Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

En skade Paradigm at undersøge centrale nervesystem reparation i Published: March 28, 2013 doi: 10.3791/50306
Automatic Translation
1, 1
1Neurodevelopment Group, School of Biosciences, University of Birmingham

Summary

En skade paradigme ved hjælp af Drosophila larve ventrale nerve ledning til at undersøge centralnervesystemet regenerering og reparation er beskrevet. Jagende efterfulgt af laser konfokal mikroskopi i time-lapse og faste prøver, kombineret med kvantitativ analyse med målrettet udviklet software og genetik, der bruges til at undersøge de molekylære mekanismer i CNS-regenerering og reparation.

Abstract

En eksperimentel metode er udviklet til at undersøge de cellulære reaktioner på centralnervesystemet (CNS) skader ved hjælp af frugt-fly Drosophila. Forståelse reparation og regeneration hos dyr er et centralt spørgsmål i biologi. De beskadigede menneskelige CNS ikke regenerere, og forstå hvordan man kan fremme regenerering er et af hovedmålene for medicinsk neurovidenskab. Den kraftfulde genetiske værktøjskasse af Drosophila kan bruges til at løse problemet med CNS-regeneration.

En læsion i CNS ventrale nerve ledning (VNC, svarende til hvirveldyret rygmarv) påføres manuelt med en wolfram nål. VNC kan efterfølgende optaget i tidsforskudt anvendelse af laserscanning konfokal mikroskopi i op til 24 timer for at følge udviklingen af ​​læsionen over tid. Alternativt kan det dyrkes og derefter fikseret og farvet ved hjælp af immunfluorescens at visualisere neuron og gliaceller med konfokal mikroskopi. Under anvendelse af passende markører, changes i cellemorfologi og celle tilstand som følge af skaden kan visualiseres. Med ImageJ og vilje udviklet plug-ins, kan kvantitative og statistiske analyser udføres for at måle ændringer i sårstørrelse over tid og effekterne af skader i celleproliferation og celledød. Disse fremgangsmåder tillader analyse af store prøvestørrelser. De kan kombineres med de magtfulde genetik Drosophila at undersøge de molekylære mekanismer, der ligger CNS regenerering og reparation.

Introduction

Regenerering hos dyr viser, at celler fornemme, når organismevækst er bestilt og fuldstændig, og hvor den strukturelle integritet af en organisme opnås og opretholdes. Forståelsen af ​​disse mystiske evner celler er af stor interesse inden for biologien. Fremme regenerering er en af ​​de vigtigste mål for medicinsk neurovidenskab. Hos mennesker indeholder den beskadigede centralnervesystemet (CNS) ikke regenerere. Gnavermodeller for rygmarvsskade bruges til at forstå, hvordan celler reagerer på skade. Men etiske bekymringer, høje omkostninger og den langsomme livscyklus af dyrene begrænse fremskridt.

Frugten-fly Drosophila er en udbredt model organisme i udviklingsmæssige biologi og neurovidenskab. Takket være sin stærke genetiske værktøjer og korte livscyklus, har Drosophila gentagne ført til opdagelsen af genernes funktion og netværk med relevans for forståelsen af mennesker og sygdom. Der er rigeligt med beviser på evolutionær conbevarelse af genfunktion fra fluer til mennesker.

I de seneste år har flere paradigmer for nervesystemet skade blevet etableret i Drosophila. Nogle består af skade perifere nerver, der løber langs vingen eller axotomi af perifere nerver, herunder sensorisk 1 og motor axonerne 2. Men de perifere og centrale nervesystem forskellige på mange måder, og det er velkendt, at i mange dyr det perifere nervesystem kan regenerere mens CNS ikke kan. Således at forstå CNS regenerering, direkte skade i centralnervesystemet er mere passende. Stikkende skaden med en nål er blevet anvendt på Drosophila voksne hjerne at undersøge reaktion på beskadigelse 3,4. Brug en anden fremgangsmåde, Ayaz et al. Afhuggede CNS axoner i dyrkede voksne hjerner med en Piezo power microdissector, og analyserede deres regenerering i 4 dage 5. Fordelen ved disse senere eksperimentelle set ups er, at de fokuserer på hjernen, som uden tvivl er af stor interesse. Ulempen er, at hjernen er meget mere kompleks end det VNC, der kun beskæftiger sig med motorisk og sensorisk kontrol. Arbejde på den voksne hjerne er også mere tidskrævende. Larven er klar til eksperimenter i 4 dage, mens det tager ca 10 dage for voksne eclosion, og derefter yderligere 5 dage for deres modning. Den voksne hjerne er også vanskeligere at håndtere, fordi den er indkapslet i tykke kutikula, som er vanskeligt at fjerne. VNC har den yderligere tiltrækning for at være funktionelt ækvivalent til hvirveldyret rygmarven.

Drosophila larver er almindeligt anvendt som model organisme for neuroscience 6-9. Selvom strengt taget Larven er i en udviklingsfase, kan det også betragtes som en fuldt funktionel dyr. Larven har bevægelseskomponenter, flere sanser inklusive lugtesansen, smag og nociception, og indlæring og hukommelse. Således larvens VNC wsom er valgt som det ideelle model for CNS skade.

Larver og pupal VNCs kan dissekeret og dyrket i skålen, stadig bevarer cellulære integritet i op til 24 timer 10. Dette antydede, at skaden kan anvendes til VNC, som derpå kan indføres i time-lapse i løbet af dette tidsrum, eller dyrket og fastgjort på ethvert ønsket tidspunkt i denne periode.

Her præsenterer vi en eksperimentel paradigme for CNS skade ved hjælp af Drosophila larver af VNC. Den VNC først dissekeret fra larve, og jagende skade påføres manuelt med en wolfram nål. VNC placeres derefter på et glas-dækglas bund, og optaget med time-lapse laserscanning konfokal mikroskopi. Alternativt kan VNCs dyrkes i et ønsket tidsrum, og de cellulære virkninger af skaden kan analyseres i faste prøver ved hjælp af immunfarvning og konfokal mikroskopi. Sårområdet kan måles, og kvantitativ analyse af celle nowmber (celleproliferation og celledød) kan udføres med vilje udviklet software. Store stikprøvestørrelser let kan håndteres, hvilket resulterer i statistisk validerede resultater. Disse fremgangsmåder er med held blevet kombineret med de kraftige genetik af Drosophila at opdage et gen net ligger til grund for gliale regenerative respons på CNS-skade 11.

Protocol

1. Indsamling af Iscenesat Larver

  1. Place 15 kvindelige og 15 mandlige voksne fluer i en cylindrisk Perspex bur for at lægge æg på en petriskål med agar og druesaft suppleret med en lille scoop af gær indsæt i 3 timer ved 25 ° C. Ændre pladen 3-4 gange om dagen, og kassere den første plade (dvs. fra O / N egg-lag). Kassér også pladerne fra den første dag. Fra den anden dag, holder pladerne med æg ved 25 ° C. Efter 7 dages indsamling af æg, skal du starte med en ny opsætning af forældre fluer.
  2. Efter ca 24 timer, æggene klækkes fra æggene. Ved at hægte larver med en fortyndet pensel eller med en pincet eller lignende, overføres 35 larver fra druer agar til et hætteglas indeholdende standard flue fødevarer (10 ml) (fig. 1A).
  3. Opretholde hætteglas indeholdende larver i 3 dage (96 timer Efter æglægning, AEL) ved 25 ° C.

2. Dissektion af Larver ventrale Nerve Ledninger til Kultur

  1. Rens væreNCH ​​og hænder med 70% ethanol. Soak 4 farvning blokke, 2 par tænger og en nål med 70% ethanol og lad lufttørre.
  2. Forbered 4 farvning blokke med følgende medier: en med destilleret vand (DW) til at rense og pool rengøres larver, en anden med 2 ml Shield og Sang M3 insekt medium med 1% penicillin og streptomycin, ecdyson-fri (M3 PS medium) for at dissekere larverne, en tredje med 2 ml M3 PS medium til pool dissekeret ventrale nerve ledninger (VNCs), og en fjerde med 2 ml M3 PS medium at stikke af VNCs. Alle reagenserne skal forvarmes til stuetemperatur.
  3. Tilsæt vand til hætteglasset indeholdende 96 timer AEL larver. Derefter, ved anvendelse af en spatel, spreder forsigtigt fødevarer med larver fra hætteglasset til et vådt stykke køkkenrulle. Overfør 10 larver til en farvning blok med DW at vaske maden. Udskift DW 6 gange. Derefter erstatte med M3 PS medium.
  4. Overføre én af larverne til en farvning blok indeholdende 2 ml M3 PS medium.
  5. Under et dissektionsmikroskop, dissect en larve hjerne omhyggeligt anvendelse af standardmetoder 12, men for at minimere vævsskader, tage ekstra forsigtig ved at gå frem på følgende måde. Placer larve dorsale opad, og hold den dorsale side til en tredjedel fra den forreste ende med 2 par tang (en i hver hånd). Selv holder forreste sektion, trække sig væk den bageste ende med pincetten, og rive epidermis. Hjernen og VNC skal være synligt fra den bageste kant af den forreste halvdel. Omhyggeligt isolere hjernen og VNC komplekset ved fjernelse af fedt organ, tarm og epidermis. Når VNCs er beskadiget alt for meget, vil de VNCs degenererede helt eller delvis selv uden stikkende skade. Tag højde for følgende punkter:
  • Undlad at trække eller rive fantasiens skiver og perifere nerver fra bryst VNC, da dette vil beskadige VNC. At skære de perifere nerver, holde de perifere nerver med to par pincet placeret tæt hinanden, og træk derefter nerverne med forCEPS. Imaginal diske og mund dele kan efterlades fastgjort til VNC.
  • Forlade ringen kirtlen og lymfekirtel fastgjort til hjernen.
  • Skær tarmen ved punktet tættest på hjernen, hvor der ikke meget mad er indeholdt.
  1. Ved hjælp af en P20 Pipetman med spidsen afskåret og udvidet en smule, overføre VNC til en farvning blok der indeholder frisk M3 PS medium. Før overførsel af VNC, første pipette op og ned blot mediet anvendt til dissektion for at forhindre VNC klistrer til spidsen.

3. Jagende Skade på Drosophila Larvernes VNC

Dette afsnit beskriver, hvordan man udfører stikkende skade for VNCs og til at forberede stukket-VNCs for time-lapse analyse og immunfarvning. Post-jagende dyrkningsbetingelser og varighed er beskrevet i afsnit 5 (for time-lapse analyse) og i § 6 (for immunfarvning).

  1. Efter at samle nok VNCs (4-5 for time-lapseog over 24 for immunfarvning), transfer en VNC til en ren farvning blok med M3 PS.
  2. Orientere VNC, således at den dorsale neuropile er i betragtning under dissektionsmikroskop (figur 1B). Dette er den mest naturlige retning for VNCs at ligge i, når fastgjort til optikken flige.
  3. Stab manuelt under anvendelse af en wolfram nål under dissektion mikroskop, fra den dorsale side praktisk taget under en ret vinkel og sigter efter den abdominale halvdel af VNC (figur 1B).

Vær særlig opmærksom på følgende:

  • Stab én gang.
  • Stab indtil nålen rammer bunden af ​​glasset. Men pas på ikke at beskadige nålespidsen.
  • Stilken af ​​nåleholderen må ikke røre mediet under stikkende.
  • Såret er ikke synlig under dissektion mikroskop.

Bemærk: Stab-skade relateret degeneration

Den procedurekan resultere i cellulær degenerering inden for VNC adskilt fra stikkende læsion. Degeneration resulterer i huller i neuropile, og lejlighedsvis huller er observeret i cortex af ikke-stukket prøver. Prøver med degeneration påvirker neuropile eller udbredt degeneration påvirker også VNC overflade skal kasseres. Degeneration kan identificeres som følger:

  • Ru overflade, især ved den laterale / ventrale område af thorax, ved 22 timer med stikkende. I ekstreme tilfælde, ser VNC stak.
  • Huller eller vakuoler i bryst neuropile, som kan være synlig som huller i baggrundssignal med fluorescens immunfarvning.

4. Vedligeholdelse af Needle og Tang

  • Rutinemæssigt kontrollere, om nålespidsen er skarp nok. Nålespidsen kan være bøjet eller sløv efter brug i adskillige eksperimenter. I dette tilfælde skærpe spidsen ved hjælp af en Arkansas sten eller tilsvarende.
  • Spidsen af ​​tangen skalmødes perfekt. Spidserne kan blive beskadiget ved brug. I dette tilfælde justeres spidsen ved hjælp af en Arkansas sten eller tilsvarende.

5. Kultur og Time-lapse optagelse af Stabbed VNCs

At visualisere det axonal neuropile i levende VNC, a GFP protein fælde linje, der etiketter alle axoner - G9 13 - kan anvendes, og at visualisere alle glialceller (undtagen midterlinjen glia) den glial driver repoGAL4 kan anvendes til at udtrykke UASdsRed S197Y 14 reporter. Ved at krydse G9 flyver til UASdsRedS197Y,, repoGAL4 fluer, der VNCs fra afkom larver opnået med grønne axoner og rød glia, der kan optages i levende væv.

  1. Efter pooling 4-5 VNCs, som overdragelse 1 VNC til en ren farvning blok indeholdende 2 ml M3 PS, og stikke den abdominale halvdel af VNC er anført i punkt 3.
  2. Overfør det dolket VNC til en Poly-L-lysin belagt 3,5 mm glas bunden petriskål indeholdende 1 ml M3PS. Placer VNCs dorsale side nedad. Skub forsigtigt VNC på den flade side af en pincet til at tillade VNC at holde sig til fadet.
  3. Forsigtigt tilsættes 1 ml M3 PS 15% FBS gøre slutkoncentrationen af ​​FBS til 7,5%.
  4. Erhverve billeder ved hjælp af laser scanning konfokal mikroskopi. Scanne VNC, opsamling af en Z-del serie i hele sin tykkelse. Vi brugte en Leica SP2 inverteret konfokal mikroskop med en temperaturreguleret miljøkammer. Enhver tilsvarende konfokal mikroskop bør arbejde, men det kan kræve optimering af indstillingerne for scanning. Indstillingerne for vores time-lapse konfokal mikroskopi var som følger: Temperatur af miljøkammer: 25 ° C, 20X målet med 4 gange zoom, scanningstilstand xyzt, med 512x512 pixel opløsning, z = 1 um trin og 1-time eller 2 - time.
  • Leica SP2 konfokal mikroskop har en begrænsning i filstørrelse til scanning. Med disse indstillinger, kan 8-9 tidspunkter skal scannes. Medandre konfokale mikroskoper, burde det være muligt at erhverve billedstakke for længere tidspunkter, dvs over spændvidde på op til 24 timer.

6. Kultur og immunfarvning af stukket ned og Fixed VNCs

  1. Der fremstilles en 24-brønds vævskulturplade, der indeholder 500 gl M3 PS 7,5% FBS per brønd.
  2. Gentag dissektion af mere end 24 VNCs til en 24-brønds vævsdyrkningsskål.
  3. Ved hjælp af P20 Pipetman med spidsen cut-off, overfører 12 ikke-stukket VNCs fra puljen til dyrkningsskålen, under anvendelse af 1 VNC per brønd.
  4. Stab resten af ​​VNCs i puljen som beskrevet i afsnit 3. Overfør hver dolket VNC til en brønd hver.
  5. Placer 24 brønde skål i 25 ° C inkubator i en ønsket varighed afhænger af eksperimentet. Celleintegritet er uændret i mindst 24 timer.
  6. Efter dyrkning overføres de 12 VNCs i 250 pi 4% formaldehyd PEM i et 1,5 ml rør ved hjælp af P20 Pipetman med spidsen afskæring. Derefter fixative er omhyggeligt pipetteret ud, pas på ikke at beskadige VNCs. En lille mængde fiksativ tilstrækkelig til at dække prøverne bør forblive i hvert rør. Efterfølgende tilsættes frisk fiksativ, og ryst forsigtigt i 50 minutter ved stuetemperatur.
  7. Skylles 2 gange med 0,3% Triton X PBS, og derefter vaskes 2 gange i 10 minutter med 0,3% Triton X PBS ved stuetemperatur.
  8. Blok VNCs ved inkubering med 10% normalt gedeserum i 0,3% Triton X PBS i 1 timer ved stuetemperatur. Prøverne kan opbevares ved 4 ° C i mindst en måned.
  9. Inkuber VNCs med primære antistoffer i mere end 20 timer ved 4 ° C.
  10. Skylles 2 gange med 0,3% Triton X PBS, derefter vask 3 gange i 10 minutter med 0,3% Triton X PBS ved stuetemperatur.
  11. Inkuber VNCs med sekundære antistoffer i mere end 16 timer ved 4 ° C.
  12. Skylles 2 gange med 0,3% Triton X PBS, derefter vask 3 gange i 10 minutter med 0,3% Triton X PBS at room RT (i mørke, hvis der anvendes fluorescerende sekundære antistoffer).
  13. Erstat PBS med 50% glycerol: 50% PBS i mindst entime.
  14. Derefter erstatte med 80% glycerol: 20% PBS i mindst en time.
  15. Montér en VNC i et vindue lavet på 2 lag cello-tape (ca. 0,06 mm) på en mikroskopi objektglas. Juster orientering, og læg et dækglas (18x18 mm) over vinduet. To VNCs kan monteres på et objektglas ved denne metode.

Anvendelse af en række primære antistoffer, til skade forskellige cellulære responser kan analyseres (fx ændringer i celleantal og celleform).

7. Analysere data ved hjælp ImageJ og en række Plugins

Hvis VNC ikke har stikkende uafhængige degeneration, skal prøven være medtaget i til analyse uanset læsionsstørrelse. Som stikkende sker manuelt, det læsionsstørrelse forskellig hver gang. Det er derfor vigtigt at analysere statistisk virkningen af ​​stikkende, når det er muligt.

  1. Viklet størrelse måling. Størrelsen af såret er en indikator for reparation 15.Den jagende læsion er synlig som blottet for GFP-ekspression. Læsionsområde kan måles lapse data ved hjælp af frit tilgængelige ImageJ software, som følger:
    1. Ved hjælp af ImageJ, en stak konfokale billeder fra menuen "Filer" åbne, vælg "Import", og herfra vælge "Image sekvens". Dette vil vende indsamling af enkelte billeder i en stak.
    2. Næste ændre "stakken" i en "Hyperstack" ved at gå til "Image" menuen, vælg "Hyperstack", vælg derefter "Stack til Hyperstack".
    3. Indstil voxel størrelse ved hjælp af "Egenskaber" fra "Image" menuen. I indhentede data ved hjælp af Leica SP2 konfokal mikroskop, kan det voxelstørrelsen fås ved henvendelse til scanning-software, og fra metadata tekstfil gemt sammen med billeder. Med vores indstilling som beskrevet i afsnit 3, er pixeldimensioner XY = 0,366211 um og z = 0,99709 um.
    4. Ved at undersøge alle de skiver i én tidspunkt, trække den maksimale omrids af læsionen område med polygon-markeringsværktøjet på værktøjslinjen. Dette er denRegion Of Interest (ROI).
    5. Tilsæt ROI til ROI leder ved at gå til "Analyze"-menuen, rulle ned og vælge "Funktioner" og derefter på "ROI manager", og derefter "tilføj".
    6. Gentag dette for de alle de tidspunkter.
    7. Klik på "Measure" knappen i ROI manager til at få området størrelsen af ​​hver ROI.
  2. Korrektion af VNC bevægelser under tidsforskudte optagelser. "Stackreg" og "Turboreg" plugins 16 (fra den ImageJ website http://rsbweb.nih.gov/ij/ ): disse plugins gør det muligt at korrigere små prøver bevægelser under time-lapse. Byg en stak med en tilsvarende repræsentant optisk snit gennem hele tiden-points og anvende plugins. Det hjælper til at visualisere, hvordan læsionsprøver ændringer over tid. De nærmere detaljer om disse metoder og brugsanvisningen er tilgængelige fra forskergruppen, der har udviklet disse plugins. ( http://bigwww.epfl.ch / thevenaz / stackreg /).
  3. Automatisk optælling af gliaceller. "DeadEasy glia" plugin ( www.biosciences-labs.bham.ac.uk/hidalgo/Software.html ): Dette blev udviklet for at tælle antallet af REPO-positive glialceller i Drosophila larvernes VNC og undersøge ændringen i glial Antallet forårsaget ved at stikke skade 17. Den plug-in fungerer præcist, med en fejlmargen på 0,1% falske positiver og 4,3% falsk negative 17. For at bruge denne plug-in, første etiket al glia (undtagen midterlinjen) i prøven ved hjælp af immunofluorescens med anti-REPO antistoffer. Derefter installere plug-in i ImageJ, en stak konfokale billeder åbne og køre plug-in. Den tæller gliaceller automatisk i cirka 30 sekunder.
  4. Automatisk optælling af apoptotiske celler. "DeadEasy Caspase larver" plug-in ( www.biosciences-labs.bham.ac.uk/hidalgo/Software.html) 18: Dette blev udviklet til at tælle antallet af celler mærket med anti-spaltet-Caspase3, og en ny version er blevet tilpasset i larvernes VNCs. Stikkende skade forårsager en forøgelse i programmeret celledød 11. For at bruge denne plug-in, første etiket apoptotiske celler i prøven ved hjælp af immunofluorescens med anti-spaltet-caspase-3-antistoffer. Derefter installere plug-in i ImageJ, en stak konfokale billeder åbne og køre plug-in. Den tæller apoptotiske celler automatisk i cirka 30 sekunder.

8. Reagenser

  1. Dyrkningsmedium: Shield og Sang M3 insektmedium, 7,5% føtalt bovinserum, 1% penicillin og 1% streptomycin.
  2. 0,01% poly-L-lysin i sterilt DW.
  3. Fikseringsvæske: 4% formaldehyd, ultrarent i PEM (0,1 M PIPES, 2 mM EGTA, 1 mM MgSO4) opløsning.
  4. Blokeringsopløsning til immunfarvning: 10% normalt gedeserum i 0,3% Triton X PBS.
  5. Anti-glutaminsynthetase2-antistoffer: 1:250 i blokeringsopløsning.
  6. Anti-GFP-antistoffer: 1:1000 i blokeringsopløsning.
  7. Anti-REPO antistoffer: 1:250 i blokeringsopløsning.
  8. Anti-ELAV antistoffer: 1:250 i blokeringsopløsning.
  9. Anti-spaltede caspase-3-antistoffer: 1:1000 i blokeringsopløsning.
  10. Sekundære antistoffer: 1:250 i blokeringsopløsning.

Representative Results

Her viser vi, hvordan du udfører jagende skade på Drosophila larvernes VNC og analysere de cellulære reaktioner til skade ved hjælp af time-lapse og immunfarvning konfokal fluorescens mikroskopi.

Til tidsforskudte data, er læsionen visualiseres som en GFP-negative område i neuropile af enheder forsynet med G9 axonal markør (fig. 2). Kort efter stikkende, lille GFP-negative områder, som ligner huller eller vakuoler, begynder at dukke op (Figur 2A). Sådanne GFP-negative områder generelt større op til omkring 6-8 timer efter stikkende (figur 2A). Efterfølgende GFP-negative områder skrumpe og kan endda forsvinde (figur 2B). Med 22 timer efter stikkende, er arealet såret generelt er mindre end det maksimale areal var på 6-8 timer efter stikkende (fig. 2a, b). Tilsvarende DsRed-negative område i glia processer først stiger også, men shrinks med 22 timer efter knivstikkeri. Interessant nok ofte DsRed-positive glial processer fylde GFP-negative huller i neuropile forud for deres forsvinden (figur 2C).

Brug af immunofarvning i faste prøver, fine gliaceller processer og deres reaktion på skaden kan visualiseres med bedre opløsning end med time-lapse billeder. Dette kan gøres for eksempel ved hjælp af repoGAL4 glial føreren at inducere ekspressionen af en membran tethered reporter (fx UAS-mCD8GFP) i fluer visualisere alle glialceller (undtagen midterlinjen glia). Det kan også kombineres med andre glial markører, såsom anti-GS2, der etiketter neuropile-associerede glialceller (figur 3A, B). Her viser vi, at selv om den ventrale nerve ledningen er stukket fra den dorsale side, jagende skade resulterer i en bule ventralt (figur 3A, pilespidser). Jagende synes at påvirke mere alvorligt den neuropile og neuropile-associeret glialceller then overflade og cortex gliaceller (figur 3B). Gliale processer vises uorganiserede i neuropile, mens de stadig bevare deres maske ligesom organisation i cortex. Skade medfører GS2-positive celleaffald, som er forskellig fra normale celler som rester fragmenter er meget mindre og ikke forbundet med en cellelegemet. Dette viser beskadigelse neuropile-associerede glialceller (figur 3B). Degenererende neuropile-associerede glialceller blev også observeret ved elektronmikroskopi 15. Anti-spaltet-caspase 3 + apoptose farvning observeret i neuropile-associerede glialceller 15, viser, at de undergår apoptose ved knivstikkeri skade. Neuropile associerede glialceller blev også påvist at fagocytere neuronal debris 15 og GS2 + signal kan også afsløre engulfment af apoptotiske neuroner fra glia-processer. Kløvet-caspase + apoptotiske celler er også observeret i cortex, i det mindste nogle af dem svarer til Elav + neuroner (

Brug af faste prøver og immunfarvning muliggør også kvantitative analyser af cellulære responser til skade, såsom virkninger i proliferation og apoptose. Til dette, bevidst vi udviklet to ImageJ plug-ins, DeadEasy Caspase Larva og DeadEasy glia, at tælle automatisk antallet af gliaceller og apoptotiske celler hhv. De er blevet valideret til at arbejde på larvernes VNCs og er meget præcise. Ved hjælp af disse er det muligt at observere en forøgelse i antallet af REPO-positive glialceller forårsaget af stikkende skade ved 22 timer (figur 4A) 15. Der er også en stigning i antallet af anti-spaltet-caspase-3 apoptotiske celler efter 6 timer efter stikkende (figur 4B) 15. En sådan stigning i glial proliferation og apoptose som respons på skade i Drosophila CNS minder om den skade respons på de hvirveldyr CNS.

Et afgørende aspekt af denne protocol er kvaliteten af ​​VNC dissektioner. Det er vanskeligt at sige på tidspunktet for dissektion, om VNCs er blevet beskadiget eller ikke i processen. Det er vigtigt at være særlig opmærksom for at udføre blide dissektioner. Imidlertid vil dårlig kvalitet prøver uundgåeligt opstå, og det er vigtigt, at disse er identificeret på et senere tidspunkt og bortkastet. I vores hænder, synes VNC degeneration at være relateret til skade, men i stedet som følge af grov dissektion. Vi har ikke observeret en kritisk størrelse i skade såret, og vi analysere alle tilskadekomne prøver, der ikke nedbrydes. Når VNCs opretholde deres integritet, VNC overflade tendens til at se glat og skinnende, og ingen huller i neuropile overholdes (figur 5A). Nedbrydning af VNCs kan genkendes af 24 h efter dissektion fra den ru overflade af VNC ventrale og laterale områder (figur 5B). Nedbrydning af neuropile relateret til stikkende skade kan også forekomme, og det er anerkendt som neuropile holes i baggrundssignalet af immunofarvede prøver. Prøver med disse tegn på degeneration skal kasseres (figur 5C). I vores hænder, er succesraten for dissektion og skade i intakt og stak kontrol (yw) fluer både omkring 70%. Denne hastighed vil variere med dygtighed af den person, der udfører forsøgene, og med genotypen.

Figur 1
Figur 1. Skematisk tegning af larvernes rastende og jagende skade. (A) I dag 0, er fluer lov til at lægge æg i et druesaft petriskål i 3 timer. På dag 1, (L1) det skraverede 1. Stadiums larver indsamles og anbragt i hætteglas indeholdende standard gær fødevarer, hvor de holdes i yderligere 3 dage. På dag 4, er larver udtaget af fødevarer, hætteglas, og anvendt til stikkende eksperimenter. (B) sidebillede af larvestadium centralnervesystemet.Det abdominale område hos den ventrale nerve ledningen er stukket med en kanyle fra den dorsale side. Anterior er til venstre, og posteriore til højre.

Figur 2
Figur 2. Time-lapse progression af VNC læsion. Konfokal mikroskopi på levende VNCs med GFP-mærkede axoner og DsRed-mærkede gliaceller. Genotype:. UASDsRed / +, G9 / +, repoGAL4 / + (A) Læsionen genkendes af manglen på fluorescens på axonal neuropile. Efter knivstikkeri, synes GFP-negative huller, derefter vokser i størrelse og antal. Fremskrivninger af 5 optiske sektioner fra hvert tidspunkt efter knivoverfald skade. (B) De axonale neuropile læsion skrumper fra 9 timer efter knivoverfald. Disse billeder er enkelte optiske sektioner fra forskellige tidspunkter efter knivoverfald skade. At identificere tilsvarende positioner i hver prøve, den samme skive nummer fra each tidspunkt i stablen af ​​tidsforskudte data blev valgt. Ved at sammenligne de mønstre visualiseret med G9 og repoGAL4> UASmCD8GFP i området ikke af den stikkende, blev skiverne verificeres som kommende fra ækvivalente positioner i Z-aksen. Punkterede linier i (A, B) viser kanten af såret. (C) Stor forstørrelse af sår på neuropile. GFP-negative huller blev fyldt med DsRed-positive glial processer, og efterfølgende forsvandt (pilespidser). Vandret billede. Anterior up.

Figur 3
Figur 3. Cellulære karakterisering af VNC læsion. VNCs bærer en membran tøjret GFP reporter for alle gliaceller (undtagen midterlinjen glia) farvet med anti-GFP-og anti-GS2, en neuropile-associeret glia cellemarkør. Genotype:. + / +, UASmCD8GFP / +, repoGAL4 / + (A) VNCs blev stukket ned fra dorsal side, men dette bevirker en bule ventralt (pilespidser). Sagittalbillede af enkelte optiske sektioner, dorsal op og forreste venstre. (A, B) Stabbing skaden påvirker mere alvorligt neuropile-associerede glialceller end cortex og overfladen gliaceller. Skade medfører GS2-positive cellerester (pilespidser i B). (B) vandret billede af enkelte optiske sektioner, anterior up. Pilespidser peger på GS2 + cellerester. (C) Colocalisation af det apoptotiske markør anti-spaltet-caspase-3 og den neuronale markør anti-Elav viser, at efter skade nogle af de døende celler i cortex er neuroner. np, neuropile, cx, cortex.

Figur 4
Figur 4. Automatisk optælling af gliaceller og apoptotiske celler ved hjælp DeadEasy. (A) Eksempel på brug af »DeadEasy Larvernes glia 'tælle REPO positivglialceller. Venstre: VNC ventrale halvdele farvet med anti-REPO-antistoffer; midten: output fra DeadEasy Larvernes glia viser celler identificeret ved plug-in, højre: fusionere. Tallene til højre er antallet af REPO-positive celler talt automatisk i en hel stak af optiske konfokale sektioner i cirka 30 sekunder. Antallet af glia stigninger i de stukket VNCs. (B) Eksempel på brug af »DeadEasy Caspase larve«. Venstre: fremskrivninger af 5 optiske konfokale sektioner farvet med anti-spaltet-caspase 3-antistoffer, midten: output viser celler identificeret ved plug-in, højre: Flet. Numrene til højre er antallet af caspase-positive celler talt automatisk i en hel stak af optiske konfokale sektioner i cirka 30 sekunder. Antallet af apoptotiske celler stiger i stukket VNC.

Figur 5
Figur 5. Eksempler på degeneration. (A) En sund VNC. Der er ingen tegn på degeneration. (B) side af brystkassen er degenererende (pilespidser) i en stukket prøve. Asterisk angiver læsionsstedet. (C) Huller i thorax neuropile (hvidt pilespids) og cortex (orange pilespids) i en ikke-stukket VNC. Prøver med beskadigede neuropile og omfattende vakuolisering skal kasseres. Her VNCs blev farvet med neuropile associerede glial marker anti-Ebony. Vandret billede, anterior up.

Discussion

Vi har etableret en protokol for stikkende skade på Drosophila larvestadium CNS at undersøge de cellulære reaktioner til skade, reparation og regeneration. Larve VNCs dissekeres og stak, hvorefter de bliver filmet med time-lapse mikroskopi eller fastsat for fluorescens immunfarvning at visualisere glia og neuroner, apoptose eller celledeling. Progression af læsionen over tid kan måles. Denne fremgangsmåde er ledsaget af vilje udviklet software til kvantitativ og statistisk analyse af celleantal ændringer efter skade og under reparation.

Vi dolkede 96-timer AEL larver (og disse blev enten fast eller lov til at udvikle sig yderligere), en udviklingsstadiet forud for overgangen til puppe og derefter voksen flue. Ved 96 timer er VNCs store nok til stikkende, de er i midten af ​​tredje stadium, de er altså ikke undergår forpupningen endnu, og nervesystemet er allerede fuldt funktionelt svarer til adULT. Det kunne være muligt at stikke lidt senere i larver og den præcise timing skal vælges, så den passer til forskningsspørgsmålet. Imidlertid afhængigt af de adresserede spørgsmål, vil det normalt være nødvendigt at dyrke de VNCs i nogen tid at overholde de cellulære responser på skade. Nogen tid efter 120 hr AEL forpupningen starter, en periode, hvor CNS er remodeled og er dermed bedst undgås. Således tidsvindue for knivstikkeri plus kultur i Larven er temmelig begrænset. Brug af larver stadig har en stor teknisk fordel i forhold til anvendelse af voksne: mens lighed med den voksne, nervesystemet er allerede fuldt funktionel, er ved at analysere reaktion på beskadigelse betydeligt lettere og hurtigere i larver.

Ved sammenligning af størrelsen og morfologien af hjerner og VNCs dissekeret og dyrket i en skål til VNCs, der er dissekeret fra et tilsvarende senere tidspunkt uden dyrkning i et fad, fremgår det, at udvikling er langsommere i kultur end in vivo. I andre henseenderudvikling udøver normalt i kultur, er væv integritet bevares, og celler i live viser flere svar. Wound ekspansion, neuropile reparation og glial proliferation finder sted inden for 22 timer efter stikkende. Dette viser, at cellulære reaktioner på skader finder sted i kulturen, og der er sandsynligvis ikke nødvendigt for at opretholde de eksplantater længere end en dag. Hvis langsigtet kultur blev ønskes, kan protokollen kræve yderligere optimering såsom anvendelse af en kulturplade indsatsen 5.

Det er vigtigt at identificere god kvalitet prøver fra de degenererende dem. Optimering denne protokol tager nogle færdigheder og uundgåeligt degeneration vil forekomme i nogle prøver. VNC kan erhverve en »blomkål« udseende, der afspejler en nedbrydning af væv integritet (figur 5B). Degeneration er også anerkendt af vakuolisering af det VNC uafhængigt af den stikkende, som kan være til stede i intakte, ikke-stukket prøver (figur 5C

I denne protokol, tog vi fordel af et protein fælde linje af fluer til at visualisere neuropile parallelt med visualisering af gliaceller processer ved hjælp af traditionelle GAL4-UAS-system. Disse værktøjer kan også kombineres med andre binære ekspressionssystemer såsom LeXA 19 og Q-systemet 20, der er uafhængige af GAL4. Dette ville muliggøre analysen af ​​interaktioner for eksempel mellem axoner og glia processer, som respons på skade. Ved yderligere at kombinere det med andre genetiske værktøjer såsom reportere til dendritter 21 eller calciumtilstrømning 22, giver denne metode en stor mulighed for at analysere cellebiologi bag skade respons af gliaceller, neuronale axoner og dendritter i CNS. Endelig kan denne metode kombineres med standard genetik, mutationer og overekspression af gener, for at teste genfunktion i reaktioner på skader og regenerering.

Denne protokol er med held ført til opdagelsen af et gen net ligger til grund for regenerative glial respons på CNS-skade 11. I betragtning af den evolutionære bevarelse af genfunktion, optrevling disse cellulære begivenheder og genfunktioner i frugt-fluer sandsynligvis give betydelige indsigt i forståelsen af ​​mammalian CNS reaktion på beskadigelse og regeneration.

Disclosures

Ingen interessekonflikt erklæret.

Acknowledgments

Vi takker Mei Ann Lim for kritisk gennemlæsning af manuskriptet og andre medlemmer af vores laboratorium for deres drøftelser i hele forløbet af dette arbejde. Dette arbejde blev finansieret af Yamada Science Foundation og Royal Society korte besøg Stipendier og EU Marie Curie International Incoming Fellowship GRR til KK, og BBSRC Project Grant (BB/H002278/1) og Wellcome Trust Equipment Grant (073228/Z/03/Z) til AH

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Staining block Brunel Microscope
Forceps No. 5 Fine Science Tools e.g. 11251-20
Tungsten needle: rod diameter, 0.5 mm; tip size, 1 μm; length, 2 inch Roboz Surgical Instrument RS-6065
Needle holder Roboz Surgical Instrument RS-6060
Arkansans stones: Repair Kit for Dumont Forceps Fine Science Tools 29000-00
35 mm Petri dish with 27 mm glass base Iwaki 3930-035
Leica SP2-AOBS confocal inverted microscope with environment chamber Leica
Reagent
Shield and Sang M3 insect medium (ecdysone free) Sigma S3652-500 ml
Penicillin and streptomycin Invitrogen 15070-063
Phosphate-buffered saline (PBS) See 12
FBS Sigma F7524
Poly-L-lysin Sigma P1399-25mg
Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure Polysciences 04018-1
Mouse anti-glutamine synthetase antibodies Millipore MAB302
Rabbit anti-GFP antibodies Life technologies A11122
Mouse anti-REPO antibodies Developmental Studies Hybridoma bank 8D12
Rat anti-ELAV antibodies Developmental Studies Hybridoma bank 7E8A10
Rabbit anti-active caspase 3 antibodies Abcam ab13847
Normal goat serum Vector Laboratories S-1000
Anti-rabbit Alexa Fluor 488 Life technologies A11034
Anti-mouse Alexa Fluor 647 Life technologies A21236
Anti-rat Alexa Fluor 647 Life technologies A21247

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fang, Y., Soares, L., Teng, X., Geary, M., Bonini, N. M. A novel Drosophila model of nerve injury reveals an essential role of Nmnat in maintaining axonal integrity. Curr. Biol. 22, 590-595 (2012).
  2. Xiong, X., et al. Protein turnover of the Wallenda/DLK kinase regulates a retrograde response to axonal injury. J. Cell Biol. 191, 211-223 (2010).
  3. Leyssen, M., et al. Amyloid precursor protein promotes post-developmental neurite arborization in the Drosophila brain. EMBO J. 24, 2944-2955 (2005).
  4. Kato, K., Awasaki, T., Ito, K. Neuronal programmed cell death induces glial cell division in the adult Drosophila brain. Development. 136, 51-59 (2009).
  5. Ayaz, D., et al. Axonal injury and regeneration in the adult brain of Drosophila. J. Neurosci. 28, 6010-6021 (2008).
  6. Rohrbough, J., O'Dowd, D. K., Baines, R. A., Broadie, K. Cellular bases of behavioral plasticity: establishing and modifying synaptic circuits in the Drosophila genetic system. J. Neurobiol. 54, 254-271 (2003).
  7. Babcock, D. T., Landry, C., Galko, M. J. Cytokine signaling mediates UV-induced nociceptive sensitization in Drosophila larvae. Curr. Biol. 19, 799-806 (2009).
  8. Gomez-Marin, A., Louis, M. Active sensation during orientation behavior in the Drosophila larva: more sense than luck. Curr. Opin. Neurobiol. 22, 208-215 (2012).
  9. Schleyer, M., et al. A behavior-based circuit model of how outcome expectations organize learned behavior in larval Drosophila. Learn Mem. 18, 639-653 (2011).
  10. Brown, H. L., Cherbas, L., Cherbas, P., Truman, J. W. Use of time-lapse imaging and dominant negative receptors to dissect the steroid receptor control of neuronal remodeling in Drosophila. Development. 133, 275-285 (2006).
  11. Kato, K., Forero, M. G., Fenton, J. C., Hidalgo, A. The glial regenerative response to central nervous system injury is enabled by pros-notch and pros-NFkappaB feedback. PLoS Biol. 9, e1001133 (2011).
  12. Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. Drosophila protocols. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
  13. Morin, X., Daneman, R., Zavortink, M., Chia, W. A protein trap strategy to detect GFP-tagged proteins expressed from their endogenous loci in Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 15050-15055 (2001).
  14. Verkhusha, V. V., et al. An enhanced mutant of red fluorescent protein DsRed for double labeling and developmental timer of neural fiber bundle formation. J. Biol. Chem. 276, 29621-29624 (2001).
  15. Kato, K., Forero, M. G., Fenton, J. C., Hidalgo, A. The glial regenerative response to central nervous system injury is enabled by Pros-Notch and Pros-NFkB feedback. PLoS Biol. 9, e1001133 (2011).
  16. Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing: A Publication of the IEEE Signal Processing Society. 7, 27-41 (1998).
  17. Forero, M. G., Kato, K., Hidalgo, A. Automatic cell counting in vivo in the larval nervous system of Drosophila. J. Microsc. 46, 202-212 (2012).
  18. Forero, M. G., Pennack, J. A., Learte, A. R., Hidalgo, A. DeadEasy caspase: automatic counting of apoptotic cells in Drosophila. PLoS One. 4, e5441 (2009).
  19. Lai, S. L., Lee, T. Genetic mosaic with dual binary transcriptional systems in Drosophila. Nat. Neurosci. 9, 703-709 (2006).
  20. Potter, C. J., Tasic, B., Russler, E. V., Liang, L., Luo, L. The Q system: a repressible binary system for transgene expression, lineage tracing, and mosaic analysis. Cell. 141, 536-548 (2010).
  21. Nicolai, L. J., et al. Genetically encoded dendritic marker sheds light on neuronal connectivity in Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 20553-20558 (2010).
  22. Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nat. Methods. 6, 875-881 (2009).

Tags

Neurobiologisk Developmental Biology Neuroscience Molekylærbiologi Cellular Biology anatomi fysiologi Bioengineering Central Nervous System neuroglia, Bananfluen dyremodeller sår og skader Cell fysiologiske fænomener genetiske fænomener skade reparation regenerering centralnervesystemet ventral nerve ledning larver levende billeddannelse celletælling Repo GS2 glia neuroner nerver CNS dyremodel
En skade Paradigm at undersøge centrale nervesystem reparation i<em&gt; Drosophila</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kato, K., Hidalgo, A. An Injury… More

Kato, K., Hidalgo, A. An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila. J. Vis. Exp. (73), e50306, doi:10.3791/50306 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter