Summary
Un paradigme blessures en utilisant le cordon Drosophile larvaire nerveuse ventrale pour enquêter régénération du système nerveux central et de la réparation est décrite. Stabbing suivi par microscopie confocale à balayage laser dans des échantillons de time-lapse et fixe, combinée à une analyse quantitative d'un logiciel développé à dessein et de la génétique, sont utilisées pour étudier les mécanismes moléculaires de la régénération du SNC et de réparation.
Abstract
Une méthode expérimentale a été développée pour étudier les réponses cellulaires du système nerveux central (SNC) des blessures en utilisant la drosophile la mouche des fruits. Comprendre réparation et la régénération chez les animaux est une question clé dans la biologie. Le CNS endommagées de l'homme ne se régénère pas, et de comprendre comment favoriser la régénération est l'un des principaux objectifs de la médecine neurosciences. La boîte à outils puissante génétique de la drosophile peut être utilisé pour résoudre le problème de la régénération du SNC.
Une lésion de la moelle CNS nerveuse ventrale (VNC, équivalent à la moelle épinière vertébré) est appliqué manuellement à l'aide d'une aiguille de tungstène. Le VNC peut ensuite être filmé en time-lapse en utilisant la microscopie confocale à balayage laser pour un maximum de 24 heures pour suivre l'évolution de la lésion au fil du temps. Alternativement, il peut être mis en culture, puis fixées et colorées par immunofluorescence pour visualiser des neurones et des cellules gliales en microscopie confocale. En utilisant des marqueurs appropriés, changes de la morphologie cellulaire et état de la cellule à la suite de blessures peuvent être visualisées. Avec ImageJ et volontairement développé des plug-ins, des analyses quantitatives et statistiques peuvent être effectuées pour mesurer les changements dans la taille des plaies au fil du temps et les effets de la lésion dans la prolifération cellulaire et la mort cellulaire. Ces méthodes permettent l'analyse des échantillons de grande taille. Ils peuvent être combinés avec les puissants génétique de la drosophile pour étudier les mécanismes moléculaires qui sous-tendent la régénération du SNC et de réparation.
Introduction
La régénération chez les animaux révèle que les cellules détectent lorsque la croissance organisme est ordonnée et complète, et la façon dont l'intégrité structurelle d'un organisme est atteint et maintenu. La compréhension de ces capacités mystérieuses de cellules est d'un grand intérêt en biologie. Favoriser la régénération est l'un des principaux objectifs à des fins médicales en neurosciences. Chez l'homme, le système endommagé nerveux central (SNC) ne se régénère pas. Des modèles rongeurs de lésions de la moelle épinière sont utilisés pour comprendre comment les cellules répondent à des blessures. Toutefois, les préoccupations éthiques, les coûts élevés et le cycle de vie lente des animaux entravent le progrès.
La mouche des fruits Drosophila est un organisme modèle largement utilisé dans la biologie du développement et les neurosciences. Merci à ses puissants outils génétiques et le cycle de vie court, la drosophile a récurrente conduit à la découverte des fonctions des gènes et réseaux de gènes présentant un intérêt pour la compréhension de l'homme et de la maladie. Il ya de nombreuses preuves de l'évolution conconservation de la fonction des gènes des mouches à l'homme.
Ces dernières années, plusieurs paradigmes de lésion du système nerveux ont été établis chez la drosophile. Certains se composent d'endommager les nerfs périphériques qui courent le long de l'aile ou axotomie des nerfs périphériques, dont 1 sensoriel et moteur axones 2. Cependant, les systèmes nerveux périphérique et central diffèrent à bien des égards, et il est bien connu que chez de nombreux animaux du système nerveux périphérique peut se régénérer tandis que le SNC ne peut pas. Ainsi, pour comprendre la régénération du SNC, atteinte directe à la CNS est plus approprié. Blessures poignardant avec une aiguille a été appliquée avec succès dans le cerveau adulte chez la drosophile pour étudier la réponse à une lésion 3,4. En utilisant une autre approche, Ayaz et al. Axones sectionnés SNC chez les cerveaux adultes cultivés avec un microdissector Piezo électrique et analysé leur régénération pendant 4 jours 5. L'avantage de ces u jeu plus tard expérimentaleps est qu'ils se concentrent sur le cerveau, ce qui est sans aucun doute d'un grand intérêt. L'inconvénient est que le cerveau est beaucoup plus complexe que le VNC, qui ne traite que du moteur et contrôle sensoriel. Travail sur le cerveau adulte est aussi beaucoup plus de temps. La larve est prête pour des expériences en 4 jours, alors qu'il faut environ 10 jours pour l'éclosion des adultes, puis supplémentaire de 5 jours pour leur maturation. Le cerveau adulte est également plus difficile à gérer, car il est encapsulé dans une cuticule épaisse, ce qui est difficile à enlever. Le VNC présente l'avantage supplémentaire d'être fonctionnellement équivalente à la moelle épinière vertébré.
La larve Drosophila est largement utilisée comme organisme modèle pour les neurosciences 6-9. Bien qu'à proprement parler la larve est dans une phase de développement, il peut également être considéré comme un animal entièrement fonctionnel. La larve a la locomotion, de multiples sens, y compris l'olfaction, du goût et de la nociception, et l'apprentissage et la mémoire. Ainsi, les larves VNC wque choisi comme le modèle idéal pour une lésion du SNC.
VNC larves et des pupes peuvent être disséqués et mis en culture dans un plat, en conservant l'intégrité cellulaire jusqu'à 24 h 10. Cela suggère que le préjudice pourrait être appliquée à la VNC, qui pourrait ensuite être enregistrées dans time-lapse pour cours de cette période de temps, ou cultivées et fixées à n'importe quel point dans le temps désiré à l'intérieur de cette période.
Ici, nous présentons un paradigme expérimental de lésion du SNC en utilisant la drosophile larves VNC. La VNC est d'abord disséqué de la larve, et les blessures coup de poignard est appliqué manuellement à l'aide d'une aiguille de tungstène. La VNC est ensuite placée sur une lamelle de verre à fond, et filmé avec time-lapse microscopie confocale à balayage laser. Alternativement, les VNC peuvent être cultivés pendant une période de temps désirée, et les effets cellulaires de blessures peuvent être analysés dans les échantillons fixes à l'aide immunomarquage et microscopie confocale. La zone de la plaie peut être mesurée, et une analyse quantitative des cellules numbre (prolifération cellulaire et la mort cellulaire) peut être réalisée avec un logiciel développé à dessein. Échantillons de grande taille peuvent être facilement manipulés, ce qui entraîne des résultats statistiquement validés. Ces méthodes ont été combinées avec succès la génétique de la drosophile puissants de découvrir un réseau de gènes qui sous-tend la réponse des cellules gliales de régénération à une lésion du SNC 11.
Protocol
1. Collection de larves par étapes
- Place 15 filles et 15 mouches adultes de sexe masculin dans une cage cylindrique en plexiglas pour pondre leurs œufs sur une boîte de Pétri avec de l'agar et le jus de raisin complété par une petite boule de pâte de levure pendant 3 heures à 25 ° C. Changer la plaque 3-4 fois par jour, et jetez la première plaque (c.-à partir de l'O / N oeuf-lay). Jetez également les plaques de la première journée. Dès le deuxième jour, gardez les plaques avec des œufs à 25 ° C. Après 7 jours de collecte des œufs, commencez avec une nouvelle mise en place des mouches parents.
- Après environ 24 heures, les larves éclosent des œufs. En accrochant les larves avec un pinceau ou dilué avec une paire de pinces, transférer 35 larves de l'agar de raisin dans un flacon contenant de la nourriture volée standard (10 ml) (figure 1A).
- Maintenir les flacons contenant des larves pendant 3 jours (96 heures après la ponte, AEL) à 25 ° C.
2. Dissection des larves Cordons nerveuse ventrale de la Culture
- Nettoyez êtrench et les mains avec de l'éthanol à 70%. Faire tremper 4 blocs de coloration, 2 paires de pinces et d'une aiguille avec de l'éthanol à 70%, et laisser sécher à l'air.
- Préparer 4 blocs de coloration avec les médias suivants: une avec de l'eau distillée (DW) à nettoyer et à larves piscine nettoyée, une deuxième avec 2 ml de bouclier et Sang M3 moyen insecte avec 1% de pénicilline et de la streptomycine, Ecdysone frais (M3 PS moyenne) de disséquer les larves, et un troisième avec 2 ml de M3 PS moyen de mettre en commun disséqués cordons nerveux ventral (VNC), et un quatrième avec 2 ml de M3 PS moyen de poignarder les VNC. Tous les réactifs doivent être préchauffée à la température ambiante.
- Ajouter de l'eau dans le flacon contenant 96 h AEL larves. Puis, à l'aide d'une spatule, écartez doucement la nourriture par les larves de la fiole sur une serviette en papier humide. Transférer 10 larves à un bloc de coloration contenant DW pour laver les aliments. Remplacer DW 6 fois. Puis remplacez-le par M3 PS support.
- Transfert un des larves à un bloc de coloration contenant 2 ml de milieu M3 PS.
- Sous une loupe binoculaire, dissect un cerveau larvaire avec soin en utilisant des méthodes standard 12, mais pour minimiser les dommages aux tissus, prendre des précautions particulières en procédant de la manière suivante. Placez la face dorsale larve haut, et la face dorsale moins un tiers de l'extrémité antérieure avec 2 paires de pinces (une dans chaque main). Tout en maintenant la partie antérieure, se détacher de l'extrémité postérieure de la pince, et à la déchirure de l'épiderme. Le cerveau et la VNC doit être visible depuis le bord postérieur de la moitié antérieure. Soin d'isoler le cerveau et complexe VNC en enlevant la graisse corporelle, de l'intestin et de l'épiderme. Lorsque les VNC sont trop endommagés, les VNC va dégénérer totalement ou partiellement, même sans avoir poignardé blessures. Prenez en compte les points suivants:
- Ne pas tirer ou arracher les disques imaginaux et des nerfs périphériques du thorax VNC car cela pourrait endommager la VNC. Pour couper les nerfs périphériques, maintenez les nerfs périphériques avec deux paires de pinces placées à proximité les uns les autres, puis tirez sur les nerfs avec l'd'cèpes. Disques imaginaux et des pièces buccales peuvent être laissés attachés à la VNC.
- Laisser la glande anneau et des ganglions lymphatiques attaché au cerveau.
- Couper le tube digestif au point le plus proche du cerveau, où la nourriture est pas très contenue.
- En utilisant un pipetman P20 avec le bout coupé et élargi un peu, transférer le VNC pour une salière contenant nouvelle M3 PS support. Avant de transférer le VNC, première pipette de haut en bas que le support utilisé pour la dissection afin d'éviter la VNC de coller à la pointe.
3. Stabbing blessures à la VNC Drosophile larvaire
Cette section explique comment effectuer une blessure lancinante à la VNC, et de préparer poignardé-VNC pour time-lapse analyse et immunomarquage. Conditions de culture post-coup de poignard et la durée sont décrits à la section 5 (pour time-lapse analyse) et à l'article 6 (pour immunomarquage).
- Après la mise en commun suffisamment de VNC (4-5 pour time-lapseet plus de 24 pour immunomarquage), transférer une VNC pour une salière propre contenant M3 PS.
- Orientez le VNC pour que le neuropile dorsale est en vue sous le microscope à dissection (figure 1B). Telle est l'orientation la plus naturelle pour VNC pour s'allonger dans lorsqu'ils sont attachés à les lobes optiques.
- Stab manuellement à l'aide d'une aiguille de tungstène sous le microscope de dissection, de la face dorsale pratiquement à angle droit et de parvenir à la moitié de l'abdomen du VNC (figure 1B).
Prenez une attention particulière à ce qui suit:
- Stab qu'une seule fois.
- Stab ce que l'aiguille touche le fond du verre. Attention cependant à ne pas endommager la pointe de l'aiguille.
- La tige du porte-aiguille ne doit pas toucher le milieu lors de coups de couteau.
- La blessure n'est pas visible sous le microscope de dissection.
Remarque: Stab-accident sans rapport avec la dégénérescence
La procédurepeut entraîner une dégénérescence cellulaire dans le VNC distincte de la lésion coups de couteau. Résultats dégénérescence des trous dans l'neuropile, et parfois des trous ont été observées dans le cortex des spécimens non poignardé. Les échantillons présentant une dégénérescence affectant la dégénérescence neuropile ou généralisée affecte également la surface VNC doit être jeté. Dégénérescence peuvent être identifiés comme suit:
- Surface rugueuse, en particulier dans la zone latérale / ventrale du thorax, à 22 h coup de couteau. Dans les cas extrêmes, la VNC semble saillie.
- Des trous ou des vacuoles dans la neuropile thoracique, qui peuvent être visibles en tant que signal de trous dans le fond avec immunomarquage fluorescence.
4. Entretien de l'aiguille et pince
- Vérifiez régulièrement si la pointe de l'aiguille est assez tranchant. La pointe de l'aiguille peut être tordue ou émoussée après l'avoir utilisé pour des expériences de plusieurs années. Dans ce cas, aiguiser la pointe à l'aide d'une pierre d'Arkansas ou équivalent.
- Les pointes de la pince doitrépondre parfaitement. Les conseils peuvent être endommagées avec l'usage. Dans ce cas, ajustez la pointe à l'aide d'une pierre Arkansas ou équivalent.
5. Enregistrement Culture et Time-lapse de VNC Poignardé
Pour visualiser le neuropile axonale dans la vie VNC, une ligne GFP piège protéine qui qualifie tous les axones - G9 13 - peuvent être utilisés, et de visualiser toutes les cellules gliales (à l'exception de la glie ligne médiane), le pilote gliales repoGAL4 peut être utilisée pour exprimer la UASdsRed S197Y 14 journaliste. Par croisement G9 vole à UASdsRedS197Y;; repoGAL4 mouches, VNC de larves descendants sont obtenus avec des axones verts et des cellules gliales rouge qui peuvent être enregistrées dans les tissus vivants.
- Après la mise en commun VNC 5.4, transfert 1 VNC pour une salière propre contenant 2 ml de M3 PS, et le poignarder la moitié abdominale of the VNC, comme indiqué à la section 3.
- Transférer la poignardé VNC à une poly-L-lysine recouvert de verre 3,5 mm en bas boîtes de Pétri contenant 1 ml de M3PS. Placez le côté VNC dorsale vers le bas. Poussez doucement la VNC en utilisant le côté plat d'une paire de pince pour permettre à la VNC de coller au plat.
- Ajouter délicatement 1 ml de FBS M3 PS 15% rendant la concentration finale de FBS à 7,5%.
- Acquérir des images à l'aide microscopie confocale à balayage laser. Numériser le VNC, la collecte d'une série Z de section sur toute son épaisseur. Nous avons utilisé un Leica SP2 microscope inversé confocal avec une température de chambre de l'environnement contrôlé. Un microscope confocal équivalent devrait fonctionner, mais il peut exiger l'optimisation des paramètres de numérisation. Les paramètres de notre time-lapse de microscopie confocale ont été les suivantes: Température de la chambre de l'environnement: 25 ° C; 20X objectif avec zoom 4 fois; mode de balayage xyzt, avec une résolution de 512x512 pixels, z = 1 um et étapes de 1 heure ou 2 - intervalles d'une heure.
- Le microscope confocal Leica SP2 a une limitation de taille de fichier pour la numérisation. Avec ces paramètres, 8-9 points dans le temps peuvent être numérisés. Avecautres microscopie confocale, il devrait être possible d'acquérir des piles d'images pour les points de temps plus longues, c'est à dire sur la durée maximale de 24 heures.
6. Culture et immunocoloration de VNC poignardé et fixe
- Préparer une plaque de 24 puits de culture de tissu contenant 500 ul de FBS M3 PS 7,5% par puits.
- Répétez la dissection de plus de 24 VNC pour un plat de 24 puits de culture de tissu.
- En utilisant le pipetman P20 avec la pointe coupée, transfert 12 VNC non poignardé de la piscine à la boîte de culture, en utilisant 1 VNC par puits.
- Stab le reste de VNC dans la piscine comme décrit dans la section 3. Transférer chaque poignardé VNC à un puits chacun.
- Placer la capsule 24-puits dans un incubateur à 25 ° C pendant une durée souhaitée en fonction de l'expérience. L'intégrité des cellules n'est pas modifiée pendant au moins 24 heures.
- Après la culture, de transférer les 12 VNC dans 250 pi de PEM formaldéhyde à 4% dans un tube de 1,5 ml en utilisant le pipetman P20 avec la pointe coupée. Ensuite, la fixative est soigneusement pipette, en prenant soin de ne pas endommager les VNC. Une petite quantité de fixatif suffisante pour couvrir les échantillons doivent rester dans chaque tube. Par la suite, ajouter du fixateur frais et agiter doucement pendant 50 min à température ambiante.
- Rincer 2 fois avec du PBS 0,3% Triton X, puis laver 2 fois pendant 10 minutes avec 0,3% de Triton X PBS à température ambiante.
- VNC bloc par incubation avec du sérum de chèvre normal à 10% en 0,3% de Triton X PBS pendant 1 heure à température ambiante. Les échantillons peuvent être conservés à 4 ° C pendant au moins un mois.
- Incuber VNC avec des anticorps primaires pendant plus de 20 heures à 4 ° C.
- Rincer 2 fois avec 0,3% de Triton X PBS, puis laver 3 fois pendant 10 minutes avec 0,3% de Triton X PBS à température ambiante.
- Incuber VNC avec des anticorps secondaires pendant plus de 16 heures à 4 ° C.
- Rincer 2 fois avec 0,3% de Triton X PBS, puis laver 3 fois pendant 10 minutes avec du PBS 0,3% Triton X dans la salle de RT (dans le noir si vous utilisez des anticorps secondaires fluorescents).
- Remplacer PBS avec 50% de glycérol: 50% du PBS pendant au moins uneheures.
- Puis remplacez-le par du glycérol 80%: 20% de PBS pendant au moins une heure.
- Monter un VNC dans une fenêtre ménagée sur 2 couches de cello-bande (environ 0,06 mm) sur une lame de verre microscopie. Ajuster l'orientation, et placer une lamelle (18x18 mm) au-dessus de la fenêtre. Deux VNC peut être monté sur une glissière à l'aide de ce procédé.
En utilisant une variété d'anticorps primaires, différentes réponses cellulaires à des blessures peuvent être analysés (par exemple les changements dans le nombre de cellules et la forme des cellules).
7. Analyser données à l'aide ImageJ et une gamme de plug-ins
Si la VNC n'a pas poignardé la dégénérescence indépendant, l'échantillon doit être pris en compte dans l'analyse indépendamment de la taille des lésions. Comme coups de couteau se fait manuellement, la taille de la lésion est différente à chaque fois. Ainsi, il est important d'analyser statistiquement l'effet des coups de couteau, chaque fois que possible.
- Mesure de la taille des plaies. La taille de la plaie est un indicateur de réparation 15.La lésion est visible poignarder comme dépourvu d'expression de GFP. Zone de lésion peut être mesurée à l'aide des données de déchéance disponible gratuitement le logiciel ImageJ, comme suit:
- Utilisation ImageJ, ouvrez une pile d'images confocales du menu "Fichier", sélectionnez "Importer" et de là, sélectionnez "séquence d'images". Cela transforme la collection d'images individuelles dans une pile.
- Suivant changer la "pile" dans un "HyperStack" en allant dans "Image" du menu, sélectionnez "HyperStack", puis sélectionnez "Stack à HyperStack".
- Définissez la taille de voxel en utilisant "Propriétés" du menu "Image". Dans les données acquises à l'aide du microscope confocal Leica SP2, la taille de voxel peut être obtenue à partir de l'analyse de logiciels, et à partir du fichier texte métadonnées enregistrées avec les images. Avec notre milieu tel que décrit dans la section 3, les dimensions en pixels sont xy = 0,366211 um et z = 0,99709 um.
- En examinant toutes les tranches dans un point dans le temps, dessiner le contour maximum de la zone de lésion avec l'outil polygone de sélection dans la barre d'outils. Il s'agit de laRégion d'intérêt (ROI).
- Ajouter le ROI au gestionnaire de ROI en cliquant sur "Analyser" du menu, faites défiler et sélectionnez "Outils", puis "Gestionnaire de retour sur investissement", puis "ajouter".
- Répétez cette opération pour les tous les points de temps.
- Cliquez sur "Mesure" dans le gestionnaire de ROI pour obtenir la taille de la zone de chaque ROI.
- Correction du mouvement VNC pendant enregistrements time-lapse. "Stackreg" et "Turboreg" plugins 16 (à partir du site Web de ImageJ http://rsbweb.nih.gov/ij/ ): ces plugins permettent de corriger les mouvements de petits échantillons lors de time-lapse. Construire une pile avec une section optique équivalent représentant à travers tous les points de temps et d'appliquer les plugins. Il permet de visualiser la façon dont les changements des lésions dans le temps. Les détails sur ces méthodes et le manuel d'instructions sont disponibles du groupe de recherche qui a développé ces plugins. ( http://bigwww.epfl.ch / Thévenaz / stackreg /).
- Comptage automatique des cellules gliales. «Glie DeadEasy" plugin ( www.biosciences-labs.bham.ac.uk/hidalgo/Software.html ): il a été développé pour compter le nombre de REPO-positives cellules gliales dans le VNC Drosophila larves et d'examiner l'évolution des cellules gliales Numéro causé des blessures à coups de couteau 17. Le plug-in fonctionne correctement, avec une erreur de 0,1% de faux positifs et de faux négatifs de 4,3% 17. Pour utiliser ce plug-in, première étiquette toutes les cellules gliales (à l'exception de la ligne médiane) dans l'échantillon par immunofluorescence avec des anticorps anti-REPO. Ensuite, installez le plug-in dans ImageJ, ouvrez une pile d'images confocales et exécuter le plug-in. Il compte les cellules gliales automatiquement au bout de 30 secondes.
- Comptage automatique des cellules apoptotiques. "Larves Caspase DeadEasy" plug-in ( www.biosciences-labs.bham.ac.uk/hidalgo/Software.html) 18: Elle a été développée pour compter le nombre de cellules marquées avec des anticorps anti-fendues-CASPASE3, et une nouvelle version a été adaptée pour les larves VNC. Stabbing blessure provoque une augmentation de la mort cellulaire programmée 11. Pour utiliser ce plug-in, les cellules apoptotiques première étiquette dans l'échantillon par immunofluorescence avec des anticorps anti-fendues-Caspase-3 anticorps. Ensuite, installez le plug-in dans ImageJ, ouvrez une pile d'images confocales et exécuter le plug-in. Il compte les cellules apoptotiques automatiquement au bout de 30 secondes.
8. Réactifs
- Milieu de culture: Bouclier et moyennes Sang insectes M3, 7,5% de sérum de veau fœtal, 1% et la pénicilline streptomycine 1%.
- 0,01% de poly-L-lysine dans DW stérile.
- Fixateur: formaldéhyde à 4%, ultra pure dans PEM (0,1 M TUBES, 2 mM EGTA 1 mM, MgSO 4) solution.
- Solution de blocage pour immunomarquage: 10% de sérum de chèvre normal dans 0,3% de Triton X PBS.
- Anti-glutamine synthétase2 anticorps: 1:250 dans une solution de blocage.
- Anticorps anti-GFP: 1:1000 dans une solution de blocage.
- Anti-REPO anticorps: 1:250 dans une solution de blocage.
- Anti-ELAV anticorps: 1:250 dans une solution de blocage.
- Anti-clivées Caspase 3 anticorps: 1:1000 dans une solution de blocage.
- Anticorps secondaires: 1:250 dans une solution de blocage.
Representative Results
Ici, nous montrons comment effectuer une blessure lancinante à la VNC Drosophile larvaire et analyser les réponses cellulaires à l'aide d'une blessure time-lapse et immunomarquage microscopie confocale de fluorescence.
Pour des données à intervalles de temps, la lésion est visualisée sous la forme d'une zone de GFP-négative dans le neuropile d'échantillons portant le marqueur G9 axonale (figure 2). Peu de temps après avoir poignardé, GFP-négatifs petites zones, qui ressemblent à des trous ou des vacuoles, commencent à apparaître (figure 2A). Une telle GFP-négatifs zones généralement agrandir jusqu'à environ 6 à 8 heures après avoir poignardé (figure 2A). Par la suite, les zones GFP-négatifs rétrécir et peut même disparaître (figure 2B). En 22 heures après avoir poignardé, la superficie occupée par la blessure est généralement inférieure à la superficie maximale est de 6 à 8 heures après avoir poignardé (figures 2a, b). De même, la zone DsRed négatif dans les processus gliales augmente initialement trop, mais Shrinks de 22 h après avoir poignardé. Fait intéressant, souvent DsRed-positives processus gliaux remplir les trous GFP-négatives dans le neuropile avant sa disparition (figure 2C).
Utilisation immunomarquage des spécimens fixes, de beaux processus gliales et leur réponse aux blessures peuvent être visualisées avec une meilleure résolution qu'avec time-lapse images. Cela peut être fait, par exemple, en utilisant le pilote repoGAL4 gliales pour induire l'expression d'un journaliste membrane captif (par exemple SAMU-mCD8GFP) chez les mouches de visualiser toutes les cellules gliales (à l'exception de la glie ligne médiane). Cela peut également être combiné avec d'autres marqueurs gliaux, tels que les anti-GS2, qui marque neuropile associées à des cellules gliales (figures 3A, B). Ici, nous montrons que, bien que la corde nerveuse ventrale est poignardé à partir de la face dorsale, lancinante blessure résulte d'une dent ventrale (figure 3A, pointes de flèches). Stabbing semble affecter plus gravement le neuropile et neuropile associée ème cellules glialesune surface du cortex et des cellules gliales (figure 3B). Processus gliaux semblent désorganisés dans le neuropile, alors ils maintiennent toujours leur maillage comme organisation dans le cortex. Lésion entraîne GS2-positif débris cellulaires, qui est distincte de cellules normales que des fragments de débris sont beaucoup plus faibles, et non reliée à un corps de cellule. Cela révèle des dommages à neuropile associés cellules gliales (figure 3B). Dégénérescence neuropile associés cellules gliales ont également été observées par microscopie électronique 15. Anti-fendues-Caspase 3 + coloration apoptose est observée dans neuropile associés aux cellules gliales 15, montrant qu'ils entrent en apoptose lors de coups de couteau blessure. Neuropile cellules gliales associées ont également été montré à phagocyter les débris neuronale 15, et GS2 + signal pourrait aussi révéler l'engloutissement de neurones apoptotiques par des processus gliales. Fendues Caspase-apoptotiques des cellules + sont également observées dans le cortex, au moins certaines d'entre elles correspondent à des neurones Elav + ( En utilisant des échantillons fixes et immunomarquage permet également des analyses quantitatives des réponses cellulaires aux dommages, tels que les effets de la prolifération et l'apoptose. Pour cela, nous avons délibérément mis au point deux ImageJ plug-ins, Larve Caspase DeadEasy et Glia DeadEasy, à compter automatiquement le nombre de cellules gliales et les cellules apoptotiques, respectivement. Ils ont été validés pour travailler sur les VNC larvaires et sont très précis. Grâce à eux, il est possible d'observer une augmentation du nombre de REPO-positives cellules gliales causés par une blessure lancinante, de 22 h (figure 4A) 15. Il ya aussi une augmentation du nombre d'anti-fendues-Caspase-3 cellules apoptotiques de 6 heures après l'avoir poignardé (figure 4B) 15. Une telle augmentation de la prolifération des cellules gliales et de l'apoptose en réponse aux lésions dans le SNC chez la drosophile n'est pas sans rappeler la réponse des blessures dans le SNC des vertébrés. Un aspect crucial de ce proprotocole est la qualité de la dissection VNC. Il est difficile de dire au moment de la dissection si les VNC ont été endommagés ou non dans le processus. Il est important de prendre un soin particulier à effectuer des dissections douces. Cependant, les échantillons de mauvaise qualité seront inévitablement produit, et il est essentiel que ceux-ci sont identifiés à un stade ultérieur et mis au rebut. Dans nos mains, la dégénérescence VNC ne semble pas lié à une blessure, mais plutôt causé par la dissection grossière. Nous n'avons pas observé une taille critique dans la plaie blessure, et nous analysons tous les échantillons blessés qui ne sont pas dégradées. Lorsque VNC maintenir leur intégrité, la surface VNC a tendance à regarder lisse et brillant, et pas de trous dans le neuropile sont observées (figure 5A). La dégradation de VNC peut être reconnu par 24 heures post-dissection de la surface rugueuse des zones VNC ventrales et latérales (figure 5B). La dégradation de la neuropile rien à voir avec une blessure lancinante peut également se produire, et il est reconnu comme neuropile holes dans le signal de fond de spécimens immunocolorées. Les échantillons avec ces signes de dégénérescence doit être éliminée (figure 5C). Dans nos mains, le taux de réussite pour la dissection et le contrôle des blessures intacte et poignardé (yw) sont à la fois les mouches autour de 70%. Ce taux varie en fonction de l'habileté de la personne qui effectue les expériences, et avec le génotype. 
Figure 1. Schéma des larves de mise en scène et lancinante blessure. (A) Au jour 0, les mouches sont autorisés à pondre des oeufs dans une boîte de Pétri jus de raisin pendant 3 heures. Au jour 1, l'éclosion des larves de premier stade (L1) sont recueillis et placés dans des flacons contenant de la nourriture de levure standard, où ils sont conservés pendant 3 jours. Au jour 4, les larves sont collectées à partir flacon alimentaire, et utilisé pour les expériences de poignard. (B) Vue latérale du système nerveux central des larves.La région abdominale du cordon nerveux ventral est poignardé avec une aiguille de la face dorsale. Est antérieure à la gauche et vers la droite postérieure. 
Figure 2. Time-lapse progression de la lésion VNC. Microscopie confocale sur les VNC en direct avec des axones GFP-étiquetés et marqués DsRed cellules gliales. Génotype:. UASDsRed / +; G9 / +; repoGAL4 / + (A) La lésion est reconnue par l'absence de fluorescence sur le neuropile axonale. Après avoir poignardé, GFP-négatives des trous apparaissent, par la suite augmenter en taille et en nombre. Projections des 5 sections optiques de chaque point de temps après avoir poignardé blessures. (B) Les axones se rétrécit lésion neuropile de 9 h après avoir poignardé. Ces images sont simples sections optiques de différents points de temps après avoir poignardé une blessure. Pour identifier les postes équivalents dans chaque échantillon, le nombre même tranche d'eapoint dans le temps ch dans la pile de time-lapse de données a été choisi. En comparant les modèles visualisés avec G9 et repoGAL4> UASmCD8GFP dans la zone non affectée par le coup de couteau, les tranches ont été vérifiés comme étant des postes équivalents dans l'axe Z. Les lignes pointillées dans (A, B) indiquer le bord de la plaie. (C) à fort grossissement des blessures sur le neuropile. GFP-négatifs orifices sont bouchés avec DsRed-positives processus gliaux, et ont ensuite disparu (pointes de flèches). Vue horizontale. Jusqu'à antérieure. 
Figure 3. Caractérisation cellulaire de la lésion VNC. VNC portant un rapporteur GFP membrane captif pour toutes les cellules gliales (cellules gliales, sauf la ligne médiane) colorées avec des anticorps anti-GFP et anti-GS2, un marqueur neuropile associée à des cellules gliales. Génotype:. + / +; UASmCD8GFP / +; repoGAL4 / + (A) VNC ont été poignardés à partir de la dorcôté sal, mais cela provoque une brèche ventralement (pointes de flèches). Vue sagittale de simples sections optiques, gauche dorsale et antérieure. (A, B) Stabbing blessure affecte plus sévèrement neuropile associée à des cellules gliales que les cellules gliales du cortex et de surface. Blessure entraîne GS2-positif débris cellulaires (pointes de flèches en B). (B) Vue horizontale de simples sections optiques, jusqu'à antérieure. Des pointes de flèche indiquent GS2 + débris cellulaires. (C) co-localisation du marqueur anti-apoptotique fendues-caspase-3 et le marqueur neuronal anti-Elav montrant que sur un dommage certaines des cellules meurent dans le cortex sont des neurones. np, neuropile; cx, le cortex. 
Figure 4. Comptage automatique des cellules gliales et les cellules apoptotiques en utilisant DeadEasy. (A) Exemple d'utilisation de 'cellules gliales DeadEasy larvaire »à compter REPO positifles cellules gliales. Gauche: les moitiés VNC ventrales colorées avec des anticorps anti-REPO; moyennes: sortie de la glie larves DeadEasy montrant des cellules identifiées par le plug-in, à droite: fusionner. Les nombres sur la droite sont le nombre de cellules positives REPO en compte automatiquement dans une pile de sections optiques confocaux à environ 30 secondes. L'augmentation du nombre de cellules gliales dans les VNC poignardé. (B) Exemple d'utilisation de "larve Caspase DeadEasy». Projections de 5 sections optiques confocaux colorées avec des anticorps anti-fendues-Caspase 3 anticorps; moyennes:: Gauche sortie montrant des cellules identifiées par le plug-in, à droite: fusionner. Les nombres sur la droite sont le nombre de cellules positives CASPASE en compte automatiquement dans une pile de sections optiques confocaux à environ 30 secondes. Le nombre de cellules apoptotiques augmente dans la poignardé VNC. 
Figure 5. Des exemples de degeneration. (A) Une saine VNC. Il n'y a pas de signes de dégénérescence. (B) Le côté du thorax se dégrade (pointes de flèches) dans un échantillon poignardé. L'astérisque indique site de la lésion. (C) Des trous dans la neuropile thoracique (tête de flèche blanche) et le cortex (orange tête de flèche) dans un non-poignardée VNC. Les échantillons présentant une vacuolisation neuropile vaste et endommagé doit être jeté. Voici les VNC ont été colorées avec le marqueur associé neuropile gliales anti-ébène. Vue horizontale, jusqu'à antérieure.
Discussion
Nous avons établi un protocole pour avoir poignardé une blessure au SNC chez la drosophile larvaires pour enquêter sur les réponses cellulaires aux dommages, la réparation et la régénération. VNC larvaires sont disséqués et poignardé, après quoi ils sont filmés avec time-lapse de microscopie ou fixe pour immunomarquage fluorescence de visualiser les cellules gliales et les neurones, l'apoptose ou la division cellulaire. La progression de la lésion au cours du temps peut être mesuré. Cette méthode est accompagné par un logiciel volontairement développé pour l'analyse quantitative et statistique des changements du nombre de cellules sur les blessures et lors de la réparation.
Nous poignardé à 96 heures larves AEL (et ceux-ci ont été soit fixe ou permis de développer plus loin), un stade de développement avant la transition vers la nymphe puis mouche adulte. À 96 h, VNC sont assez grands pour avoir poignardé, ils sont au milieu du stade troisième étape, et ne sont donc pas subir la nymphose encore, et le système nerveux est déjà pleinement fonctionnelle similaire à celle de l'annonceUlt. Il pourrait être possible de poignarder un peu plus tard chez les larves et le calendrier précis doit être choisi en fonction de la question de recherche. Toutefois, en fonction des questions posées, il sera généralement nécessaire à la culture des VNC depuis un certain temps d'observer les réponses cellulaires aux dommages. Quelque temps après le début de HR 120 pupaison AEL, une période où le système nerveux central est rénové et est donc préférable d'éviter. Ainsi, la fenêtre de temps pour avoir poignardé la culture ainsi que dans la larve est plutôt restreinte. En utilisant des larves a encore un grand avantage technique sur l'utilisation adultes: alors que, comme pour l'adulte, le système nerveux est déjà pleinement fonctionnelle, l'analyse de la réponse à la blessure est beaucoup plus facile et plus rapide chez les larves.
Lorsque l'on compare la taille et de la morphologie du cerveau et VNC disséqués et mis en culture dans un plat à VNC qui sont disséqués à un moment ultérieur équivalent sans mise en culture dans un plat, il apparaît que le développement est plus lent que dans la culture in vivo. À d'autres égards,développement exerce normalement dans la culture, l'intégrité des tissus est préservée et les cellules sont vivantes qui présente des réponses multiples. L'expansion des plaies, la réparation et la prolifération gliale neuropile avoir lieu dans les 22 heures après avoir poignardé. Cela montre que les réponses cellulaires à des blessures ont lieu dans la culture et il n'y a plus aucun besoin de maintenir les explants pendant plus d'une journée. Si la culture à long terme ont été désiré, le protocole peut nécessiter une optimisation plus poussée comme l'utilisation d'un insert plaque de culture 5.
Il est important d'identifier les échantillons de bonne qualité de ceux dégénérescence. Optimisation de ce protocole prend une certaine habileté et, inévitablement, la dégénérescence se produit chez certains spécimens. Le VNC peuvent acquérir un «chou-fleur» l'apparence qui reflète une répartition de l'intégrité tissulaire (figure 5B). La dégénérescence est également reconnu par la vacuolisation de la VNC indépendamment de l'agression, qui peuvent être présents dans intacts, non poignardé spécimens (figure 5C
Dans ce protocole, nous avons profité d'une ligne de piégeage des mouches des protéines de visualiser la neuropile en parallèle à la visualisation de processus gliales en utilisant le traditionnel GAL4-UAS système. Ces outils pourraient également être combinés avec d'autres systèmes d'expression binaires tels que le LexA 19 et Q-20 du système, qui sont indépendants de GAL4. Cela permettrait à l'analyse des interactions, par exemple entre les axones et les processus gliales, en réponse à une blessure. En plus de le combiner avec d'autres outils génétiques comme les journalistes de dendrites 21 ou 22 influx de calcium, cette méthode fournit une excellente occasion d'analyser la biologie cellulaire derrière la réponse blessures des cellules gliales, les axones et des dendrites neuronales dans le système nerveux central. Enfin, cette méthode peut être combinée avec la génétique standard, les mutations et sur-expression de gènes, afin de tester la fonction des gènes dans les réponses aux blessures et la régénération.
Ce protocole a dirigé avec succès à la découverte d'un réseau de gènes qui sous-tend la réponse régénérative des cellules gliales du système nerveux central des blessures 11. Compte tenu de la conservation évolutive de la fonction des gènes, démêler ces événements cellulaires et les fonctions des gènes dans les mouches à fruits est susceptible de fournir des indications significatives dans la compréhension de maSNC mmalian réponse à une lésion et régénération.
Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier Ann Mei Lim pour la lecture critique du manuscrit et d'autres membres de notre laboratoire pour leurs discussions tout au long de ce travail. Ce travail a été financé par Yamada Science Foundation et de la Royal Society bourses courte visite et de l'UE internationale Marie Curie Fellowship GRR entrant à KK, et le BBSRC de subvention de projet (BB/H002278/1) et le Wellcome Trust Equipment Grant (073228/Z/03/Z) à AH
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Staining block | Brunel Microscope | ||
| Forceps No. 5 | Fine Science Tools | e.g. 11251-20 | |
| Tungsten needle: rod diameter, 0.5 mm; tip size, 1 μm; length, 2 inch | Roboz Surgical Instrument | RS-6065 | |
| Needle holder | Roboz Surgical Instrument | RS-6060 | |
| Arkansans stones: Repair Kit for Dumont Forceps | Fine Science Tools | 29000-00 | |
| 35 mm Petri dish with 27 mm glass base | Iwaki | 3930-035 | |
| Leica SP2-AOBS confocal inverted microscope with environment chamber | Leica | ||
| Reagent | |||
| Shield and Sang M3 insect medium (ecdysone free) | Sigma | S3652-500 ml | |
| Penicillin and streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | See 12 | ||
| FBS | Sigma | F7524 | |
| Poly-L-lysin | Sigma | P1399-25mg | |
| Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure | Polysciences | 04018-1 | |
| Mouse anti-glutamine synthetase antibodies | Millipore | MAB302 | |
| Rabbit anti-GFP antibodies | Life technologies | A11122 | |
| Mouse anti-REPO antibodies | Developmental Studies Hybridoma bank | 8D12 | |
| Rat anti-ELAV antibodies | Developmental Studies Hybridoma bank | 7E8A10 | |
| Rabbit anti-active caspase 3 antibodies | Abcam | ab13847 | |
| Normal goat serum | Vector Laboratories | S-1000 | |
| Anti-rabbit Alexa Fluor 488 | Life technologies | A11034 | |
| Anti-mouse Alexa Fluor 647 | Life technologies | A21236 | |
| Anti-rat Alexa Fluor 647 | Life technologies | A21247 | |
References
- Fang, Y., Soares, L., Teng, X., Geary, M., Bonini, N. M. A novel Drosophila model of nerve injury reveals an essential role of Nmnat in maintaining axonal integrity. Curr. Biol. 22, 590-595 (2012).
- Xiong, X., et al. Protein turnover of the Wallenda/DLK kinase regulates a retrograde response to axonal injury. J. Cell Biol. 191, 211-223 (2010).
- Leyssen, M., et al. Amyloid precursor protein promotes post-developmental neurite arborization in the Drosophila brain. EMBO J. 24, 2944-2955 (2005).
- Kato, K., Awasaki, T., Ito, K. Neuronal programmed cell death induces glial cell division in the adult Drosophila brain. Development. 136, 51-59 (2009).
- Ayaz, D., et al. Axonal injury and regeneration in the adult brain of Drosophila. J. Neurosci. 28, 6010-6021 (2008).
- Rohrbough, J., O'Dowd, D. K., Baines, R. A., Broadie, K. Cellular bases of behavioral plasticity: establishing and modifying synaptic circuits in the Drosophila genetic system. J. Neurobiol. 54, 254-271 (2003).
- Babcock, D. T., Landry, C., Galko, M. J. Cytokine signaling mediates UV-induced nociceptive sensitization in Drosophila larvae. Curr. Biol. 19, 799-806 (2009).
- Gomez-Marin, A., Louis, M. Active sensation during orientation behavior in the Drosophila larva: more sense than luck. Curr. Opin. Neurobiol. 22, 208-215 (2012).
- Schleyer, M., et al. A behavior-based circuit model of how outcome expectations organize learned behavior in larval Drosophila. Learn Mem. 18, 639-653 (2011).
- Brown, H. L., Cherbas, L., Cherbas, P., Truman, J. W. Use of time-lapse imaging and dominant negative receptors to dissect the steroid receptor control of neuronal remodeling in Drosophila. Development. 133, 275-285 (2006).
- Kato, K., Forero, M. G., Fenton, J. C., Hidalgo, A. The glial regenerative response to central nervous system injury is enabled by pros-notch and pros-NFkappaB feedback. PLoS Biol. 9, e1001133 (2011).
- Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. Drosophila protocols. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
- Morin, X., Daneman, R., Zavortink, M., Chia, W. A protein trap strategy to detect GFP-tagged proteins expressed from their endogenous loci in Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 15050-15055 (2001).
- Verkhusha, V. V., et al. An enhanced mutant of red fluorescent protein DsRed for double labeling and developmental timer of neural fiber bundle formation. J. Biol. Chem. 276, 29621-29624 (2001).
- Kato, K., Forero, M. G., Fenton, J. C., Hidalgo, A. The glial regenerative response to central nervous system injury is enabled by Pros-Notch and Pros-NFkB feedback. PLoS Biol. 9, e1001133 (2011).
- Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing: A Publication of the IEEE Signal Processing Society. 7, 27-41 (1998).
- Forero, M. G., Kato, K., Hidalgo, A. Automatic cell counting in vivo in the larval nervous system of Drosophila. J. Microsc. 46, 202-212 (2012).
- Forero, M. G., Pennack, J. A., Learte, A. R., Hidalgo, A. DeadEasy caspase: automatic counting of apoptotic cells in Drosophila. PLoS One. 4, e5441 (2009).
- Lai, S. L., Lee, T. Genetic mosaic with dual binary transcriptional systems in Drosophila. Nat. Neurosci. 9, 703-709 (2006).
- Potter, C. J., Tasic, B., Russler, E. V., Liang, L., Luo, L. The Q system: a repressible binary system for transgene expression, lineage tracing, and mosaic analysis. Cell. 141, 536-548 (2010).
- Nicolai, L. J., et al. Genetically encoded dendritic marker sheds light on neuronal connectivity in Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 20553-20558 (2010).
- Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nat. Methods. 6, 875-881 (2009).
