Summary
中枢神経系の再生および修復を調査するために、ショウジョウバエの幼虫腹神経索を用いた傷害のパラダイムが記載されている。意図的に開発されたソフトウェアと遺伝との定量的な分析と組み合わせタイムラプスおよび固定標本でレーザー走査共焦点顕微鏡法、続いて刺すことは中枢神経系の再生および修復の分子メカニズムを解明するために使用されます。
Abstract
実験方法は、フルーツフライショウジョウバエを用いた中枢神経系（CNS）損傷に対する細胞応答を調べるために開発されました。動物での修復および再生を理解することは、生物学の重要な問題である。損傷したヒトCNSは再生成し、再生を促進する方法を理解することは、医学的神経科学の主な目標の一つであることはありません。 ショウジョウバエの強力な遺伝子ツールキットは、中枢神経系再生の問題に取り組むために使用することができます。
中枢神経腹側神経索に病変は（VNC、脊椎動物の脊髄に相当）のタングステン針を使用して手動で適用されます。 VNCは、その後時間をかけて病変の発達をフォローアップするために24時間のためにレーザー走査共焦点顕微鏡を用いてタイムラプスで撮影することができます。あるいは、それは固定され、共焦点顕微鏡で神経細胞やグリア細胞を可視化する蛍光抗体を用いて染色し、培養することができる。 chaは、適切なマーカーを使用して傷害の結果として、細胞の形態や細胞の状態でNGESを可視化することができます。 ImageJのととわざわざプラグインを開発し、定量的·統計的分析は時間と細胞増殖と細胞死の傷害の影響の上に傷の大きさの変化を測定するために行うことができる。これらの方法は、大きなサンプルサイズの分析を可能にする。彼らは、CNS再生および修復の分子機構を調べるために、ショウジョウバエの強力な遺伝学と組み合わせることができます。
Introduction
動物での再生は、細胞が生物の成長を注文し、完了したときに感知する方法、および構造的完全性生物の達成と維持されていることが明らかになった。細胞のこれらの神秘的な能力を理解することは、生物学における大きな関心事である。再生を促進することは医学的神経科学のための主要な目標の一つです。ヒトでは、損傷した中枢神経系（CNS）が再生成されません。脊髄損傷の齧歯類モデルは、細胞が傷害に応答する方法を理解するために使用されています。しかし、倫理的な問題、コストの高さや動物のスローライフサイクルが進行を抑制する。
フルーツショウジョウバエは、発生生物学、神経科学で広く使われているモデル生物である。その強力な遺伝学的ツールと短いライフサイクルのおかげで、 ショウジョウバエは、反復的に、人間と病気の理解に関連性を持つ遺伝子の機能や遺伝子ネットワークの発見につながっている。進化詐欺の豊富な証拠があるヒトへのハエから遺伝子機能の保全。
近年、神経系損傷のためのいくつかのパラダイムはショウジョウバエにおいて確立されている。いくつかは、感覚1とモータ2軸索を含む末梢神経の軸索に沿って翼や実行末梢神経を損傷することで構成されています。しかし、末梢および中枢神経系は、多くの点で異なっており、それは、多くの動物では、末梢神経系は、中枢神経系ができないのに対し、再生成することが知られている。このように、中枢神経系の再生を理解するために、中枢神経系への直接傷害がより適切です。針で刺すような傷害が正常にけが3,4への応答を調べるために、ショウジョウバエの成体脳に適用されています。別のアプローチを使用して、Ayaz ら切断された中枢神経系のピエゾパワーmicrodissector培養した成人の脳の軸索し、4 日のために彼らの再生を分析した。これらの後の実験的な集合Uの利点psのは、彼らが大きな関心を集めて間違いなく脳に焦点を当てることです。欠点は、脳が運動感覚制御のみを扱い、VNC、より多く、より複雑であるということです。成体脳での作業もより時間がかかります。それが羽化のために約10日ほどかかり、その後それらの成熟のためにさらに5日間のに対し、幼虫は、4日間の実験の準備ができています。それを除去することが困難である厚いクチクラでカプセル化されているため、成人の脳は、処理するためにも、より難しいです。 VNCは、脊椎動物の脊髄と機能的に同等であることの更なる魅力を持っています。
ショウジョウバエの幼虫は、広く神経科学6-9モデル生物として使用されます。厳密に言えば幼虫発育段階にあるが、それはまた、完全に機能的な動物と見なすことができます。幼虫は歩行、嗅覚、味覚や痛覚などの複数の感覚、学習や記憶を持っています。このように、幼虫のVNCワットCNS損傷のための理想的なモデルとして選択として。
幼虫と蛹VNCsは依然として最大24時間、10〜のために細胞の完全性を維持し、皿に解剖し、培養することができる。これは、怪我は、その後、この期間以上にわたり、時間経過に記録することができ、VNC、に適用される、またはこの期間内の任意の時点で培養し、修正される可能性が示唆された。
ここでは、 ショウジョウバエの幼虫のVNCを使用してCNS損傷のための実験パラダイムを提示する。 VNCは第一幼虫から解剖され、刺すような損傷はタングステン針を使用して手動で適用されます。 VNCはその後グラスボトムカバースリップ上に置き、共焦点顕微鏡タイムラプスレーザーで撮影されています。あるいは、VNCsは所望の期間培養することができ、怪我の細胞効果は、免疫染色し、共焦点顕微鏡を用いた固定標本で解析することができます。創傷面積を測定し、細胞Nuの定量分析することができますmber（細胞増殖と細胞死）が意図的に開発されたソフトウェアを用いて行うことができる。大きなサンプルサイズが容易に統計学的に検証された結果で、その結果、処理することができます。これらのメソッドは正常にCNS傷害11〜グリア再生反応の根底にある遺伝子ネットワークを発見するための強力なショウジョウバエ遺伝学と統合されました。
Protocol
1。ステージングされた幼虫のコレクション
- 25℃で3時間貼り酵母の小さなスコップを添加した寒天とグレープジュースでシャーレに卵を産むための円筒状の風防ケージに入れ、15女性と15成人男性のハエ℃、プレート3-4回曜日を変更し、第1プレート（O / N卵産卵からIE）を捨てる。また初日からプレートを捨てる。 2日目から、25℃の卵でプレートを保つ卵を集めてから7日後、親ハエのセットアップ新しい始まります。
- 約24時間後、卵から幼虫が孵化。間伐絵筆でまたは鉗子のペアで幼虫をフックすることによって、ブドウ寒天から標準のフライ食品（10ミリリットル）（ 図1A）を含むバイアルに35幼虫を移す。
- 25℃で3日間幼虫（産卵後96時間、AEL）を含むバイアルを維持℃に
2。文化のための幼虫の腹側神経索の解剖
- ことを清掃70％エタノールでNCHと手。 70％エタノールで鉗子と針の4染色ブロック、2ペアを浸し、空気乾燥させます。
- （M3 PSエクジソン無料、1％ペニシリンおよびストレプトマイシンをシールドとサンヒョンM3の昆虫培地2mlをもう1つ、きれいにし、幼虫を掃除プールになるように蒸留水（DW）を使って1次メディアと4染色ブロックを準備腹側神経索（VNCs）を解剖したプールにM3のPS培地2mlでサード;;と刺すVNCsをM3へのPS培地2mlを持つ第四の幼虫を解剖するための媒体）。すべての試薬を室温に予め温めなければなりません。
- 96時間AELの幼虫を含むバイアルに水を追加します。その後、へらを使って、そっと濡れたペーパータオルに上のバイアルからの幼虫を餌を広げた。食べ物を洗い流してDWを含む染色ブロックに10幼虫を移してください。 DW 6回交換してください。次にM3のPS培地と交換してください。
- M3のPS培地2mlを含む染色ブロックに幼虫の1を移す。
- 解剖顕微鏡下で、ジ標準的な方法12を使用して慎重に幼虫の脳をssectが、組織の損傷を最小限に抑えるため、以下の方法で進めることで、特別な注意を払う。幼虫の背側を上に置き、鉗子の2ペア（それぞれの手で1つ）で前方端から3分の1に背側を保持します。前方部を保持しながら、鉗子で後端を引き離して、表皮を引き裂く。脳とVNCは前半の後縁から見えるはずです。慎重に体脂肪、腸、表皮を除去することによって、脳やVNCの複合体を単離する。 VNCsがあまりにも多くの被害を受けている場合、VNCsは怪我を刺しなくても、完全にまたは部分的に退化します。考慮に入れ、以下の点を取る：
- これはVNCを傷めますので、胸部のVNCから成虫および末梢神経を引っ張ったり、破れないようにしてください。末梢神経を切断するために、互いに近接して配置された鉗子2対の末梢神経を押しながら、ために神経を引っ張るCEPS。成虫と口の部分は、VNCに添付しておくことができます。
- 脳に接続されているリング腺やリンパ腺のままにしておきます。
- 過言ではない食品が含まれている、脳に最も近い時点で腸を切った。
- 先端はカットオフと少し広がったとP20のピペットマンを使用することにより、新鮮なM3のPS培地を含む染色ブロックにVNCを転送します。 VNCを転送する前に、最初のヒントに付着VNCを防ぐために、解剖の目的のみに使用される培地をピペッティングします。
3。 ショウジョウバエ幼虫VNCに傷害を刺す
このセクションでは、VNCsに刺すような傷害を実行すると、時間経過の解析と免疫染色のために刺さ-VNCsを準備する方法について説明します。ポスト刺す培養条件と期間は、第5条（タイムラプス解析用）および第6条（免疫染色用）で説明されています。
- 時間経過に十分なVNCs（4-5をプールした後、と）免疫染色のための24の上に、M3のPSを含むクリーンな染色ブロックに1 VNCを転送します。
- オリエントVNCはとても背神経網は、解剖顕微鏡（ 図1B）の下に表示されていること。これは、視神経のローブに接続したときに嘘をつくVNCsにとって最も自然な方向である。
- 刺す手動で直角に事実上背側から、解剖顕微鏡下でタングステン針を使用し、VNCの腹部の半分（ 図1B）を目指す。
以下に特に注意してください：
- 一度だけ刺す。
- 針刺すまでは、グラスの底を打つ。しかし、針の先端を損傷しないように注意してください。
- 持針器の茎が刺す時に媒体を触れてはならない。
- 傷は解剖顕微鏡下で可視ではありません。
注：刺し傷無関係変性
手順刺すような病変からVNC異なる内細胞変性をもたらすことができます。神経網の穴の変性の結果、たまに穴が非刺さ標本の皮質で観察されている。また、VNCの表面に影響を与える神経網または広範な変性に影響を及ぼす変性症検体は廃棄しなければならない。変性は、次のように識別することができます：
- 刺殺の22時間で、特に胸部の横/腹側領域での粗面、、。極端なケースでは、VNCが突出して見えます。
- 蛍光免疫染色によるバックグラウンド信号の穴のように見えることができます胸部神経網の穴または液胞。
4。針や鉗子のメンテナンス
- 日常的に針の先端が十分にシャープであるかどうかを確認します。針の先端は、いくつかの実験のためにそれを使用した後に曲がったり鈍することができます。このケースでは、アーカンソー州石または同等品を使用して先端をシャープに。
- 鉗子の先端を行う必要があり完璧に満たしています。ヒントは、使用に損傷を受けることができます。このケースでは、アーカンソー州石または同等品を使用して先端を調整します。
5。刺さVNCsの文化とタイムラプス録画
G9 13 - -リビングVNC、すべての軸索をラベル付けしGFPタンパク質トラップラインの軸索の神経網を可視化するために使用することができ、すべてのグリア細胞（正中グリア除く）を可視化するためにグリアドライバrepoGAL4はUASdsRedを表現するために使用することができますS197Y 14レポーター。交差点G9によってUASdsRedS197Yに飛ぶ;; repoGAL4ハエ、子孫の幼虫からVNCsは、生体組織に記録することができます緑の軸索とグリア赤で得られる。
- プーリング4-5 VNCs後、VNCのきれいな染色M3 PSの2ミリリットルを含むブロック、そして、スタブへの転送1 VNC腹部の半分は、セクション3で示されている。
- M3の1ミリリットルを含むポリ-L-リジンコートさ3.5ミリメートルのガラスボトムシャーレに刺さVNCを転送PS。 VNCs背側を下にして置きます。優しくVNCは皿に固執できるように鉗子の平らな面を使ってVNCを押してください。
- 穏やかに7.5％にFBSの最終濃度をレンダリングM3 PS 15％のFBSの1 mlを加える。
- レーザー走査共焦点顕微鏡法を用いて画像を取得する。その全体の厚さ全体のZセクションシリーズを収集し、VNCをスキャンします。我々は、温度制御された環境チャンバーとライカSP2倒立共焦点顕微鏡を使用していました。これらに相当する共焦点顕微鏡は動作するはずです、しかし、それは検索の設定の最適化を必要とするかもしれません。当社タイムラプス共焦点顕微鏡の設定は以下の通りであった：環境室の温度：25℃、4倍ズームと20倍対物レンズ、スキャンモードxyzt、512×512ピクセルの解像度では、z = 1μmステップ、1時間または2 - 時間間隔。
- ライカSP2共焦点顕微鏡は、走査型のファイルサイズには限界がある。これらの設定で、8月9日の時点でスキャンすることができます。とともに他の共焦点顕微鏡は、それはすなわち 、最大24時間までのスパンで、長い時間ポイントのために画像スタックを取得することが可能であるべきである。
6。刺さおよび固定VNCsの文化や免疫染色
- ウェルあたりM3 PS 7.5パーセントFBSの500μlを含む24ウェル組織培養プレートを準備します。
- 24ウェル組織培養皿のための24以上のVNCsの解剖を繰り返します。
- 先端カットオフとP20のピペットマンを使用することにより、ウェル当たり1 VNCを使用して、培養皿にプールから12非刺さVNCsを転送します。
- セクション3で説明したように、プール内VNCsの刺す残り。各ウェルにそれぞれ刺しVNCを転送します。
- 実験に応じて所望の持続時間のために25℃のインキュベーター内で24ウェル皿を置きます。細胞の完全性は、少なくとも24時間、変更されません。
- 培養後、先端のカットオフとP20のピペットマンを用いて1.5 mlチューブで4％ホルムアルデヒドPEMの250μlの12 VNCsを転送します。その後、fixatiVEは慎重VNCsを傷つけないように注意しながら、外にピペッティングします。サンプルをカバーするのに十分な固定剤の少量を各チューブに残るべきである。その後、新鮮な固定液を追加して、穏やかに室温で50分間攪拌する。
- 0.3パーセントのTriton X PBSで2回すすぎ、その後室温で0.3％トリトンX PBSで10分間2回洗浄する。
- 室温で1時間、0.3％トリトンX PBS中の10％正常ヤギ血清と共にインキュベートすることによりブロックVNCs。サンプルは、少なくとも1ヶ月間、4℃で保存することができます。
- 4℃以上20時間一次抗体とともにVNCsをインキュベート℃に
- 室温で0.3％トリトンX PBSで10分間3回洗浄した後、0.3％トリトンX PBSで2回すすいでください。
- 4℃以上で16時間二次抗体とVNCsをインキュベート℃に
- 0.3パーセントのTriton X PBSで2回すすぎ、次いで室温RT（暗闇の中で蛍光二次抗体を使用している場合）で0.3％のTriton X PBSで10分間3回洗浄します。
- 少なくとも、50％PBS：50％グリセロールを含むPBSを交換してください時間。
- その後、80％グリセロールで置き換える：20％PBSを少なくとも1時間。
- 顕微鏡のスライドガラス上のチェロテープの2層（約0.06ミリメートル）で行われたウィンドウにVNCをマウントします。向きを調整して、ウィンドウの上にカバーグラス（18×18 mm）を配置します。二つVNCsは、このメソッドを使用してスライドにマウントすることができます。
一次抗体のさまざまな方法を使って、怪我に異なる細胞応答（細胞数および細胞の形状変化など ）を分析することができる。
7。 ImageJとプラグインの範囲を使用してデータを分析
VNCは無関係変性を刺していない場合は、サンプルは病変の大きさにかかわらず、分析のためにカウントする必要があります。刺殺は手動で行うように、病変の大きさはその都度異なります。したがって、統計的には可能な限り、刺すことの効果を分析することが重要です。
- サイズ測定を巻いた。傷の大きさは、修理15の指標である。刺すような病変は、GFPの発現を欠くとして表示されます。次のように病変領域は、自由に利用できるImageJのソフトウェアを使用して失効データを測定することができる：
- ImageJを使って、 "ファイル"メニューから、共焦点画像スタックを開き、 "インポート"を選択し、ここから "画像シーケンス"を選択します。これはスタックに個々のイメージのコレクションを向けるだろう。
- 次に "イメージ"メニューに移動して "Hyperstack"に "スタック"を変更、 "Hyperstack"を選択し、 "Hyperstackにスタック"を選択します。
- "イメージ"メニューから "プロパティ"を使用してボクセルサイズを設定します。ライカSP2共焦点顕微鏡を用いて取得したデータでは、ボクセルサイズは、走査ソフトウェアから、画像と一緒に保存されたメタデータのテキストファイルから取得することができます。第3節で説明したように我々の設定では、ピクセル寸法は、xy = 0.366211程度とz = 0.99709程度である。
- 1時点のすべてのスライスを調べることによって、ツール·バーに多角選択ツールで病変領域の最大輪郭を描画します。これは関心領域（ROI）。
- メニューの "分析"に行くことによって、ROIマネージャーにROIを追加し、 "追加"、スクロールダウンして、 "ツール"、次に "ROIマネージャー"を選択します。
- すべての時点にこれを繰り返します。
- 各ROIの領域のサイズを取得するためのROIマネージャーに "測定"ボタンをクリックします。
- タイムラプス録画時にVNCの動きの補正。 "Stackreg"と"Turboreg"プラグイン16（ImageJのウェブサイトからhttp://rsbweb.nih.gov/ij/ ）：これらのプラグインは、時間経過の間に少量のサンプルの動きを補正することができます。すべての時間のポイントを通って同等の代表光学部を使用してスタックを構築し、プラグインを適用します。それは、時間の経過とともにどのように変化する病変を可視化するのに役立ちます。これらのメソッドの詳細については、取扱説明書では、これらのプラグインを開発した研究グループから提供されています。 （ http://bigwww.epfl.cH / thevenaz / stackreg /）。
- グリア細胞の自動カウント。 "DeadEasyグリア"プラグイン（ www.biosciences-labs.bham.ac.uk/hidalgo/Software.html ）：これは、 ショウジョウバエの幼虫のVNCのレポ陽性グリア細胞の数をカウントするとグリアの変化を調べるために開発されました数が17を刺した傷害によって引き起こされる。プラグインは、0.1パーセント、偽陽性、4.3％偽陰性17のエラーで、正確に動作します。このプラグインは、最初のラベルに抗REPO抗体で免疫蛍光を用いて検体中のすべてのグリア（正中線を除く）を使用します。その後、プラグインをインストールしImageJの中で、共焦点画像スタックを開き、プラグインが実行されます。これは、約30秒後に自動的にグリア細胞をカウントします。
- アポトーシス細胞の自動カウント。 "DeadEasyカスパーゼの幼虫"プラグイン（ www.biosciences-labs.bham.ac.uk/hidalgo/Software.html）18：これは、抗切断され、カスパーゼで標識された細胞の数をカウントするために開発され、新しいバージョンが幼虫VNCs用に脚色された。刺すような傷害は、プログラムされた細胞死11の増加を引き起こす。 、このプラグインは抗切断さカスパーゼ-3抗体で免疫蛍光を用いて試料の最初のラベルアポトーシス細胞を使用します。その後、プラグインをインストールしImageJの中で、共焦点画像スタックを開き、プラグインが実行されます。これは、約30秒後に自動的にアポトーシス細胞をカウントします。
8。試薬
- 培地：シールドとサンヒョンM3の昆虫培地、7.5％ウシ胎児血清、1％ペニシリン及び1％ストレプトマイシン。
- 無菌DWの0.01パーセントポリ-L-リジン。
- 固定：4％ホルムアルデヒド、PEMの超純（0.1Mパイプ、2mMのEGTA、1mMのMgSO 4）し、ソリューションを提供します。
- 免疫染色用ブロッキング液：0.3％トリトンX PBS中の10％正常ヤギ血清。
- アンチグルタミンシンテ2抗体：ブロッキング溶液で1:250。
- 抗GFP抗体：ブロッキング溶液で1:1000。
- 抗REPO抗体：ブロッキング溶液で1:250。
- 抗ELAV抗体：ブロッキング溶液で1:250。
- 抗切断カスパーゼ3抗体：ブロッキング溶液で1:1000。
- 二次抗体：ブロッキング溶液で1:250。
Representative Results
ここでは、 ショウジョウバエの幼虫のVNCに刺すような傷害を行い、時間経過を用いて、共焦点蛍光顕微鏡を免疫染色傷害に対する細胞応答を分析する方法を示しています。
タイムラプスデータでは、病変はG9軸索のマーカー（ 図2）を有する標本の神経網内のGFP陰性領域として可視化される。刺殺後まもなく、小さなGFP陰性領域、穴または液胞のように見えます（ 図2A）現れ始めます。 GFP陰性などの分野は、一般的に（ 図2A）刺殺後に8から6の周りに時間まで拡大します。 （ 図2B）続いて、GFP陰性領域は縮小しても消えることがあります。 22刺殺後のHRによって、傷が占める面積は、一般的に最大の面積よりも小さくなっている（ 図2A、B）を刺殺後6〜8時間であった。同様にグリア突起でのDsRed陰性領域は当初、あまりに増えますが、shrin刺殺後22時間、カンザス。興味深いことに、しばしばDsRedの陽性グリアプロセスが彼らの前に失踪（ 図2C）に神経網におけるGFP陰性の穴を埋める。
固定標本で免疫染色を用いて、微細なグリア突起やけがへの彼らの応答はタイムラプスイメージを持つより良い分解能で可視化することができる。これは、すべてのグリア細胞（グリア正中線を除く）を可視化するためにハエにおける膜繋留レポーター（ 例えば UAS-mCD8GFP）の発現を誘導することがrepoGAL4グリアドライバを使用して、例えば、実行することができます。これはまた、神経網に関連するグリア細胞（ 図3A、B）ラベル抗GS2などの他のグリアマーカーと組み合わせることができます。ここでは、腹側神経索が腹側に凹み（ 図3A、矢頭）に傷害の結果を刺し、背側から刺しているがことを示している。刺すようにもっと厳しく神経網と神経網関連グリア細胞番目に影響を与えるように見える表面および皮質グリア細胞（ 図3B）。グリア突起は、彼らはまだ皮質の組織のように自分のメッシュを維持する一方で、神経網の混乱が表示されます。残骸の破片のように正常な細胞とは区別されGS2陽性細胞の破片で負傷の結果は非常に小さく、電池本体に接続されていない。これは、神経網関連グリア細胞（ 図3B）への損傷を明らかにする。変性神経網関連グリア細胞は、電子顕微鏡15で観察した。抗切断さカスパーゼ3 +アポトーシス染色は、彼らが怪我を刺した際にアポトーシスを示す、神経網に関連するグリア細胞15に観察される。神経網関連するグリア細胞は神経細胞の破片15を貪食することが示された、とGS2 +信号はまた、グリア突起によるアポトーシスニューロンの貪食を明らかにするかもしれない。切断されたカスパーゼ+アポトーシス細胞はまた、（少なくともElav +ニューロンに対応するそのうちのいくつかは、皮質で観察される 固定された試料を用いて、免疫染色してもそのような増殖とアポトーシスの効果として、傷害に対する細胞応答の定量的な分析を可能にします。このため、我々は意図的に、それぞれ自動的にグリア細胞とアポトーシス細胞の数をカウントするために、2 ImageJのプラグイン、DeadEasyカスパーゼの幼虫とDeadEasyグリアを開発しました。彼らは幼虫VNCs上で動作するように検証され、非常に正確であるされています。これらの使用して、それは22時間（ 図4A）15によって、刺す傷害によって引き起こされるREPO陽性グリア細胞の数の増加を観察することができる。 6時間後の刺殺（ 図4B）15による抗切断されたカスパーゼ-3アポトーシス細胞数の増加もあります。 ショウジョウバエ中枢神経系の損傷に応答して、グリア増殖とアポトーシスのような増加は、脊椎動物の中枢神経系における傷害応答を彷彿とさせる。 このプロの重要な側面トコールはVNC解剖の品質です。 VNCsがプロセス中に損傷されたか否かを解剖時に見分けるのは困難です。穏やかな解剖を実行するために特定の世話をすることが重要です。しかし、質の悪いサンプルは必然的に生産され、それが、これらは後の段階で特定され、破棄されることが不可欠であることでしょう。我々の手には、VNC変性が怪我とは無関係のように見えるのではなく、ラフ解剖によって引き起こされる。私たちは、怪我の傷で臨界サイズは確認されていません、我々は劣化していないすべての傷ついたサンプルを分析する。 VNCsの整合性を維持する場合には、VNCの表面は滑らかで光沢の見える傾向があり、神経網に穴が（ 図5A）が観察されていません。 VNCsの劣化がVNCの腹と横の領域（ 図5B）の粗面から24時間後の解剖によって認識することができます。刺す傷害とは関係のない神経網の劣化も発生することがあります、それは神経網hとして認識されている免疫染色標本のバックグラウンドシグナルのoles。変性のこれらの徴候を有する試料（ 図5C）を捨てなければなりません。我々の手で、無傷で刺さ制御（YW）ハエの解剖や怪我の成功率は、両方の約70％である。この速度は、実験を行う人のスキルに応じて変化し、遺伝子型となります。 
図1。幼虫のステージングと刺す傷害の模式図。（）0日目に、ハエは3時間グレープジュースペトリ皿に卵を産むために許可されています。 1日目、孵化1齢幼虫（L1）が収集され、それらは別の3日間保持されている標準のイーストフードを含むバイアルに入れ。 4日目に、幼虫は食物バイアルから収集され、刺すような実験のために使用。幼虫の中枢神経系（B）は側面図を。腹神経索の腹部は背側から針で刺されています。前方は左に、右後方に。 
図2。 VNCの病変の経時的進行。GFP標識軸索およびDsRed標識グリア細胞とのライブVNCs上の共焦点顕微鏡。遺伝子型：UASDsRed / +; G9 / +; repoGAL4 / +（A）の病変は軸索の神経網に蛍光の欠如によって認識されています。刺殺後、GFP陰性の穴が、その後大きさと数を増し、表示されます。刺殺後の9時間から傷害を刺した後の各時点から5光学部の突起が。（B）は軸索の神経網病変が縮小。これらの画像は、けがを刺した後の異なる時点から単一の光学切片です。各試料中の同等の位置、eaから同じスライス番号を識別するにはタイムラプスデータのスタック内のchの時点が選ばれました。刺殺で影響を受けない領域でG9とrepoGAL4> UASmCD8GFPで可視化したパターンを比較することにより、スライスがZ軸で同等の位置からのものであると確認した。の破線は、（A、B）は傷の縁を表しています。神経網の傷（C）の高倍率。 GFP陰性穴がDsRedの陽性グリア突起で埋め、その後（矢じり）消失した。水平方向のビュー。前方まで。 
図3。 VNCの病変の細胞特性評価。抗GFP及び抗GS2、神経網に関連するグリア細胞のマーカーで染色したすべてのグリア細胞（グリア正中線を除く）の膜係留GFPレポーターを冠しVNCs。遺伝子型：+ / +; UASmCD8GFP / +; repoGAL4 / +（A）VNCsはDORから刺されたサル側が、これは腹へこませる（矢頭）。単一の光学切片のサジタルビュー、最大背部および前部左側。（A、B）は刺し損傷は皮質表面とグリア細胞より厳しく神経網に関連するグリア細胞に影響を与えます。 GS2陽性細胞の破片で負傷の結果（Bの矢印）。単一の光学切片（B）の水平方向のビュー、前方まで。矢じりはGS2を指す+細胞破片を（C）アポトーシスマーカー抗切断さカスパーゼ-3および神経マーカー傷害によって皮質の死細胞のいくつかは、ニューロンがあることを示す抗ElavのColocalisation。 NP、神経網、CX、皮質。 
図4。 DeadEasyを使用してグリア細胞とアポトーシス細胞の自動カウント。REPOが正カウントする'DeadEasy幼虫グリア'を使用しての（）例グリア細胞。左：抗REPO抗体で染色し、VNC腹半分、真ん中：プラグインによって同定された細胞を示すDeadEasy幼虫グリアからの出力、右：マージは。右側の数字は、約30秒での光共焦点セクションのスタック全体で自動的にカウントREPO陽性細胞の数です。刺さVNCsにおけるグリアの数が増加する。 'DeadEasyカスパーゼ幼虫'を使用して（B）の例。左：抗切断されたカスパーゼ3抗体で染色し、共焦点光学5節の突起;真ん中：プラグインによって同定された細胞を示す出力、右：マージ。右側の数字は、約30秒での光共焦点セクションのスタック全体で自動的にカウントカスパーゼ陽性細胞の数です。アポトーシス細胞の数が刺さVNCをして増加する。 
図5。 degeneratの例イオン（A）健康なVNC。変性の兆候はありません。（B）は胸郭の側が刺さ検体中の変性（矢印）です。アスタリスクは、病変部位を示します（C）胸部神経網に穴（白矢頭）と皮質（オレンジ矢印）VNC非刺さインチ損傷した神経網と豊富な空胞変性を有する試料を捨てなければなりません。ここVNCsは神経網関連するグリアマーカー抗エボニーで染色した。水平方向のビュー、前方まで。
Discussion
私たちは、負傷、修復及び再生に対する細胞応答を調べるために、ショウジョウバエの幼虫の中枢神経系に損傷を刺すためのプロトコルを確立しています。幼虫VNCsを切開し、それらがタイムラプス顕微鏡で撮影またはグリアおよびニューロンアポトーシスまたは細胞分裂を可視化する蛍光免疫染色のために固定された後、刺されています。時間をかけて病変の進行を測定することができます。このメソッドは、負傷時や修理時の細胞数の変化を定量的·統計的分析のために意図的に開発されたソフトウェアが付属しています。
我々は前蛹と成虫その後フライに移行するために、96時間AEL幼虫（これらは、固定またはさらに発展させた）、発達段階を刺した。広告のそれと類似しており、神経系は、すでに完全に機能している、彼らは3齢段階の真ん中にあり、したがって、まだ蛹化を受けていません、96時間後に、VNCsは刺すために十分な大きさULT。それは少し後の幼虫で刺すことが可能かもしれないと正確なタイミングは、研究課題に合わせて選択する必要があります。しかし、対処の質問に応じて、それは一般的傷害に対する細胞応答を観察するために、しばらくの間、文化VNCsをする必要があろう。 120時間AELの蛹化後しばらくは、中枢神経系を改造している期間が開始され、このように避けた方が良い。したがって幼虫にプラス文化を刺すための時間枠はむしろ制限されています。幼虫を使うことはまだ成人を使用する上で、大きな技術的利点を持っています同様に成人に、一方で、神経系が損傷への応答を分析し、すでに幼虫のかなり簡単かつ迅速に、完全に機能されています。
皿の中で培養することなく、同等の後の時点で切開しVNCsに皿に解剖し、培養脳とVNCsの大きさと形態を比較すると、その開発は、in vivoでより文化の速度が遅くなって表示されます。他の点では、開発は、通常、培養液中で、組織の整合性が保持され、細胞が生きている複数の応答を示している上に運びます。傷の拡大、神経網の修理やグリア増殖は22時間後に刺す内で行われます。これは傷害に対する細胞応答が文化で行われ、その日よりも長い間外植体を維持する必要がない可能性が最も高いがあることを示している。長期的な文化が望まれている場合、プロトコルは培養プレートインサート5を使用するなど、さらなる最適化が必要な場合があります。
変性のものから良質のサンプルを特定することが重要である。このプロトコルを最適化することは、いくつかのスキルを取得して、必然的に変性がいくつかの標本で発生します。 VNCは、組織の完全性（ 図5B）の内訳を反映して"カリフラワー"外観を取得することができます。変性も無傷、非刺さ標本（ 図5Cに存在することができる刺すの独立してVNCの空胞化、によって認識されている
このプロトコルでは、伝統的な、GAL4-UASシステムを使用してグリアプロセスの可視化と並行して神経網を可視化するためにハエのタンパク質トラップラインを利用しました。これらのツールはまた、LEなど他のバイナリの発現系と組み合わせることができるGAL4の独立しているXA 19とQ-システム20。これは、損傷に応答して、軸索とグリア突起の間に例えば相互作用の解析を可能にするでしょう。さらに、樹状突起21又はカルシウム流入22の記者のような他の遺伝学的ツールを組み合わせることで、この方法は、CNSのグリア細胞、神経軸索と樹状突起の傷害応答の背後細胞生物学を分析するための絶好の機会を提供しています。最後に、この方法は、傷害と再生への応答における遺伝子機能をテストするために、標準的な遺伝学、突然変異や遺伝子の過剰発現と組み合わせることができます。
このプロトコルは、正常にCNS傷害11〜回生グリア応答の根底にある遺伝子ネットワークの発見につながっている。これらの細胞事象とフルーツハエの遺伝子の機能を解明し、遺伝子機能の進化的保存性考えるとミリアンペアの理解に重要な洞察を提供しそうです傷害と再生へmmalian CNSのレスポンス。
Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
私たちは、この作業の過程を通して原稿とその議論のための私たちの研究室の他のメンバーの批判的な読みのためにメイ·アン·リムに感謝します。この作品は、山田科学財団と王立協会ショートビジットフェローシップとKKに対するEUのマリー·キュリー国際着信フェローシップGRR、とBBSRCプロジェクト無償（BB/H002278/1）とウェルカムトラスト機器グラント（073228/Z/03/Z）によって賄われていたAHに
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Staining block | Brunel Microscope | ||
| Forceps No. 5 | Fine Science Tools | e.g. 11251-20 | |
| Tungsten needle: rod diameter, 0.5 mm; tip size, 1 μm; length, 2 inch | Roboz Surgical Instrument | RS-6065 | |
| Needle holder | Roboz Surgical Instrument | RS-6060 | |
| Arkansans stones: Repair Kit for Dumont Forceps | Fine Science Tools | 29000-00 | |
| 35 mm Petri dish with 27 mm glass base | Iwaki | 3930-035 | |
| Leica SP2-AOBS confocal inverted microscope with environment chamber | Leica | ||
| Reagent | |||
| Shield and Sang M3 insect medium (ecdysone free) | Sigma | S3652-500 ml | |
| Penicillin and streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | See 12 | ||
| FBS | Sigma | F7524 | |
| Poly-L-lysin | Sigma | P1399-25mg | |
| Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure | Polysciences | 04018-1 | |
| Mouse anti-glutamine synthetase antibodies | Millipore | MAB302 | |
| Rabbit anti-GFP antibodies | Life technologies | A11122 | |
| Mouse anti-REPO antibodies | Developmental Studies Hybridoma bank | 8D12 | |
| Rat anti-ELAV antibodies | Developmental Studies Hybridoma bank | 7E8A10 | |
| Rabbit anti-active caspase 3 antibodies | Abcam | ab13847 | |
| Normal goat serum | Vector Laboratories | S-1000 | |
| Anti-rabbit Alexa Fluor 488 | Life technologies | A11034 | |
| Anti-mouse Alexa Fluor 647 | Life technologies | A21236 | |
| Anti-rat Alexa Fluor 647 | Life technologies | A21247 | |
References
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