, pijlpunten). Stekende lijkt ernstiger gevolgen hebben voor de neuropile en neuropile-geassocieerde gliacellen eeen oppervlak en gliacellen cortex (figuur 3B). Gliale processen lijken ongeorganiseerd in de neuropile, terwijl ze nog steeds behouden hun gaas achtige organisatie in de cortex. Oploopt, GS2-positieve celresten, die zich onderscheidt van normale cellen debris fragmenten veel kleiner en niet op een cellichaam. Hieruit blijkt beschadiging neuropile-geassocieerde gliacellen (Figuur 3B). Degenererende neuropile geassocieerde gliale cellen werden ook waargenomen door elektronenmicroscopie 15. Anti-gekloofd-caspase 3 + apoptose kleuring wordt waargenomen in neuropile-geassocieerde gliacellen 15, waaruit blijkt dat ze apoptose ondergaan na steekpartij letsel. Neuropile geassocieerde gliale cellen werd ook aangetoond dat neuronale puin fagocyteren 15 en GS2 + signaal kan de engulfment van apoptotische neuronen openbaren door gliale processen. Caspase-gekloofd + apoptotische cellen worden ook waargenomen in de cortex, althans een deel van die overeenkomen met Elav + neuronen ( Met vaste monsters en immunokleuring maakt ook kwantitatieve analyses van cellulaire reacties op letsel, zoals effecten in proliferatie en apoptose. Hiervoor maken we doelbewust ontwikkelde twee ImageJ plug-ins, DeadEasy Caspase Larve en DeadEasy Glia, om automatisch tellen van het aantal gliacellen en apoptotische cellen, respectievelijk. Ze zijn gevalideerd om te werken aan larvale VNCs en zijn zeer nauwkeurig. Met deze, is het mogelijk om ook verhoogde het aantal REPO-positieve gliacellen door steken schade op 22 uur (Figuur 4A) 15. Er is ook een toename in het aantal anti-gekliefde-caspase-3 apoptotische cellen door 6 uur post-stekende (Figuur 4B) 15. Een dergelijke stijging gliale proliferatie en apoptose in reactie op letsel in de Drosophila CNS doet denken aan de schade respons in de gewervelde CNS. Een cruciaal aspect van dit proprotocol is de kwaliteit van de VNC dissecties. Het is moeilijk om bij de dissectie of de VNCs beschadigd of niet in het proces. Het is belangrijk om bijzondere zorg te nemen om zachte dissecties uit te voeren. Echter slechte kwaliteit monsters onvermijdelijk worden geproduceerd, en het is noodzakelijk dat deze worden geïdentificeerd in latere stadia en weggegooid. In onze handen, VNC degeneratie verband lijkt te houden voor de schade, maar in plaats daarvan wordt veroorzaakt door ruwe dissectie. We hebben niet waargenomen een kritische omvang van de schade wond en analyseren we alle gewonden monsters die niet afgebroken. Wanneer VNCs hun integriteit behouden de VNC oppervlak neiging om te kijken glad en glanzend, en geen gaten in de neuropile waargenomen (Figuur 5A). Afbraak van VNCs kunnen worden herkend door 24 uur na dissectie van het ruwe oppervlak van de VNC ventrale en laterale gebieden (figuur 5B). Degradatie van de neuropile los te steken letsel kan zich ook voordoen, en het wordt erkend als neuropile holes in het achtergrondsignaal van immuun-specimens. Monsters van deze tekenen van degeneratie moet worden afgevoerd (figuur 5C). In onze handen, het slagingspercentage voor dissectie en letsel in intacte en gestoken controle (yw) vliegen liggen beide op ongeveer 70%. Dit varieert, met de vaardigheid van de persoon die de experimenten en de genotype. 
Figuur 1. Schematische tekening van larvale enscenering en steken letsel. (A) Op dag 0, vliegen is toegestaan om eieren te leggen in een druivensap petrischaal gedurende 3 uur. Op dag 1, het gearceerde eerste instar larven (L1) verzameld en geplaatst in flesjes die standaard gist voedsel, waar ze gedurende nog 3 dagen. Op dag 4 worden vanuit larven eten flesje, en gebruikt voor de experimenten steken. (B) Zijaanzicht van de larvale centrale zenuwstelsel.De buikstreek van de ventrale zenuw koord wordt gestoken met een naald uit de dorsale zijde. Anterior naar links en posterior naar rechts. 
Figuur 2. Time-lapse progressie van VNC laesie. Confocale microscopie voor levende VNCs met GFP-gelabelde axonen en DsRed-gelabelde gliacellen. Genotype:. UASDsRed / +; G9 / +; repoGAL4 / + (A) De laesie wordt herkend door het ontbreken van fluorescentie op de axonale neuropile. Na steken, GFP-negatieve gaten verschijnen, daarna steeds meer in omvang en aantal. Projecties van 5 optische secties van elk tijdstip na steekpartij letsel. (B) De axonale neuropile laesie krimpt van 9 uur na steken. Deze beelden zijn enkele optische secties van verschillende tijdstippen na steekpartij letsel. Om gelijkwaardige posities in elk monster, dezelfde slice nummer van EA te identificerench tijdstip in de stapel time-lapse data gekozen. Door vergelijking van de patronen zichtbaar gemaakt met G9 en repoGAL4> UASmCD8GFP in het gebied niet beïnvloed door de steken, werden de plakjes wordt bevonden van equivalente posities in de Z-as. Stippellijnen in (A, B) geven de rand van de wond. (C) High vergroting van wonden op de neuropile. GFP-negatieve gaten werden opgevuld met DsRed-positieve gliale processen, en vervolgens verdween (pijlpunten). Horizontale weergave. Anterior up. 
Figuur 3. Cellulaire karakterisering van VNC laesie. VNCs voorzien van een membraan gebonden GFP reporter voor gliacellen (behalve middellijn glia) gekleurd met anti-GFP en anti-GS2, een neuropile geassocieerde gliacellen marker. Genotype:. + / +; UASmCD8GFP / +; repoGAL4 / + (A) VNCs werden gestoken van de dorsal kant, maar dit veroorzaakt een deuk ventraal (pijlpunten). Sagittaal beeld van enkele optische secties dorsale en ventrale links. (A, B) stekende letsel bij meer ernstig neuropile-geassocieerde gliacellen dan cortex en oppervlakte gliacellen. Letsel leidt tot GS2-positieve cellulaire puin (pijlpunten in B). (B) horizontale weergave van enkele optische secties, anterior up. Pijlpunten wijzen GS2 + celresten. (C) Colocalisation van de apoptotische marker anti-gekliefde-caspase-3 en de neuronale marker anti-Elav blijkt dat bij schade aantal stervende cellen in de cortex neuronen. np, neuropile, cx, cortex. 
Figuur 4. Automatisch tellen van gliacellen en apoptotische cellen met behulp van DeadEasy. (A) Voorbeeld van het gebruik van 'DeadEasy Larvale glia' te tellen REPO positievegliacellen. Links: VNC ventrale helften gekleurd met anti-REPO-antilichamen; midden: output van DeadEasy Larvale glia met cellen geïdentificeerd door de plug-in, rechts: samenvoegen. De getallen aan de rechterkant zijn het aantal REPO-positieve cellen automatisch geteld in een hele stapel van optische confocale secties in ongeveer 30 seconden. Het aantal glia stijgingen in de gestoken VNCs. (B) Voorbeeld van het gebruik van 'DeadEasy Caspase larve'. Links: projecties van 5 optische confocale secties gekleurd met anti-gekloofd-caspase 3-antilichamen; midden: uitgang die cellen geïdentificeerd door de plug-in, rechts: samenvoegen. De getallen aan de rechterzijde is het aantal caspase-positieve cellen automatisch geteld in een hele stapel optische confocale secties in ongeveer 30 seconden. Het aantal apoptotische cellen verhoogt in de VNC gestoken. 
Figuur 5. Voorbeelden van degeneration. (A) Een gezonde VNC. Er zijn geen tekenen van degeneratie. (B) De zijde van de thorax is degenererende (pijlpunten) in een gestoken monster. Sterretje geeft laesie site. (C) Gaten in de thoracale neuropile (witte pijlpunt) en cortex (oranje pijlpunt) in een niet-gestoken VNC. Specimens met beschadigde neuropile en uitgebreide vacuolisatie moet worden weggegooid. Hier VNCs werden gekleurd met de neuropile bijbehorende gliale marker anti-Ebony. Horizontale weergave, anterior up.
Discussion
We hebben een protocol voor steekpartij letsel aan de Drosophila larven CZS naar de cellulaire reacties te onderzoeken om letsel, herstel en regeneratie. Larvale VNCs worden ontleed en gestoken, waarna ze zijn gemaakt met time-lapse microscopie of vastgesteld fluorescentie immunohistochemie om glia en neuronen, apoptose of celdeling visualiseren. De progressie van de laesie in de tijd worden gemeten. Deze werkwijze gaat gepaard met opzet ontwikkelde software voor de kwantitatieve en statistische analyse van het aantal cellen en veranderingen op schade tijdens reparatie.
We gestoken 96-uur AEL larven (en deze waren ofwel vast of toegestaan om verder te ontwikkelen), een ontwikkelingsfase voorafgaand aan de overgang naar pop en vervolgens volwassen vlieg. Bij 96 uur, VNCs groot genoeg zijn om steken, en in het midden derde instar stadium en dus niet ondergaan verpopping nog en het zenuwstelsel reeds volledig functioneel vergelijkbaar met die van de adUlt. Het is wellicht mogelijk om te steken iets later in larven en de precieze timing moet worden gekozen om de onderzoeksvraag aan te passen. Echter, afhankelijk van ingegaan op de vragen, zal het in het algemeen noodzakelijk om de cultuur van de VNCs voor enige tijd om de cellulaire reacties te observeren om letsel. Enige tijd na 120 uur AEL verpopping begint, een periode waarin het CZS gerenoveerd is en is dus het best vermeden worden. Zo het tijdvenster voor steken plus cultuur in de larve is tamelijk beperkt. Met behulp van larven heeft nog steeds een grote technische voordeel ten opzichte van gebruik van volwassenen: terwijl, net als de volwassen, het zenuwstelsel is al volledig functioneel, het analyseren van de reactie op letsel wordt aanzienlijk eenvoudiger en sneller in larven.
Bij vergelijking van de grootte en morfologie van de hersenen en VNCs ontleed en gekweekt in een schotel VNCs die ontleed tegen even later tijdstip zonder kweken in een schotel, blijkt dat ontwikkeling trager in kweek dan in vivo. In andere opzichtenontwikkeling draagt op normaal in de cultuur, weefsel integriteit wordt gevrijwaard en cellen worden in leven die meerdere reacties. Wond uitbreiding, neuropile reparatie en gliale proliferatie plaatsvinden binnen 22 uur na het steken. Hieruit blijkt dat cellulaire responsen op schade plaatsvinden in cultuur en is er waarschijnlijk geen noodzaak om de explantaten behouden langer dan een dag. Als langere termijn kweek werden gewenst kan het protocol verdere optimalisatie zoals het gebruik van een kweekplaat inzetstuk 5.
Het is belangrijk om goede monsters identificeren die de degeneratie. Het optimaliseren van dit protocol duurt enige vaardigheid en onvermijdelijk degeneratie zullen optreden bij sommige exemplaren. De VNC kan het verwerven van een 'bloemkool' uiterlijk dat een indeling van weefsel integriteit (Figuur 5B) weerspiegelt. Degeneratie wordt ook erkend door de vacuolisatie van de VNC onafhankelijk van de steken, die aanwezig kunnen zijn in intacte, niet-specimens gestoken (fig. 5C
In dit protocol hebben we geprofiteerd van een eiwit val lijn van vliegen naar de neuropile visualiseren parallel aan de visualisatie van gliale processen met behulp van de traditionele GAL4-UAS-systeem. Deze hulpmiddelen kunnen ook worden gecombineerd met andere binaire expressiesystemen zoals LexA 19 en Q-systeem 20, die onafhankelijk van GAL4. Dit zou de analyse van interacties bijvoorbeeld tussen axonen en gliale processen in reactie op letsel. Door verdere combineren met andere genetische tools zoals verslaggevers voor dendrieten 21 of calcium influx 22, deze methode biedt een geweldige kans om de celbiologie te analyseren achter de verwonding reactie van gliacellen, neuronale axonen en dendrieten in het CZS. Tenslotte kan deze methode worden gecombineerd met standaard genetische mutaties en over-expressie van genen, van genfunctie testen in respons op letsel en regeneratie.
Dit protocol heeft met succes geleid tot de ontdekking van een genetische netwerk dat de regeneratieve respons op CNS glia letsel 11. Gezien de evolutionaire behoud van de functie van een gen, het ontrafelen van deze cellulaire gebeurtenissen en genfuncties in fruit-vliegen is waarschijnlijk significante inzicht geven in het begrip van mammalian CNS reactie op letsel en regeneratie.
Disclosures
Geen belangenconflict verklaard.
Acknowledgments
Wij danken Mei Ann Lim voor kritische lezing van het manuscript en andere leden van ons lab voor hun besprekingen in de loop van dit werk. Dit werk werd gefinancierd door Yamada Science Foundation en Royal Society Korte Bezoek beurzen en EU Marie Curie Inkomende Internationale Beurs GRR naar KK, en BBSRC Project Grant (BB/H002278/1) en Wellcome Trust Equipment Grant (073228/Z/03/Z) naar AH
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Staining block | Brunel Microscope | ||
| Forceps No. 5 | Fine Science Tools | e.g. 11251-20 | |
| Tungsten needle: rod diameter, 0.5 mm; tip size, 1 μm; length, 2 inch | Roboz Surgical Instrument | RS-6065 | |
| Needle holder | Roboz Surgical Instrument | RS-6060 | |
| Arkansans stones: Repair Kit for Dumont Forceps | Fine Science Tools | 29000-00 | |
| 35 mm Petri dish with 27 mm glass base | Iwaki | 3930-035 | |
| Leica SP2-AOBS confocal inverted microscope with environment chamber | Leica | ||
| Reagent | |||
| Shield and Sang M3 insect medium (ecdysone free) | Sigma | S3652-500 ml | |
| Penicillin and streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | See 12 | ||
| FBS | Sigma | F7524 | |
| Poly-L-lysin | Sigma | P1399-25mg | |
| Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure | Polysciences | 04018-1 | |
| Mouse anti-glutamine synthetase antibodies | Millipore | MAB302 | |
| Rabbit anti-GFP antibodies | Life technologies | A11122 | |
| Mouse anti-REPO antibodies | Developmental Studies Hybridoma bank | 8D12 | |
| Rat anti-ELAV antibodies | Developmental Studies Hybridoma bank | 7E8A10 | |
| Rabbit anti-active caspase 3 antibodies | Abcam | ab13847 | |
| Normal goat serum | Vector Laboratories | S-1000 | |
| Anti-rabbit Alexa Fluor 488 | Life technologies | A11034 | |
| Anti-mouse Alexa Fluor 647 | Life technologies | A21236 | |
| Anti-rat Alexa Fluor 647 | Life technologies | A21247 | |
References
- Fang, Y., Soares, L., Teng, X., Geary, M., Bonini, N. M. A novel Drosophila model of nerve injury reveals an essential role of Nmnat in maintaining axonal integrity. Curr. Biol. 22, 590-595 (2012).
- Xiong, X., et al. Protein turnover of the Wallenda/DLK kinase regulates a retrograde response to axonal injury. J. Cell Biol. 191, 211-223 (2010).
- Leyssen, M., et al. Amyloid precursor protein promotes post-developmental neurite arborization in the Drosophila brain. EMBO J. 24, 2944-2955 (2005).
- Kato, K., Awasaki, T., Ito, K. Neuronal programmed cell death induces glial cell division in the adult Drosophila brain. Development. 136, 51-59 (2009).
- Ayaz, D., et al. Axonal injury and regeneration in the adult brain of Drosophila. J. Neurosci. 28, 6010-6021 (2008).
- Rohrbough, J., O'Dowd, D. K., Baines, R. A., Broadie, K. Cellular bases of behavioral plasticity: establishing and modifying synaptic circuits in the Drosophila genetic system. J. Neurobiol. 54, 254-271 (2003).
- Babcock, D. T., Landry, C., Galko, M. J. Cytokine signaling mediates UV-induced nociceptive sensitization in Drosophila larvae. Curr. Biol. 19, 799-806 (2009).
- Gomez-Marin, A., Louis, M. Active sensation during orientation behavior in the Drosophila larva: more sense than luck. Curr. Opin. Neurobiol. 22, 208-215 (2012).
- Schleyer, M., et al. A behavior-based circuit model of how outcome expectations organize learned behavior in larval Drosophila. Learn Mem. 18, 639-653 (2011).
- Brown, H. L., Cherbas, L., Cherbas, P., Truman, J. W. Use of time-lapse imaging and dominant negative receptors to dissect the steroid receptor control of neuronal remodeling in Drosophila. Development. 133, 275-285 (2006).
- Kato, K., Forero, M. G., Fenton, J. C., Hidalgo, A. The glial regenerative response to central nervous system injury is enabled by pros-notch and pros-NFkappaB feedback. PLoS Biol. 9, e1001133 (2011).
- Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. Drosophila protocols. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
- Morin, X., Daneman, R., Zavortink, M., Chia, W. A protein trap strategy to detect GFP-tagged proteins expressed from their endogenous loci in Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 15050-15055 (2001).
- Verkhusha, V. V., et al. An enhanced mutant of red fluorescent protein DsRed for double labeling and developmental timer of neural fiber bundle formation. J. Biol. Chem. 276, 29621-29624 (2001).
- Kato, K., Forero, M. G., Fenton, J. C., Hidalgo, A. The glial regenerative response to central nervous system injury is enabled by Pros-Notch and Pros-NFkB feedback. PLoS Biol. 9, e1001133 (2011).
- Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing: A Publication of the IEEE Signal Processing Society. 7, 27-41 (1998).
- Forero, M. G., Kato, K., Hidalgo, A. Automatic cell counting in vivo in the larval nervous system of Drosophila. J. Microsc. 46, 202-212 (2012).
- Forero, M. G., Pennack, J. A., Learte, A. R., Hidalgo, A. DeadEasy caspase: automatic counting of apoptotic cells in Drosophila. PLoS One. 4, e5441 (2009).
- Lai, S. L., Lee, T. Genetic mosaic with dual binary transcriptional systems in Drosophila. Nat. Neurosci. 9, 703-709 (2006).
- Potter, C. J., Tasic, B., Russler, E. V., Liang, L., Luo, L. The Q system: a repressible binary system for transgene expression, lineage tracing, and mosaic analysis. Cell. 141, 536-548 (2010).
- Nicolai, L. J., et al. Genetically encoded dendritic marker sheds light on neuronal connectivity in Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 20553-20558 (2010).
- Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nat. Methods. 6, 875-881 (2009).
