Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

والنموذج الإصابات المعنية بالتحقيق في وسط الجهاز العصبي في إصلاح Published: March 28, 2013 doi: 10.3791/50306
Automatic Translation
1, 1
1Neurodevelopment Group, School of Biosciences, University of Birmingham

Summary

ويوصف نموذج باستخدام اليرقات إصابة الحبل العصبي البطني ذبابة الفاكهة للتحقيق المركزية تجديد الجهاز العصبي والإصلاح. طعن تليها الليزر المجهر متحد البؤر في الوقت الفاصل بين العينات والثابتة، بالإضافة إلى التحليل الكمي مع البرمجيات المتقدمة هادف وعلم الوراثة، وتستخدم للتحقيق في الآليات الجزيئية للتجديد وإصلاح CNS.

Abstract

وقد تم وضع المنهج التجريبي للتحقيق في الاستجابات الخلوية لنظام العصبي المركزي (CNS) إصابة ذبابة الفاكهة باستخدام الفاكهة ذبابة. إصلاح وتجديد الفهم في الحيوانات هو السؤال الرئيسي في علم الأحياء. الجهاز العصبي المركزي التالفة الإنسان لا تجديد، وفهم كيفية تعزيز التجدد هو واحد من الأهداف الرئيسية لعلم الأعصاب الطبية. ويمكن استخدام مجموعة الأدوات القوية الوراثي للذبابة الفاكهة لمعالجة مشكلة تجديد الجهاز العصبي المركزي.

يتم تطبيق آفة في العصب الحبل البطني CNS (VNC، أي ما يعادل الحبل الشوكي الفقاريات) يدويا باستخدام إبرة التنغستن. يمكن بعد ذلك يتم تصويره في VNC مرور الزمن باستخدام الليزر المجهري متحد البؤر المسح الضوئي لمدة تصل إلى 24 ساعة لمتابعة تطور الآفة مع مرور الوقت. وبدلا من ذلك، يمكن تربيتها عليه، ثم إصلاح وملطخة باستخدام المناعي لتصور الخلايا العصبية والخلايا الدبقية مع المجهري متحد البؤر. استخدام علامات المناسبة، تشايمكن nges في شكل الخلية والخلية الدولة نتيجة الإصابة يمكن تصور. مع يماغيج وضعت عمدا المكونات الإضافية، يمكن أن يتم التحليل الكمي والإحصائي إلى قياس التغيرات في حجم الجرح مع مرور الوقت وآثار إصابة في تكاثر الخلايا وموت الخلايا. تسمح هذه الطرق تحليل عينات كبيرة الحجم. ويمكن الجمع بينها وبين علم الوراثة قوية من ذبابة الفاكهة للتحقيق في الآليات الجزيئية الكامنة وراء CNS التجديد والإصلاح.

Introduction

التجديد في الحيوانات تكشف أن خلايا الإحساس عند الكائن الحي وأمرت النمو الكامل، وكيف الهيكلية سلامة الكائن الحي ويتم تحقيق والمحافظة عليها. فهم هذه القدرات غامضة من الخلايا هي ذات أهمية كبيرة في علم الأحياء. تعزيز التجدد هو واحد من الأهداف الرئيسية لعلم الأعصاب الطبية. في البشر، وتلف الجهاز العصبي المركزي (CNS) لا تجديد. وتستخدم نماذج القوارض من إصابة الحبل الشوكي لفهم كيفية استجابة الخلايا للإصابة. ومع ذلك، الشواغل الأخلاقية، والتكاليف العالية ودورة حياة هذه الحيوانات البطيئة للتقيد التقدم.

وذبابة الفاكهة ذبابة الفاكهة هو كائن النموذج المستخدم على نطاق واسع في البيولوجيا التطورية وعلم الأعصاب. بفضل أدواته الوراثية قوية ودورة حياة قصيرة، وأدى ذبابة الفاكهة متكرر لاكتشاف وظائف الجينات والجينات ذات الأهمية الشبكات لفهم البشر والمرض. هناك أدلة وفيرة من يخدع التطوريةservation وظيفة الجين من الذباب للإنسان.

خلال السنوات الأخيرة، تم إنشاء العديد من النماذج لإصابة الجهاز العصبي في ذبابة الفاكهة. بعض تتكون من إتلاف الأعصاب الطرفية التي تعمل على طول الجناح أو axotomy من الأعصاب الطرفية، بما في ذلك 1 الحسية والحركية محاور عصبية 2. ومع ذلك، فإن أنظمة الطرفية والجهاز العصبي المركزي تختلف في كثير من النواحي، وكما هو معروف جيدا أن العديد من الحيوانات في النظام العصبي الطرفي يمكن تجديد في حين أن CNS لا يمكن. وبالتالي، لفهم CNS التجديد، والإصابة المباشرة للCNS هو أكثر ملاءمة. وقد طعن الإصابة بإبرة تطبيقها بنجاح إلى الدماغ الكبار ذبابة الفاكهة للتحقيق في استجابة لإصابة 3،4. باستخدام نهج آخر، وتحليلها عياض وآخرون. CNS قطعت محاور عصبية في أدمغة البالغين مثقف مع السلطة microdissector بيزو، والتجديد لهم لمدة 4 أيام 5. وميزة هذه المجموعة التجريبية ش في وقت لاحقملاحظة هو أنها تركز على الدماغ، والتي هي بلا شك ذات أهمية كبيرة. العيب هو أن الدماغ هو أكثر بكثير تعقيدا من VNC، الذي يتعامل فقط مع المحرك والسيطرة الحسية. العمل على الدماغ الكبار هو أيضا أكثر مضيعة للوقت. اليرقة مستعدة لاجراء تجارب في 4 أيام، في حين يستغرق حوالي 10 يوما لeclosion الكبار، ومن ثم 5 أيام إضافية للنضوج الخاصة بهم. الدماغ الكبار هو أيضا أكثر صعوبة في التعامل معها، لأن ذلك يتم تغليف في إهاب سميكة، والتي من الصعب إزالتها. وVNC لديه الجذب مزيد من كونه وظيفيا إلى الحبل الشوكي الفقاريات.

ويستخدم على نطاق واسع يرقة ذبابة الفاكهة كما كائن نموذج لعلم الأعصاب 6-9. بالمعنى الدقيق للكلمة على الرغم من اليرقة في مرحلة النمو، فإنه يمكن أيضا أن تعتبر الحيوانات تعمل بكامل طاقتها. اليرقة لديها الحركة والحواس متعددة بما في ذلك الذوق، الشم وحس الألم، والتعلم والذاكرة. وهكذا، فإن اليرقات VNC ثكما اختارت النموذج المثالي للإصابة الجهاز العصبي المركزي.

ويمكن تشريح VNCs اليرقات والعذارى ومثقف في الطبق، لا يزال الإبقاء على سلامة الخلوية لمدة تصل إلى 24 ساعة 10. واقترح هذا ويمكن تطبيق ذلك إصابة VNC، والتي يمكن بعد ذلك سجلت في مرور الزمن لأكثر من هذه الفترة من الزمن، أو مستنبت وثابتة في أي لحظة الوقت المطلوب خلال هذه الفترة.

هنا، نقدم لنموذج تجريبي لإصابة الجهاز العصبي المركزي باستخدام اليرقات ذبابة الفاكهة VNC. يتم تشريح أولا VNC من يرقة، ويتم تطبيق إصابة طعن يدويا باستخدام إبرة التنغستن. ثم يتم وضع VNC على ساترة الزجاج القاع، وصورت مع مرور الزمن ليزر متحد البؤر المجهر. وبدلا من ذلك، يمكن للمثقف VNCs لفترة من الوقت المطلوب، ويمكن تحليل آثار الإصابة الخلوية في العينات الثابتة باستخدام المجهر متحد البؤر والمناعية. ويمكن قياس منطقة الجرح، والتحليل الكمي من خلية نويمكن أن يتم mber (تكاثر الخلايا وموت الخلايا) خارجا مع البرمجيات المتقدمة عمدا. ويمكن التعامل مع أحجام عينة كبيرة بسهولة، مما أدى إلى نتائج التحقق من صحة إحصائيا. وقد تم الجمع بين هذه الأساليب بنجاح مع علم الوراثة قوية من ذبابة الفاكهة لاكتشاف الجينات التي تقوم عليها شبكة الاستجابة الدبقية التجدد إلى إصابة الجهاز العصبي المركزي 11.

Protocol

1. أقام مجموعة من يرقات

  1. 15 مكان الإناث و 15 من الذكور البالغين الذباب في قفص اسطواني البرسبيكس لوضع البيض على طبق بتري مع أجار وعصير العنب تستكمل مع مغرفة صغيرة من الخميرة لصق لمدة 3 ساعة عند 25 ° C. تغيير لوحة 3-4 مرات في اليوم، وتجاهل لوحة الأولى (أي من الاستغناء عن البيض O / N). تجاهل أيضا لوحات من اليوم الأول. من يوم الثاني على التوالي، والحفاظ على لوحات مع البيض عند 25 ° C. بعد 7 أيام من جمع البيض، تبدأ مع إعداد جديدة من الذباب الأصل.
  2. بعد حوالي 24 ساعة، تفقس اليرقات من البيض. من خلال تركيب اليرقات مع الرسام ضعيفة أو مع زوج من ملقط، ونقل 35 من اليرقات أجار العنب إلى قارورة تحتوي على ذبابة القياسية الغذائية (10 مل) (الشكل 1A).
  3. قارورة تحتوي على الحفاظ على اليرقات لمدة 3 أيام (96 ساعة بعد وضع البيض، AEL) في 25 ° C.

2. تشريح اليرقات حبال الاعصاب الاماميه للثقافة

  1. تنظيف يكونNCH ​​واليدين مع الايثانول 70٪. نقع بنات تلوين 4، 2 أزواج من ملقط وإبرة مع الايثانول 70٪، والسماح الهواء الجاف.
  2. إعداد كتل تلطيخ 4 مع وسائل الإعلام التالية: واحد مع الماء المقطر (DW) لتنظيف وتنظيف بركة اليرقات؛ لثانية واحدة مع 2 مل من درع والمتوسطة سانغ M3 الحشرات مع البنسلين والستربتوميسين 1٪، إكديسون خالية (M3 PS متوسطة) لتشريح اليرقات؛ الهدف الثالث من 2 مل من المتوسط ​​PS M3 لتجميع تشريح الأعصاب البطنية الحبال (VNCs)؛ ورابعة مع 2 مل من المتوسط ​​PS M3 طعن VNCs. يجب على كل من الكواشف قبل تحسنت لRT.
  3. إضافة الماء إلى قارورة تحتوي على يرقات AEL 96 ساعة. ثم، وذلك باستخدام ملعقة، وانتشار المواد الغذائية بلطف مع اليرقات من القارورة على منشفة ورقية لالرطب. تحويل 10 اليرقات إلى كتلة تحتوي على تلطيخ DW أن يغسل الطعام. استبدال DW 6 مرات. ثم استبدال المتوسطة مع PS M3.
  4. نقل واحدة من اليرقات إلى كتلة تلطيخ تحتوي على 2 مل من المتوسط ​​PS M3.
  5. تحت المجهر تشريح، ديssect في الدماغ باستخدام اليرقات بعناية الطرق القياسية 12، ولكن للحد من تلف الأنسجة، ورعاية خاصة من قبل الشروع بالطريقة التالية. وضع الجانب الظهري يرقة يصل، والاستمرار على الجانب الظهري في ثلث من نهاية الأمامي مع 2 أزواج من ملقط (واحد في كل يد). في حين عقد القسم الأمامي، وسحب بعيدا نهاية الخلفي مع ملقط، والمسيل للدموع البشرة. يجب الدماغ وVNC على أن تكون واضحة من على حافة الخلفي من النصف الأمامي. عزل بعناية الدماغ ومعقدة VNC عن طريق إزالة الدهون في الجسم، والقناة الهضمية البشرة. عندما تلف VNCs أكثر من اللازم، فإن VNCs تتحول كليا أو جزئيا حتى من دون طعن الاصابة. تأخذ في الاعتبار النقاط التالية:
  • لا سحب أو تمزيق أقراص تخيلي والأعصاب الطرفية من VNC الصدري حيث سيؤدي ذلك إلى تلف VNC. لقطع الأعصاب الطرفية، عقد الأعصاب الطرفية مع اثنين من أزواج من ملقط وضعت وثيقة بعضها البعض، ومن ثم سحب الأعصاب مع لالفطر الابيض. يمكن ترك أقراص تخيلي وأجزاء الفم التي تعلق على VNC.
  • مغادرة الغدة الليمفاوية والغدة حلقة تعلق على الدماغ.
  • قطع الوتر عند نقطة أقرب إلى الدماغ، حيث يرد الغذاء ليس كثيرا.
  1. باستخدام pipetman P20 مع طرف قطع واتسعت قليلا، نقل VNC إلى كتلة جديدة تحتوي على تلطيخ المتوسطة PS M3. قبل نقل ماصة VNC الأولى، صعودا وهبوطا إلا وسيلة تستخدم لتشريح من أجل منع VNC من الالتصاق إلى الحافة.

3. طعن إصابة في VNC اليرقات ذبابة الفاكهة

يصف هذا القسم كيفية تنفيذ إصابة طعن إلى VNCs، وإعداد طعن-VNCs الوقت الفاصل بين لتحليل والمناعية. وصفت ظروف ثقافة ما بعد طعن ومدتها في المادة 5 (الوقت الفاصل بين لتحليل) وفي المادة 6 (للالمناعية).

  1. بعد تجميع ما يكفي من VNCs (4-5 لمرور الزمنوأكثر من 24 لالمناعية)، خدمة النقل VNC إلى كتلة تلطيخ نظيفة تحتوي على M3 PS.
  2. توجيه VNC بحيث neuropile الظهرية في طريقة العرض تحت المجهر تشريح (1B الشكل). هذا هو التوجه الأكثر طبيعية لVNCs أن يكذب في حين تعلق على الفصوص البصرية.
  3. طعنة يدويا باستخدام إبرة التنغستن تحت المجهر تشريح، من الجانب الظهري تقريبا في الزاوية اليمنى وتهدف للنصف البطن من VNC (1B الشكل).

تأخذ اهتماما خاصا لما يلي:

  • طعنة مرة واحدة فقط.
  • طعنة الإبرة حتى يصل الجزء السفلي من الزجاج. ومع ذلك، يجب الحرص على عدم الإضرار طرف الإبرة.
  • يجب أن تنبع من حامل الإبرة لا تلمس المتوسطة خلال طعن.
  • الجرح غير مرئية تحت المجهر تشريح.

ملاحظة: طعنة للإصابة انحطاط لا علاقة لها

الإجراءيمكن أن يؤدي إلى انحطاط الخلوية داخل متميزة VNC من الآفة طعن. النتائج تنكس في ثقوب في neuropile، وأحيانا وقد لوحظ ثقوب في القشرة من العينات غير طعن. العينات مع تنكس تنكس التي تؤثر على نطاق واسع أو neuropile تؤثر أيضا يجب أن يتم تجاهل سطح VNC. ويمكن تحديد تنكس على النحو التالي:

  • سطح خشن، وخاصة في منطقة الجانبي / البطنية من الصدر، في 22 ساعة من طعن. في الحالات القصوى، ويبدو يبرز VNC.
  • ثقوب أو فجوات في neuropile الصدري، والتي يمكن أن تكون واضحة وثقوب في إشارة مضان الخلفية مع المناعية.

4. صيانة الإبرة والملقط

  • تحقق ما إذا كان الطرف بشكل روتيني إبرة حادة بما فيه الكفاية. يمكن أن يكون الطرف إبرة حادة أو عازمة بعد استخدامه لعدة تجارب. في هذه الحالة، وشحذ الحافة باستخدام الحجر أركنساس أو ما يعادلها.
  • يجب على نصائح من ملقطتلبية تماما. يمكن الحصول على نصائح تلف مع الاستخدام. في هذه الحالة، ضبط تلميح باستخدام الحجارة أركنساس أو ما يعادلها.

5. الثقافة والفاصل الزمني لتسجيل VNCs من طعن

لتصور neuropile محور عصبي في VNC المعيشة، فخ البروتين GFP الخط الذي تصف جميع محاور عصبية - G9 13 - يمكن استخدامها، وتصور جميع الخلايا الدبقية (باستثناء الخلايا الدبقية خط الوسط) يمكن استخدام برنامج التشغيل الدبقية repoGAL4 للتعبير عن UASdsRed S197Y 14 مراسل. من G9 معبر تسير رحلات الى UASdsRedS197Y؛؛ repoGAL4 الذباب، ويتم الحصول على يرقات من ذرية VNCs مع محاور عصبية الأخضر والأحمر الدبقية التي يمكن تسجيلها في الأنسجة الحية.

  1. بعد تجميع VNCs 4-5، التحويل 1 VNC إلى كتلة تلطيخ نظيفة تحتوي على 2 مل من PS M3، وطعنة في البطن النصف من VNC على النحو المشار إليه في الفقرة 3.
  2. نقل VNC طعن إلى بولي-L-lysin المغلفة الزجاج 3.5 ملم طبق بتري تحتوي على القاع 1 مل من M3PS. وضع الجانب الظهري VNCs أسفل. دفع برفق باستخدام VNC الجانب المسطح من زوج من ملقط للسماح للVNC التمسك الطبق.
  3. إضافة 1 مل من بلطف FBS PS M3 15٪ مما يجعل تركيز النهائي من 7.5٪ إلى FBS.
  4. الحصول على الصور باستخدام الليزر المجهر متحد البؤر. مسح VNC، وجمع سلسلة Z-القسم في جميع أنحاء سمك بأكمله. استخدمنا SP2 لايكا المجهر مبائر مقلوب مع غرفة درجة حرارة البيئة التي تسيطر عليها. أي ما يعادل المجهر متحد البؤر يجب أن تعمل، ولكن قد يتطلب الأمر تعظيم الاستفادة من إعدادات المسح الضوئي ل. كانت إعدادات الوقت الفاصل بين المجهري متحد البؤر لدينا كما يلي: درجة الحرارة في غرفة البيئية: 25 ° C؛ 20X الهدف مع 4 مرات التكبير؛ المسح xyzt واسطة، مع 512x512 بكسل القرار، ض = 1 ميكرومتر الخطوات و 1 ساعة أو 2 - ساعة فترات.
  • المجهر مبائر ايكا SP2 وجود قيود في حجم الملف لمسح. مع هذه الإعدادات، يمكن مسحها ضوئيا 8-9 timepoints. معالمجاهر مبائر أخرى، فإنه ينبغي أن يكون من الممكن الحصول على صورة مداخن للحصول على نقاط قتا أطول، أي على مدى ما يصل إلى 24 ساعة.

6. الثقافة والمناعية من VNCs طعن والثابتة

  1. إعداد زراعة الأنسجة 24 لوحة جيدا تحتوي على 500 ميكرولتر من 7.5٪ FBS M3 PS لكل بئر.
  2. تكرار تشريح أكثر من 24 VNCs لطبق زراعة الأنسجة 24 أيضا.
  3. باستخدام pipetman P20 مع طرف القطع، ونقل 12 VNCs غير طعن من تجمع إلى الطبق الثقافة، باستخدام 1 VNC لكل بئر.
  4. طعنة بقية VNCs في حوض السباحة كما هو موضح في القسم 3. نقل كل VNC طعن حتى بئر لكل منهما.
  5. وضع الطبق جيدا 24 في الحاضنة 25 درجة مئوية لمدة المرجوة اعتمادا على التجربة. سلامة الخلية هو دون تغيير لمدة لا تقل عن 24 ساعة.
  6. بعد الثقافة، ونقل VNCs 12 في 250 ميكرولتر من PEM الفورمالديهايد 4٪ في أنبوب 1.5 مل باستخدام pipetman P20 مع طرف القطع. ثم، وfixatiولقد pipetted بعناية بها، مع الحرص على عدم الإضرار VNCs. وينبغي أن يكون كمية صغيرة من كافية لتغطية مثبت عينات تبقى في كل أنبوب. في وقت لاحق، إضافة مثبت الطازجة، وتستنهض الهمم بلطف لمدة 50 دقيقة في RT.
  7. شطف 2 مرات مع 0.3٪ تريتون X PBS، ثم يغسل 2 مرات لمدة 10 دقيقة بنسبة 0.3٪ PBS X تريتون في RT.
  8. VNCs كتلة من احتضان مع 10٪ مصل الماعز العادي في 0،3٪ PBS X تريتون لمدة 1 ساعة في RT. ويمكن تخزين العينات في C ° 4 لمدة شهر على الأقل.
  9. احتضان مع الأجسام المضادة الأولية VNCs لأكثر من 20 ساعة في 4 درجات مئوية.
  10. شطف 2 مرات بنسبة 0.3٪ PBS X تريتون، ثم يغسل 3 مرات لمدة 10 دقيقة بنسبة 0.3٪ PBS X تريتون في RT.
  11. احتضان مع الأجسام المضادة الثانوية VNCs لأكثر من 16 ساعة في 4 درجات مئوية.
  12. شطف 2 مرات بنسبة 0.3٪ PBS X تريتون، ثم يغسل 3 مرات لمدة 10 دقيقة مع 0.3٪ تريتون X PBS في الغرفة RT (في الظلام في حالة استخدام الأجسام المضادة الثانوية الفلورية).
  13. استبدال PBS مع الجلسرين 50٪: 50٪ PBS لمدة لا تقل عنساعة.
  14. ثم استبدال مع الجلسرين 80٪: لمدة ساعة على الأقل PBS 20٪.
  15. شن VNC في نافذة مصنوعة في 2 طبقات من الشريط التشيلو (حوالي 0،06 ملم) على شريحة زجاجية مجهرية. ضبط الاتجاه، ووضع ساترة (18x18 ملم) خلال النافذة. يمكن تركيبه اثنين VNCs على شريحة باستخدام هذا الأسلوب.

باستخدام مجموعة متنوعة من الأجسام المضادة الأولية، والاستجابات الخلوية المختلفة للإصابة يمكن تحليلها (مثل التغيرات في عدد الخلايا وشكل الخلية).

7. تحليل البيانات باستخدام يماغيج ومجموعة من الإضافات

إذا كان لا يملك VNC طعن انحطاط لا علاقة لها، لا بد من احتساب عينة للتحليل في بغض النظر عن حجم الآفة. كما هو الحال طعن يدويا، وحجم الآفة يختلف في كل مرة. وبالتالي فمن المهم تحليل إحصائيا تأثير طعن، كلما كان ذلك ممكنا.

  1. قياس حجم الجرح. حجم الجرح هو مؤشر على إصلاح 15.الآفة طعن مرئيا وخالية من التعبير GFP. ويمكن قياس منطقة الآفة باستخدام البيانات متاحة بحرية مرور يماغيج البرمجيات، على النحو التالي:
    1. باستخدام يماغيج، فتح كومة من الصور مبائر من القائمة "ملف"، اختر "استيراد" وحدد من هنا "تسلسل الصور". سوف يتحول إلى مجموعة من الصور الفردية إلى المكدس.
    2. التالية على تغيير "كومة" إلى "Hyperstack" عن طريق الذهاب إلى قائمة "ملف"، اختر "Hyperstack"، ثم حدد "المكدس لHyperstack".
    3. تعيين حجم فوكسل باستخدام "خصائص" من القائمة "ملف". في البيانات التي يحصل عليها باستخدام المجهر مبائر ايكا SP2، يمكن الحصول على حجم فوكسل من برنامج مسح، والبيانات الوصفية من ملف نصي حفظ جنبا إلى جنب مع الصور. مع الإعداد لدينا كما هو موضح في القسم 3، أبعاد البيكسل س ص = 0،366211 هي ميكرومتر ميكرومتر و z = 0،99709.
    4. من خلال دراسة جميع الشرائح في وقت واحد نقطة، ورسم الخطوط العريضة الحد الأقصى لمنطقة الآفة باستخدام أداة المضلع الاختيار في شريط الأدوات. هذا هومنطقة الفائدة (ROI).
    5. إضافة إلى مدير ROI ROI عن طريق الذهاب إلى قائمة "تحليل"، انتقل لأسفل وحدد "أدوات"، ثم "ROI مدير"، ثم "إضافة".
    6. كرر هذا لنقاط في كل وقت.
    7. انقر فوق "قياس" الموجود في مدير ROI للحصول على حجم مساحة كل ROI.
  2. حركة تصحيح خلال VNC الوقت الفاصل بين التسجيلات. "Stackreg" و "Turboreg" الإضافات 16 (من موقع يماغيج http://rsbweb.nih.gov/ij/ ): هذه الإضافات تسمح لتصحيح الحركات عينة صغيرة خلال مرور الزمن. بناء كومة مع قسم يعادل البصرية ممثل المرور عبر كل نقاط في الوقت وتطبيق الإضافات. أنها تساعد على تصور كيف يمكن للتغييرات الآفة مع مرور الوقت. التفاصيل على هذه الطرق ودليل التعليمات المتوفرة من مجموعة البحث التي وضعت هذه الإضافات. ( http://bigwww.epfl.cح / thevenaz / stackreg /).
  3. التلقائي عد الخلايا الدبقية. "DeadEasy الدبقية" البرنامج المساعد ( www.biosciences-labs.bham.ac.uk/hidalgo/Software.html ): تم تطوير هذا لحساب عدد من REPO إيجابية الخلايا الدبقية في VNC اليرقات ذبابة الفاكهة ودراسة التغير في الدبقية عدد الإصابات الناجمة عن طعن 17. المكونات في يعمل بدقة، مع وجود خطأ من ايجابيات كاذبة 0.1٪ والسلبيات الكاذبة 4.3٪ 17. لاستخدام هذه المكونات في، التسمية الأولى كل الدبقية (باستثناء خط الوسط) في العينة باستخدام المناعي المضادة للREPO الأجسام المضادة. ثم تثبيت المكونات في يماغيج، فتح كومة من الصور مبائر وتشغيل المكونات. وتعول الخلايا الدبقية تلقائيا في حوالي 30 ثانية.
  4. التلقائي عد الخلايا أفكارك. "يرقات كاسباس DeadEasy" في المكونات ( www.biosciences-labs.bham.ac.uk/hidalgo/Software.html) 18: وقد وضعت هذه لحساب عدد الخلايا التي تحمل المضادة للCaspase3-المشقوق، وتم تكييفها نسخة جديدة لVNCs اليرقات. طعن إصابة يسبب زيادة في موت الخلايا المبرمج 11. لاستخدام هذه المكونات في والخلايا أفكارك التسمية الأولى في العينة باستخدام المناعي المضادة للالمشقوق-كاسباس-3 الأجسام المضادة. ثم تثبيت المكونات في يماغيج، فتح كومة من الصور مبائر وتشغيل المكونات. وتعول الخلايا أفكارك تلقائيا في حوالي 30 ثانية.

8. الكواشف

  1. ثقافة المتوسط: درع والمتوسطة سانغ الحشرات M3، 7.5٪ مصل بقري جنيني، 1٪ البنسلين والستربتوميسين 1٪.
  2. 0.01٪ بولي-L-lysin في DW العقيمة.
  3. مثبت: الفورمالديهايد 4٪، الترا النقي في PEM ​​(0.1 M أنابيب، 2 مم EGTA، 1 ملم MgSO 4) الحل.
  4. حل لمنع المناعية: 10٪ مصل الماعز العادي في 0،3٪ PBS X تريتون.
  5. مكافحة الجلوتامين مخلقة2 الأجسام المضادة: 1:250 في عرقلة الحل.
  6. الأجسام المضادة لمكافحة GFP: 1:1،000 في عرقلة الحل.
  7. الأجسام المضادة لمكافحة REPO: 1:250 في عرقلة الحل.
  8. الأجسام المضادة لمكافحة ELAV: 1:250 في عرقلة الحل.
  9. مكافحة المشقوق كاسباس 3 الأضداد: 1:1،000 في عرقلة الحل.
  10. الأجسام المضادة الثانوية: 1:250 في عرقلة الحل.

Representative Results

هنا نعرض كيفية تنفيذ إصابة طعن إلى VNC اليرقات ذبابة الفاكهة وتحليل الاستجابات الخلوية للإصابة باستخدام الوقت الفاصل بين والمناعية مبائر المجهري مضان.

لمرور الزمن البيانات، والآفة تصور كمنطقة GFP سلبية داخل neuropile العينات التي تحمل علامة G9 محور عصبي (الشكل 2). بعد فترة وجيزة طعن، GFP سلبية الصغيرة المناطق التي تبدو وكأنها ثقوب أو فجوات، تبدأ في الظهور (الشكل 2A). مثل GFP سلبية المناطق تكبير عموما إلى حوالي 6-8 ساعة بعد طعن (الشكل 2A). في وقت لاحق، والمناطق GFP سلبية تقليص وحتى قد تختفي (الشكل 2B). بنسبة 22 ساعة بعد طعن، المنطقة التي تحتلها الجرح هو أصغر حجما من المساحة القصوى كان من 6 إلى 8 ساعات بعد طعن (أرقام 2A، B). وبالمثل، فإن منطقة DsRed سلبية في عمليات الدبقية يزيد في البداية أيضا، ولكن shrinKS بنسبة 22 ساعة بعد طعن. ومن المثير للاهتمام، وغالبا ما DsRed إيجابية عمليات الدبقية ملء الثقوب GFP سلبية في neuropile قبل اختفائهم (الشكل 2C).

يمكن استخدام المناعية في العينات الثابتة، وعمليات الدبقية بخير واستجابتها للإصابة يمكن تصور مع دقة أفضل من مع مرور الزمن الصور. ويمكن أن يتم ذلك، على سبيل المثال، باستخدام برنامج تشغيل repoGAL4 الدبقية للحث على التعبير عن مراسل غشاء المربوطة (على سبيل المثال، UAS mCD8GFP) في الذباب لتصور جميع الخلايا الدبقية (باستثناء الخلايا الدبقية خط الوسط). ويمكن أيضا أن يدمج مع علامات الدبقية الأخرى، مثل GS2 المضادة، التي تصف neuropile المرتبطة الخلايا الدبقية (أرقام 3A، B). هنا نعرض أنه على الرغم من طعن الحبل البطني العصب من الجانب الظهري، والطعن في نتائج الإصابة دنت بطنيا (3A الشكل، النصال). طعن يبدو أنه يؤثر على أكثر بشدة neuropile وneuropile المرتبطة-TH الخلايا الدبقيةسطح القشرة والخلايا الدبقية (الشكل 3B). تظهر عمليات غير منظمة الدبقية في neuropile، في حين أنها لا تزال تحافظ على حياتها مثل شبكة منظمة في القشرة. النتائج إصابة في GS2 إيجابية الحطام الخلوية، والتي تختلف عن الخلايا الطبيعية وشظايا الحطام هي أصغر بكثير وليس متصلا جسم الخلية. هذا يكشف الأضرار التي لحقت neuropile المرتبطة الخلايا الدبقية (الشكل 3B). كما لوحظ تدهور neuropile المرتبطة الخلايا الدبقية بواسطة المجهر الإلكتروني 15. ويلاحظ مكافحة المشقوق-كاسباس موت الخلايا المبرمج في تلطيخ + 3 neuropile المرتبطة الخلايا الدبقية 15، تبين أنها تخضع موت الخلايا المبرمج على طعن الاصابة. وظهر أيضا Neuropile الخلايا المرتبطة الدبقية العصبية في phagocytose الحطام 15، وGS2 + إشارة قد تكشف أيضا الإحاطة من الخلايا العصبية أفكارك من خلال عمليات الدبقية. ويلاحظ أيضا المشقوق-كاسباس + أفكارك الخلايا في القشرة، على الأقل البعض منها تتوافق مع Elav + الخلايا العصبية (

باستخدام عينات الثابتة والمناعية تمكن أيضا من تحليل الكمي لاستجابات الخلايا للإصابة، مثل الآثار في الانتشار وموت الخلايا المبرمج. لهذا، قمنا بتطوير عمدا 2 يماغيج المكونات الإضافية، DeadEasy اليرقة كاسباس وDeadEasy الدبقية، لحساب تلقائيا عدد من الخلايا الدبقية والخلايا أفكارك، على التوالي. وقد تم التصديق عليها للعمل على VNCs اليرقات ودقيقة للغاية. باستخدام هذه، فمن الممكن أن نلاحظ زيادة في عدد REPO إيجابية الخلايا الدبقية الناجمة عن الإصابة طعن، بنسبة 22 ساعة (الشكل 4A) 15. هناك أيضا زيادة في عدد المضادة للالمشقوق-كاسباس-3 خلايا أفكارك بنسبة 6 ساعة 15 (الشكل 4B) بعد طعنه. هذه الزيادة في انتشار الدبقية والخلايا استجابة لإصابة في الجهاز العصبي المركزي ذبابة الفاكهة تذكر الاستجابة إصابة في الجهاز العصبي المركزي الفقاريات.

A جانبا حاسما في هذا بروtocol هو نوعية تشريح VNC. من الصعب أن أقول في وقت تشريح ما إذا كان قد تضررت أم لا VNCs في هذه العملية. من المهم أن تولي عناية خاصة لأداء تشريح لطيف. ومع ذلك، لا محالة عينات نوعية سيئة أن تنتج، وأنه من الضروري أن يتم تحديد هذه في مراحل لاحقة والتخلص منها. في أيدينا، VNC تنكس يبدو أن لا علاقة لها الإصابة، ولكن بدلا من ذلك تسبب تشريح الخام. لاحظ أننا لم حاسما في حجم الجرح الإصابة، ونقوم بتحليل جميع العينات التي ليست جرح المتدهورة. عندما VNCs الحفاظ على سلامتها، والسطح VNC يميل الى نظرة على نحو سلس وبراقة، ويلاحظ أي ثقوب في neuropile (الشكل 5A). ويمكن التعرف على تدهور بنسبة 24 VNCs ساعة تشريح ما بعد من سطح خشن من المناطق البطنية والجانبية VNC (الشكل 5B). يمكن تدهور neuropile لا علاقة لها أيضا أن تحدث الإصابة طعن، ويتم التعرف على أنها ح neuropileoles في إشارة خلفية العينات immunostained. يجب أن يتم تجاهل هذه العلامات مع عينات من الضمور (الشكل 5C). في أيدينا، فإن معدل النجاح للتشريح والإصابة في السيطرة سليمة وطعن (YW) الذباب على حد سواء نحو 70٪. سوف تختلف هذه النسبة مع مهارة الشخص الذي يقوم التجارب، ومع النمط الوراثي.

الشكل 1
الشكل 1. الرسم التخطيطي لتنظيم اليرقات وطعن الاصابة. (A) في يوم 0، يسمح الذباب لتضع بيضها في طبق بتري عصير العنب لمدة 3 ساعة. في يوم 1، وتحاك يرقات العمر الأول (L1) وتجمع وتوضع في قارورة تحتوي على الخميرة الغذائية القياسية، حيث يتم الاحتفاظ بها لمدة 3 أيام. في يوم 4، يتم جمع اليرقات من قارورة الغذاء، وتستخدم للطعن التجارب. (B) عرض الجانبي للنظام العصبي المركزي اليرقات.وطعن منطقة البطن من الحبل البطني العصب بإبرة من الجانب الظهري. الأمامي إلى اليسار، والخلفي إلى اليمين.

الشكل 2
الشكل 2. الوقت الفاصل بين تطور الآفة VNC. متحد البؤر المجهري على VNCs حية مع محاور عصبية GFP-صفت وصفت-DsRed الخلايا الدبقية. النمط الجيني: UASDsRed / +؛ G9 / +؛ repoGAL4 / + (A) ومن المسلم به الآفة بسبب عدم وجود مضان على neuropile محور عصبي. بعد طعن، GFP سلبية تظهر الثقوب، وزيادة بعد ذلك في الحجم والعدد. التوقعات من 5 أقسام البصرية من كل نقطة بعد طعن الوقت المحتسب بدل الضائع. (B) ومحور عصبي ينكمش الآفة neuropile من 9 ساعة بعد طعن. هذه الصور هي أقسام البصرية واحدة من نقاط زمنية مختلفة بعد طعن الاصابة. لتحديد المواقف ما يعادلها في كل عينة، وعدد من شريحة نفس عصاموقد تم اختيار الفصل نقطة في الوقت كومة من الوقت الفاصل بين البيانات. وبمقارنة أنماط تصور مع G9 وrepoGAL4> UASmCD8GFP في المنطقة لم تتأثر طعن، التحقق من شرائح بأنها من مواقع يعادل في محور Z. الخطوط المتقطعة في (A، B) إلى حافة الجرح. (C) تضخم عالية الجروح من neuropile. امتلأت GFP سلبية الثقوب مع DsRed إيجابية عمليات الدبقية، واختفى بعد ذلك (النصال). مشاهدة الأفقي. حتى الأمامية.

الشكل 3
الشكل 3. الخلوية توصيف الآفة VNC. VNCs تحمل مراسل غشاء GFP المربوطة لجميع الخلايا الدبقية (باستثناء خط الوسط الدبقية) ملطخة GFP المضادة للطائرات والمضادة GS2، وneuropile المرتبطة علامة الخلية الدبقية. النمط الجيني: + / +؛ UASmCD8GFP / +؛ repoGAL4 / + (A) وطعن VNCs من الدرSAL الجانب، ولكن هذا يؤدي إلى دنت بطنيا (النصال). مشاهدة السهمي من أقسام البصرية واحد، حتى اليسار الظهرية الأمامية و. (A، B) طعن إصابة الخلايا الدبقية يؤثر أشد neuropile المرتبطة من الخلايا الدبقية سطح القشرة و. النتائج إصابة في GS2 إيجابية الحطام الخلوية (رؤوس الأسهم في B). (B) عرض أفقي واحد من المقاطع البصرية، حتى الأمامية. رؤوس سهام تشير إلى GS2 + الحطام الخلية. (C) Colocalisation من علامة أفكارك مكافحة المشقوق-كاسباس-3 وعلامة العصبية المضادة للElav تبين أن الإصابة عند بعض الخلايا الميتة في القشرة هي الخلايا العصبية. NP، neuropile؛ CX، القشرة.

الشكل 4
الشكل 4. التلقائي عد الخلايا الدبقية والخلايا أفكارك باستخدام DeadEasy. (A) مثال من استخدام "الخلايا الدبقية اليرقات DeadEasy 'لحساب REPO إيجابيةالدبقية الخلايا. بقي من الزمن: نصفين VNC بطني ملطخة مكافحة REPO الأجسام المضادة؛ الأوسط: خرج من الخلايا الدبقية اليرقات تظهر الخلايا DeadEasy التي حددها في المكونات، والحق: الدمج. الأرقام على اليمين هي عدد REPO إيجابية تحسب الخلايا تلقائيا في كومة كاملة من أقسام مبائر البصرية في حوالي 30 ثانية. يزيد عدد الخلايا الدبقية في VNCs طعن. (B) مثال على استخدام 'يرقة كاسباس DeadEasy'. ترك: توقعات المادتين 5 مبائر البصرية ملطخة الأجسام المضادة 3 ألغام مضادة للالمشقوق-كاسباس؛ الأوسط: خرج تظهر الخلايا التي حددتها في المكونات، والحق: الدمج. الأرقام على اليمين هي عدد كاسباس إيجابية تحسب الخلايا تلقائيا في كومة كاملة من أقسام مبائر البصرية في حوالي 30 ثانية. عدد الخلايا أفكارك يزيد في طعن VNC.

الشكل 5
الشكل 5. أمثلة على degeneratأيون. (A) A VNC صحية. لا توجد علامات انحطاط. (B) وجانب من الصدر هو التحول (النصال) في عينة طعن. النجمة تشير إلى موقع الآفة. (C) ثقوب في neuropile الصدري (رأس السهم الأبيض) والقشرة (رأس السهم البرتقالي) في VNC غير طعن. يجب أن يتم تجاهل العينات التالفة تشكل الفجوات مع neuropile واسعة النطاق. هنا كانت ملطخة VNCs مع علامة المرتبطة neuropile الدبقية مكافحة الأبنوس. مشاهدة أفقية، حتى الأمامية.

Discussion

وضعنا بروتوكولا للطعن إصابة في الجهاز العصبي المركزي اليرقات ذبابة الفاكهة للتحقيق في الاستجابات الخلوية لإصلاح والإصابات والتجدد. وتشريح VNCs اليرقات وطعن، وبعد ذلك يتم تصوير أنها مع مرور الزمن المجهري أو المحدد لمضان المناعية لتصور الدبقية والخلايا العصبية، الخلايا أو انقسام الخلايا. ويمكن قياس تطور الآفة مع مرور الوقت. ويرافق هذه الطريقة من قبل البرمجيات المتقدمة عمدا عن التحليل الكمي والإحصائي للتغييرات على عدد الخلايا والإصابة أثناء الإصلاح.

نحن طعن لمدة 96 ساعة AEL اليرقات (وكانت ثابتة إما هذه أو السماح لمواصلة تطوير)، وهي مرحلة التطوير قبل الانتقال إلى خادرة ثم ذبابة الكبار. في 96 ساعة، VNCs هي كبيرة بما يكفي لطعنه، بل هي في منتصف مرحلة الطور الثالث، وبالتالي لا يخضع التشرنق حتى الآن، والجهاز العصبي هو بالفعل مماثلة تماما لتلك التي وظيفية الإعلانULT. قد يكون من الممكن في وقت لاحق قليلا طعن في اليرقات ويجب اختيار توقيت دقيق لتتناسب مع سؤال البحث. ومع ذلك، اعتمادا على الأسئلة الموجهة، سيكون من الضروري عموما ثقافة VNCs لبعض الوقت للاطلاع على الاستجابات الخلوية للإصابة. بعض الوقت بعد 120 ساعة يبدأ التشرنق AEL، وهي فترة عندما CNS هو تشكيلها، وبالتالي الأفضل تجنبها. وبالتالي يقتصر بدلا نافذة الوقت لطعنه الثقافة زائد في اليرقة. باستخدام اليرقات لا يزال لديه ميزة كبيرة على استخدام التقنية البالغين: في حين، على غرار الكبار، والجهاز العصبي هو بالفعل تعمل بكامل طاقتها، وتحليل استجابة لإصابات وأسهل بكثير وأسرع في اليرقات.

عند مقارنة حجم ومورفولوجية العقول وVNCs تشريح ومثقف في طبق لVNCs التي تشريح في وقت لاحق نقطة أي ما يعادل زراعة بدون في طبق، يبدو أن التنمية هي أبطأ في الثقافة مما كانت عليه في الجسم الحي. في جوانب أخرى،التنمية يحمل على عادة في الثقافة، والحفاظ عليها وسلامة الأنسجة والخلايا وتظهر على قيد الحياة ردود متعددة. توسيع الجرح، وإصلاح neuropile وانتشار الدبقية تجري في غضون 22 ساعة بعد طعن. هذا يدل على أن الاستجابات الخلوية لإصابة تحدث في الثقافة، وهناك على الأرجح لا حاجة للحفاظ على إإكسبلنتس لفترة أطول من يوم واحد. إذا كان المطلوب الثقافة على المدى الطويل، قد تتطلب التحسين بروتوكول مزيد من مثل استخدام لوحة إدراج ثقافة 5.

من المهم تحديد عينات نوعية جيدة من تلك التدهور. تحسين هذا البروتوكول يحتاج إلى بعض المهارة وانحطاط لا محالة سوف تحدث في بعض العينات. يمكن للحصول على VNC "القنبيط" المظهر الذي يعكس انهيار سلامة الأنسجة (الشكل 5B). ومن المسلم به أيضا من قبل تنكس تشكل الفجوات من VNC بشكل مستقل عن الطعن، والتي يمكن أن تكون موجودة في العينات غير سليمة طعن، (الشكل 5C

في هذا البروتوكول، ونحن قد استفادت من البروتين خط فخ الذباب لتصور neuropile بالتوازي مع التصور عمليات الدبقية باستخدام التقليدية GAL4-UAS النظام. ويمكن أيضا أن هذه الأدوات جنبا إلى جنب مع غيرها من نظم التعبير الثنائية مثل لوxa موقع 19 و Q-نظام 20، والتي هي مستقلة عن GAL4. وهذا من شأنه تحليل التفاعلات بين محاور عصبية على سبيل المثال والعمليات الدبقية، ردا على الاصابة. من خلال الجمع بين أدوات أخرى مع وراثية أخرى مثل لصحفيين التشعبات 21 أو تدفق الكالسيوم 22، هذا الأسلوب يوفر فرصة كبيرة لتحليل بيولوجيا الخلية وراء استجابة إصابة الخلايا الدبقية، محاور عصبية العصبية والتشعبات في الجهاز العصبي المركزي. وأخيرا، يمكن الجمع بين هذه الطريقة القياسية مع علم الوراثة، والطفرات والإفراط في التعبير عن الجينات، لاختبار وظيفة الجين في الردود على الإصابة والتجدد.

وقد أدى هذا البروتوكول بنجاح إلى اكتشاف شبكة الجينات الكامنة وراء استجابة التجدد الدبقية لإصابة الجهاز العصبي المركزي 11. نظرا لحفظ الجينات التطورية وظيفة، كشف هذه الأحداث الخلوية وظائف الجينات في الذباب الفاكهة من المرجح أن تقدم أفكارا مهمة في فهم أماهCNS mmalian ردا على الإصابات والتجدد.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

نشكر مي آن ليم لقراءة نقدية للمخطوطة وغيرها من أعضاء مختبرنا لمناقشاتهم طوال هذا العمل. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل مؤسسة العلوم يامادا ورويال الزمالات جمعية زيارة قصيرة والاتحاد الأوروبي ماري كوري الدولية GRR زمالة الواردة إلى KK، وBBSRC منحة المشروع (BB/H002278/1) ويلكوم ترست معدات غرانت (073228/Z/03/Z) لAH

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Staining block Brunel Microscope
Forceps No. 5 Fine Science Tools e.g. 11251-20
Tungsten needle: rod diameter, 0.5 mm; tip size, 1 μm; length, 2 inch Roboz Surgical Instrument RS-6065
Needle holder Roboz Surgical Instrument RS-6060
Arkansans stones: Repair Kit for Dumont Forceps Fine Science Tools 29000-00
35 mm Petri dish with 27 mm glass base Iwaki 3930-035
Leica SP2-AOBS confocal inverted microscope with environment chamber Leica
Reagent
Shield and Sang M3 insect medium (ecdysone free) Sigma S3652-500 ml
Penicillin and streptomycin Invitrogen 15070-063
Phosphate-buffered saline (PBS) See 12
FBS Sigma F7524
Poly-L-lysin Sigma P1399-25mg
Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure Polysciences 04018-1
Mouse anti-glutamine synthetase antibodies Millipore MAB302
Rabbit anti-GFP antibodies Life technologies A11122
Mouse anti-REPO antibodies Developmental Studies Hybridoma bank 8D12
Rat anti-ELAV antibodies Developmental Studies Hybridoma bank 7E8A10
Rabbit anti-active caspase 3 antibodies Abcam ab13847
Normal goat serum Vector Laboratories S-1000
Anti-rabbit Alexa Fluor 488 Life technologies A11034
Anti-mouse Alexa Fluor 647 Life technologies A21236
Anti-rat Alexa Fluor 647 Life technologies A21247

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fang, Y., Soares, L., Teng, X., Geary, M., Bonini, N. M. A novel Drosophila model of nerve injury reveals an essential role of Nmnat in maintaining axonal integrity. Curr. Biol. 22, 590-595 (2012).
  2. Xiong, X., et al. Protein turnover of the Wallenda/DLK kinase regulates a retrograde response to axonal injury. J. Cell Biol. 191, 211-223 (2010).
  3. Leyssen, M., et al. Amyloid precursor protein promotes post-developmental neurite arborization in the Drosophila brain. EMBO J. 24, 2944-2955 (2005).
  4. Kato, K., Awasaki, T., Ito, K. Neuronal programmed cell death induces glial cell division in the adult Drosophila brain. Development. 136, 51-59 (2009).
  5. Ayaz, D., et al. Axonal injury and regeneration in the adult brain of Drosophila. J. Neurosci. 28, 6010-6021 (2008).
  6. Rohrbough, J., O'Dowd, D. K., Baines, R. A., Broadie, K. Cellular bases of behavioral plasticity: establishing and modifying synaptic circuits in the Drosophila genetic system. J. Neurobiol. 54, 254-271 (2003).
  7. Babcock, D. T., Landry, C., Galko, M. J. Cytokine signaling mediates UV-induced nociceptive sensitization in Drosophila larvae. Curr. Biol. 19, 799-806 (2009).
  8. Gomez-Marin, A., Louis, M. Active sensation during orientation behavior in the Drosophila larva: more sense than luck. Curr. Opin. Neurobiol. 22, 208-215 (2012).
  9. Schleyer, M., et al. A behavior-based circuit model of how outcome expectations organize learned behavior in larval Drosophila. Learn Mem. 18, 639-653 (2011).
  10. Brown, H. L., Cherbas, L., Cherbas, P., Truman, J. W. Use of time-lapse imaging and dominant negative receptors to dissect the steroid receptor control of neuronal remodeling in Drosophila. Development. 133, 275-285 (2006).
  11. Kato, K., Forero, M. G., Fenton, J. C., Hidalgo, A. The glial regenerative response to central nervous system injury is enabled by pros-notch and pros-NFkappaB feedback. PLoS Biol. 9, e1001133 (2011).
  12. Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. Drosophila protocols. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
  13. Morin, X., Daneman, R., Zavortink, M., Chia, W. A protein trap strategy to detect GFP-tagged proteins expressed from their endogenous loci in Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 15050-15055 (2001).
  14. Verkhusha, V. V., et al. An enhanced mutant of red fluorescent protein DsRed for double labeling and developmental timer of neural fiber bundle formation. J. Biol. Chem. 276, 29621-29624 (2001).
  15. Kato, K., Forero, M. G., Fenton, J. C., Hidalgo, A. The glial regenerative response to central nervous system injury is enabled by Pros-Notch and Pros-NFkB feedback. PLoS Biol. 9, e1001133 (2011).
  16. Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing: A Publication of the IEEE Signal Processing Society. 7, 27-41 (1998).
  17. Forero, M. G., Kato, K., Hidalgo, A. Automatic cell counting in vivo in the larval nervous system of Drosophila. J. Microsc. 46, 202-212 (2012).
  18. Forero, M. G., Pennack, J. A., Learte, A. R., Hidalgo, A. DeadEasy caspase: automatic counting of apoptotic cells in Drosophila. PLoS One. 4, e5441 (2009).
  19. Lai, S. L., Lee, T. Genetic mosaic with dual binary transcriptional systems in Drosophila. Nat. Neurosci. 9, 703-709 (2006).
  20. Potter, C. J., Tasic, B., Russler, E. V., Liang, L., Luo, L. The Q system: a repressible binary system for transgene expression, lineage tracing, and mosaic analysis. Cell. 141, 536-548 (2010).
  21. Nicolai, L. J., et al. Genetically encoded dendritic marker sheds light on neuronal connectivity in Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 20553-20558 (2010).
  22. Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nat. Methods. 6, 875-881 (2009).

Tags

بيولوجيا الأعصاب، العدد 73، البيولوجيا التطورية، علم الأعصاب، علم الأحياء الجزيئية، علم الأحياء الخلوي، علم التشريح، علم وظائف الأعضاء، الهندسة الحيوية والجهاز العصبي المركزي، دبق عصبي،
والنموذج الإصابات المعنية بالتحقيق في وسط الجهاز العصبي في إصلاح<em&gt; ذبابة الفاكهة</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kato, K., Hidalgo, A. An Injury… More

Kato, K., Hidalgo, A. An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila. J. Vis. Exp. (73), e50306, doi:10.3791/50306 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter