Summary
הפרדיגמה פציעה באמצעות כבל עצב גחון תסיסנית הזחל לחקור התחדשות במערכת עצבים מרכזיות ותיקון מתואר. דקירה ואחרי סריקת הליזר מיקרוסקופיה confocal בדגימות זמן לשגות וקבועים, בשילוב עם ניתוח הכמותי עם תוכנה שפותחה בתכליתיות וגנטיקה, משמשת כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים של התחדשות ותיקון מערכת עצבים מרכזיים.
Abstract
שיטה ניסיונית פותחה כדי לחקור את התגובות התאיות למערכת עצבים מרכזיות (CNS) באמצעות פגיעת זבוב פרות דרוזופילה. תיקון הבנה והתחדשות בבעלי חיים הוא שאלת מפתח בביולוגיה. מערכת העצבים מרכזיים האדם שנפגעה אינה מתחדשת, וההבנה כיצד לקדם ההתחדשות היא האחת מטרות העיקריות של רפואת מדעי המוח. ערכת כלים הגנטית הרבה העצמה של דרוזופילה ניתן להשתמש כדי להתמודד עם הבעיה של התחדשות מערכת עצבים מרכזיים.
נגע לצינור עצבי גחון CNS (VNC, שווה ערך לחוט שדרת חוליות) מיושם באופן ידני עם מחט טונגסטן. VNC לאחר מכן ניתן יהיה צולם בזמן לשגות באמצעות מיקרוסקופיה confocal סריקת ליזר של עד 24 שעות לעקוב אחר התפתחותו של הנגע לאורך זמן. לחלופין, הוא יכול להיות מתורבת, אז קובע ונצבע באמצעות immunofluorescence לדמיין נוירון ותאי גליה עם מיקרוסקופיה confocal. שימוש בסמנים מתאימים, צ'הnges במורפולוגיה של תא ותא המדינה כתוצאה מפציעה יכולה להיות חזותי. עם ImageJ ובכוונה פתח תוספות, ניתוחים כמותיים וסטטיסטיים יכולים להתבצע כדי למדוד שינויים בגודל פצע לאורך זמן ואת ההשפעות של פגיעה בתרבות של תאים ומוות של תאים. שיטות אלו מאפשרות ניתוח של מדגמים גדולים. הם יכולים להיות משולבים עם הגנטיקה החזקה של דרוזופילה לחקור את המנגנונים המולקולריים שבבסיס התחדשות ותיקון מערכת עצבים מרכזיים.
Introduction
התחדשות בחיות מגלה כי תאים לחוש כאשר צמיחת האורגניזם הוא הורה ושלם, וכיצד מבני שלמות האורגניזם מושג ומתוחזק. הבנת היכולות המסתוריות של תאים היא עניין רב בביולוגיה. קידום התחדשות הוא אחד מהיעדים המרכזיים לרפואת מדעי המוח. בבני אדם, מערכת העצבים המרכזית הפגועה (מערכת עצבים מרכזיים) אינה מתחדשת. מכרסמים של פגיעה בחוט שדרה משמשים להבין כיצד תאים מגיבים לפציעה. עם זאת, שיקולים אתיים, עלויות גבוהות ומחזור החיים של בעלי החיים האיטי להגביל התקדמות.
זבוב פרות דרוזופילה היא אורגניזם מודל שימוש נרחב בביולוגיה התפתחותית ומדעי המוח. תודה לכלים רבים עצמה הגנטיים ומחזור חיים קצר, דרוזופילה הובילה חוזרת ונשנתה לגילוי פונקציות גנים ורשתות גנים עם רלוונטיות להבנה של בני אדם ומחלות. יש ראיות רבות לקון אבולוציוניתservation של תפקוד גן מזבובים ובני האדם.
בשנים האחרונות, כמה פרדיגמות בגין ניזקי מערכת עצבים הוקמו בדרוזופילה. חלק מורכב של פגיעה בעצבים היקפיים שרצים לאורך הכנף או axotomy של עצבים היקפיים, כולל 1 חושי והמוטוריים אקסונים 2. עם זאת, במערכת העצבים ההיקפית ומרכזית שונות במובנים רבים, וזה ידוע שבעלי חיים רבים במערכת העצבים ההיקפית יכולה להתחדש ואילו מערכת העצבים המרכזיים לא יכולה. לכן, כדי להבין את התחדשות מערכת עצבים מרכזיים, פגיעה ישירה למערכת העצבים המרכזיים הוא יותר מתאים. פציעת דקירה במחט כבר מיושם בהצלחה במוח הבוגר תסיסנית לחקור תגובה לפציעת 3,4. שימוש בגישה אחרת, Ayaz et al. האקסונים במערכת עצבים מרכזיים כרותים במוחות בוגרי תרבית עם Piezo הכח microdissector, ונתחו התחדשותם במשך 4 ימים 5. היתרון של אלה u הסט מאוחר יותר הניסיונינ.ב. הוא שהם מתמקדים במוח, שהוא ללא ספק עניין רב. החסרון הוא שהמוח הוא הרבה יותר מורכב מVNC, שעוסק אך ורק עם מנוע ובקרה חושית. עובד על המוח המבוגר הוא גם זמן רב יותר. הזחל מוכן לניסויים ב4 ימים, בעוד שזה לוקח בערך 10 ימים לeclosion המבוגר, ולאחר מכן 5 ימים נוספים להבשלה שלהם. המוח המבוגר הוא גם קשה יותר לטיפול, משום שהוא מגולם בציפורן עבה, שקשה להסיר. VNC יש אטרקציה הנוספת של להיות פונקציונלי שווה חוליות עמוד השדרה.
זחל תסיסנית נעשה שימוש נרחב כאורגניזם מודל למדעי המוח 6-9. למרות שרשמית הוא הזחל בשלב התפתחותי, זה יכול להיות גם נחשב חיה מתפקדת במלואה. הזחל יש חושים, תנועה מרובים כולל olfaction, טעם וnociception, ולמידה וזיכרון. לפיכך, הזחל VNC wכנבחר כמודל האידיאלי לפגיעה במערכת עצבים מרכזיים.
VNCs זחל וגלמים ניתן גזור ותרבית בצלחת, עדיין שמור על יושרה סלולרית לתקופה של עד 24 שעות 10. זה הציע כי פגיעה יכולה להיות מיושמת על VNC, שאז יכול להיות מוקלט בזמן לשגות במשך פרק זמן זה, או בתרבית וקבועה בכל נקודת זמן רצוי בתוך תקופה זו.
כאן, אנו מציגים פרדיגמה ניסויית לפגיעה במערכת עצבים מרכזיים באמצעות רימות דרוזופילה VNC. VNC היא גזורה ראשונה מהזחל, ופציעת דקירה מיושמת באופן ידני עם מחט טונגסטן. VNC מניח בcoverslip זכוכית תחתונה, וצולם בליזר זמן לשגות מיקרוסקופיית confocal. לחלופין, את יכול להיות מתורבת VNCs לתקופה רצויה של זמן, ואת ההשפעות הסלולר של פציעה ניתן לנתח בדגימות קבועות באמצעות immunostaining ומיקרוסקופיה confocal. אזור הפצע ניתן למדוד, וניתוח כמותי של תא נוmber (שגשוג תאים ומות תאים) יכול להתבצע בתוכנה שפותחה בכוונה. מדגמים גדולים ניתן לטפל בקלות, וכתוצאה מכך תוצאות תוקף סטטיסטי. שיטות אלו היו משולבות בהצלחה עם הגנטיקה החזקה של דרוזופילה לגלות רשת גנים שבבסיס תגובת משובי גלייה לפציעת מערכת עצבים מרכזיים 11.
Protocol
1. אוסף של זחלים מבוימים
- מקום 15 נשים ו 15 גברי זבובים בוגרים בכלוב פרספקס גלילי כדי להטיל את ביצים בצלחת פטרי עם אגר ומיץ ענבים בתוספת סקופ קטן של שמרים להדביק על 3 שעות ב 25 ° C. שנה את הצלחת 3-4 פעמים ביום, וזורק את הצלחת הראשונה (כלומר מO / N הביצה החילונית). השלך גם את הצלחות מהיום הראשון. מהיום השני, להמשיך את הצלחות עם ביצים על 25 ° C. לאחר 7 ימים של איסוף ביצים, להתחיל עם חדש להגדיר של זבובים הוריים.
- לאחר כ 24 שעות, זחלים בוקעים מן הביצים. על ידי משדל זחלים במכחול דליל או עם זוג מלקחיים, להעביר 35 זחלים מאגר ענבים לבקבוקון המכיל מזון זבוב סטנדרטי (10 מ"ל) (איור 1 א).
- שמור את הבקבוקונים המכילים זחלים במשך 3 ימים (96 שעות לאחר הטלת ביצים, AEL) בשעת 25 ° C.
2. נתיחה של מייתרי עצב גחון זחל לתרבות
- נקה להיותNCH וידות עם אתנול 70%. משרה 4 בלוקים מכתימים, 2 זוגות מלקחיים ומחט עם אתנול 70%, ולתת לאוויר יבש.
- הכן 4 בלוקי צביעה עם התקשורת הבאה: אחת עם מים מזוקקים (DW) כדי לנקות וזחלי ברכה ניקו; שני עם 2 מ"ל של חומה ובינונית חרקי סאנג M3 עם 1% פניצילין וסטרפטומיצין, Ecdysone חינם (M3 נ.ב. בינוני) לנתח את הזחלים; שלישי עם 2 מ"ל של מדיום M3 נ.ב. לברכת מייתרי עצב גחון גזור (VNCs); ורביעי עם 2 מ"ל של מדיום נ.ב. M3 לדקור את VNCs. כל ריאגנטים לקבל מראש חמם לRT.
- מוסיף מים לבקבוקון המכיל זחלי 96 שעות AEL. ואז, על ידי שימוש במרית, בעדינות להפיץ מזון עם זחלים מהבקבוקון על מגבת נייר רטובה. העברת 10 זחלים לבלוק צביעה המכיל DW כדי לשטוף את המזון. חלף 6 פעמי DW. ואז להחליף עם מדיום נ.ב. M3.
- להעביר את אחד מהזחלים לבלוק הכתמה המכיל 2 מ"ל של מדיום נ.ב. M3.
- תחת מיקרוסקופ לנתח, דיssect מוח זחל בזהירות בעזרת שיטות סטנדרטיות 12, אך כדי למזער את הניזק לרקמות, לקבל טיפול מיוחד על ידי שימשיך בדרך הבאה. הנח את הצד הגבה זחל, ולהחזיק את הצד הגבה בשליש מהקצה הקדמי עם 2 זוגות של מלקחיים (אחד בכל יד). במקביל את הסעיף הקדמי, למשוך את הקצה האחורי עם המלקחיים, ולקרוע את האפידרמיס. המוח וVNC צריך להיות גלוי מהקצה האחורי של המחצית הקדמית. זהירות לבודד את המוח והמורכב VNC על ידי הסרת גוף, הבטן והאפידרמיס שומן. כאשר VNCs ניזוק יותר מדי, את VNCs יידרדר באופן מלא או באופן חלקי גם ללא דקירת פציעה. קח בחשבון את הנקודות הבאות:
- אין למשוך או לקרוע את הדיסקים דמיוניים ועצבים היקפיים מVNC החזה כדבר יפגע VNC. כדי לחתוך את העצבים ההיקפיים, להחזיק את העצבים ההיקפיים עם שני זוגות המלקחיים הממוקמים קרוב אחד לשני, ולאחר מכן למשוך את העצבים עם לceps. דיסקים דמיוניים וחלקי פה ניתן להשאיר מצורפים VNC.
- השאר את הבלוטה ובלוטת הלימפה הטבעת המחוברת למוח.
- חותך את הבטן בנקודה הקרובה ביותר למוח, שם לא הרבה אוכל הוא הכיל.
- באמצעות P20 pipetman עם הקצה נותק והתרחב קצת, להעביר את VNC לבלוק צביעה המכיל בינוני נ.ב. M3 טרי. לפני העברת VNC, פיפטה 1 למעלה ולמטה רק בינוני משמש לנתיחה על מנת למנוע VNC מלהידבק אל הקצה.
3. דקירת פגיעת תסיסנית זחל VNC
סעיף זה מתאר כיצד לבצע פציעת דקירה לVNCs, ותכין VNCs נדקר לניתוח זמן לשגות וimmunostaining. תנאי הודעת דוקרים-התרבות והמשך מתוארים בסעיף 5 (לניתוח זמן לשגות) ובסעיף 6 (לimmunostaining).
- לאחר איגום מספיק VNCs (4-5 לזמן לשגותומעל 24 לimmunostaining), העברה אחת VNC לבלוק צביעה נקיה המכיל M3 PS.
- אוריינט VNC כך שneuropile הגבה הוא בתצוגה תחת מיקרוסקופ לנתח (1B איור). זוהי הנטייה הטבעית ביותר לVNCs לשקר בכאשר מצורפים אל האונות האופטיות.
- לדקור באופן ידני באמצעות מחט טונגסטן תחת המיקרוסקופ לנתיחה, מהצד הגבה כמעט בזווית ישרה ומכוון למחצית הבטן של VNC (1B איור).
קח לתשומת לב מיוחדת לתנאים הבאים:
- לדקור רק פעם אחת.
- לדקור עד שהמחט פוגע בתחתית הכוס. עם זאת, יש להיזהר שלא לפגוע בקצה המחט.
- גזעו של בעל המחט אסור לגעת במדיום בדקירה.
- הפצע אינו גלוי תחת המיקרוסקופ לנתיחה.
הערה: לדקירות פציעת ניוון קשור
ההליךיכול לגרום לניוון סלולרי בתוך VNC להבדיל מנגע הדקירה. תוצאות בניוון חורים בneuropile, ולעתים חורים נצפו בקליפת המוח של דגימות לא דקרה. דגימות עם ניוון משפיע ניוון neuropile או נפוץ משפיע גם על פני שטח VNC חייבות להיות מושלכות. ניוון יכול להיות מזוהה באופן הבא:
- משטח מחוספס, במיוחד באזור הרוחב / גחון של בית החזה, בגיל 22 שעות של דקירה. במקרים קיצוניים, VNC נראה בלט.
- חורים או vacuoles בneuropile החזה, שיכול להיות גלויה כמו חורים באות רקע עם immunostaining פלואורסצנטי.
4. תחזוקה של מחט ומלקחיים
- באופן שגרתי לבדוק אם קצה המחט הוא חד מספיק. קצה המחט יכול להיות כפוף או בוטה לאחר השימוש בו במשך כמה ניסויים. במקרה זה, לחדד את הקצה באמצעות אבן או שווה ערך ארקנסו.
- קצות המלקחיים חייביםנפגש בצורה מושלמת. העצות יכולות להיפגע עם שימוש. במקרה זה, להתאים את הקצה באמצעות ארקנסו אבנים או שווה ערך.
5. תרבות וזמן לשגות הקלטה של VNCs נדקר
כדי להמחיש neuropile axonal בחי VNC, קו מלכודת חלבון GFP שמתייג את כל האקסונים - G9 13 - ניתן להשתמש בם, וכדי להמחיש את כל תאי גליה (למעט גליה קו האמצע) נהג גליה repoGAL4 יכול לשמש כדי להביע UASdsRed S197Y 14 כתב. על ידי המעבר G9 טס לUASdsRedS197Y;; repoGAL4 זבובים, VNCs מזחלי צאצאים מתקבלים עם אקסונים ירוקים וגליה אדומה שניתן שנרשמו ברקמת חיה.
- לאחר VNCs האיגום 4-5, ההעברה 1 VNC לבלוק צביעה נקיה המכיל 2 מ"ל של M3 PS, ולדקור את מחצית הבטן של VNC כמצוין בסעיף 3.
- להעביר את VNC נדקר למנת פולי-L-מסן מצופית 3.5 מ"מ זכוכית תחתונה פטרי המכיל 1 מ"ל של M3נ.ב.. הנח את הצד הגבה VNCs למטה. לחץ בעדינות על VNC באמצעות הצד השטוח של זוג מלקחיים כדי לאפשר VNC להיצמד למנה.
- בעדינות להוסיף 1 מ"ל של M3 נ.ב. 15% FBS טיוח הריכוז הסופי של FBS ל -7.5%.
- לרכוש תמונות באמצעות סריקת הליזר מיקרוסקופ confocal. סרוק את VNC, איסוף סדרת Z-סעיף לאורך כל העובי שלו. אנחנו השתמשנו במיקרוסקופ confocal הפוך היקה SP2 עם קאמרי סביבתי טמפרטורה מבוקרת. כל confocal מיקרוסקופ המקביל צריך לעבוד, אולם זה עשוי לדרוש אופטימיזציה של ההגדרות לסריקה. ההגדרות עבור מיקרוסקופיה confocal זמן לשגות היו כדלקמן: טמפרטורה של חדר סביבתי: 25 מעלות צלזיוס; 20X אובייקטיבי עם 4 פעמי זום; מצב סריקת xyzt, עם רזולוציה של 512x512, z = 1 מיקרומטר צעדים ושעות 1 או 2 - מרווחי שעה.
- Confocal מיקרוסקופ היקה SP2 יש הגבלה בגודל קובץ לסריקה. עם הגדרות אלה, 8-9 נקודות זמן ניתן לסרוק. עםמיקרוסקופי confocal אחרים, זה צריכים להיות אפשרי לרכישת ערימות של תמונות לנקודתי זמן ארוכות יותר, כלומר מעל פרק הזמן של עד 24 שעות.
6. תרבות וimmunostaining של VNCs נדקר וקבוע
- הכן צלחת תרבית רקמת 24 גם מכילה 500 μl של 7.5% FBS M3 נ.ב. לטוב.
- חזור על נתיחה של יותר מ 24 VNCs לצלחת תרבית רקמה 24 כן.
- באמצעות P20 pipetman עם הקצה חתוך, להעביר 12 VNCs לא דקר מברכה לצלחת התרבית, בעזרת 1 VNC לטוב.
- לדקור את שאר VNCs בברכה כפי שתואר בסעיף 3. העבר כל VNC נדקר לטוב כל אחד.
- מניח את הצלחת 24 היטב ב25 ° C החממה למשך תקופה רצויה בהתאם לניסוי. שלמות תא היא ללא שינוי במשך לפחות 24 שעות.
- לאחר התרבות, להעביר את 12 VNCs ב250 μl של 4% PEM פורמלדהיד בצינור מ"ל 1.5 באמצעות P20 pipetman עם הקצה חתוך. ואז, fixatiיש pipetted זהירות, נזהר שלא לפגוע בVNCs. כמות קטנה של מקבע מספיק כדי לכסות את הדגימות צריכה להישאר בכל צינור. לאחר מכן, להוסיף מקבע טרי, ובעדינות להתסיס עבור 50 דקות ב RT.
- יש לשטוף 2 פעמים עם טריטון 0.3% X PBS, ולאחר מכן לשטוף 2 פעמים למשך 10 דקות עם 0.3% Triton X PBS בRT.
- VNCs חסימה על ידי דוגר עם סרום עיזים הרגיל של 10% ב0.3% טריטון X PBS עבור 1 שעות בRT. הדוגמות ניתן לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס למשך חודש אחד לפחות.
- דגירת VNCs עם נוגדנים עיקריים ליותר מ 20 שעות ב 4 ° C.
- יש לשטוף 2 פעמים עם 0.3% Triton X PBS, ולאחר מכן לשטוף 3 פעמים למשך 10 דקות עם 0.3% Triton X PBS בRT.
- דגירת VNCs עם נוגדנים משניים ליותר מ 16 שעות ב 4 ° C.
- יש לשטוף 2 פעמים עם 0.3% Triton X PBS, ולאחר מכן לשטוף 3 פעמים למשך 10 דקות עם טריטון 0.3% X PBS בחדר RT (בחושך אם באמצעות נוגדנים משניים ניאון).
- החלף PBS עם גליצרול 50%: 50% PBS לפחותשעה.
- ואז להחליף עם גליצרול 80%: 20% PBS במשך לפחות שעה.
- הר VNC בחלון עשה על 2 שכבות של צ'לו קלטת (כ 0.06 מ"מ) בשקופית זכוכית מיקרוסקופית. התאם את הכיוון, ומניח coverslip (18x18 מ"מ) מעל החלון. שתי VNCs יכול להיות מותקן על שקופית באמצעות שיטה זו.
באמצעות מגוון של נוגדנים ראשוניים, תגובות תאיות שונות לפציעה יכולה להיות מנותחות (למשל שינויים במספר תא וצורת תא).
7. לנתח נתונים באמצעות ImageJ וטווח של תוספים
אם VNC אין דקירת ניוון קשור, המדגם חייב להיות נספר בניתוח ללא קשר לגודל נגע. כדקירה מתבצעת באופן ידני, גודל הנגע שונה בכל פעם. לכן חשוב לנתח את ההשפעה של דקירה, בכל ההזדמנות אפשרית סטטיסטי.
- מדידת גודל פצע. גודלו של הפצע הוא אינדיקטור של תיקון 15.נגע הדקירה גלוי כחסר ביטוי של GFP. אזור נגע ניתן למדוד נתונים לשגות באמצעות תוכנת ImageJ זמינה באופן חופשי, כמפורט להלן:
- שימוש ImageJ, פתח ערימה של תמונות confocal מתפריט "קובץ", בחר "יבוא" מכאן ובחר באפשרות "תמונה ברצף". זה יהפוך את האוסף של תמונות בודדות למחסנית.
- השינוי הבא "הערימה" לתוך "Hyperstack" על ידי הלחיצה על תפריט "תמונה", בחר "Hyperstack", לאחר מכן בחר "סטאק לHyperstack".
- הגדר את גודל voxel באמצעות "מאפיינים" מתפריט "תמונה". בנתונים שנרכש באמצעות מיקרוסקופ confocal ליקה SP2, גודל voxel ניתן לקבל סריקה של תוכנות, ומקובץ טקסט metadata נשמר יחד עם תמונות. עם ההגדרה שלנו כמתואר בסעיף 3, מידות הפיקסלים הן XY = 0.366211 מיקרומטר ו z = 0.99709 מיקרומטר.
- על ידי בחינה כל את הפרוסות בנקודת זמן אחת, לצייר את קווי המתאר המרבי של שטח הנגע בכלי מצולע לבחירה בסרגל הכלים. זההאזור של עניין (ROI).
- הוסף את ההחזר על ההשקעה למנהל ROI ידי לחיצה על תפריט "נתח", לגלול למטה ובחר "כלים", ואז "מנהל ROI", ואז "להוסיף".
- חזור על פעולה זו עבור כל נקודתי הזמן.
- לחץ על הלחצן "המדוד" במנהל ROI כדי להשיג את גודל השטח של כל החזר על השקעה.
- תיקון של תנועת VNC במהלך הקלטת זמן לשגות. "Stackreg" ותוספים "Turboreg" 16 (מאתר ImageJ http://rsbweb.nih.gov/ij/): תוספים אלו מאפשרים לתקן תנועות מדגם קטנות במהלך זמן לשגות. לבנות מחסנית עם סעיף אופטי נציג מקביל בכל זמן הנקודות ולהחיל את התוספים. זה עוזר לדמיין כיצד שינויי הנגעים לאורך זמן. את הפרטים על שיטות אלה והוראות השימוש זמינים בקבוצת המחקר שפתחה תוספים אלה. (Http://bigwww.epfl.ch / thevenaz / stackreg /).
- ספירה אוטומטית של תאי גליה. תוסף "DeadEasy גליה" (www.biosciences-labs.bham.ac.uk/hidalgo/Software.html): זו פותחה כדי לספור את מספר תאי גליה ריפה חיוביים בדרוזופילה הזחל VNC ולבחון את השינוי בגלייה מספר הנגרם מדקירת פציעה 17. התוסף עובד בצורה מדויקת, עם שגיאה של תוצאות חיוביות שגוי 0.1% וגם שליליים שווא 4.3% 17. כדי להשתמש בתוסף בתווית זו, קודם כל גליה (למעט קו האמצע) בדגימה באמצעות immunofluorescence עם נוגדנים אנטי-Repo. לאחר מכן להתקין את התוסף בImageJ, פתח ערימה של תמונות confocal ולהפעיל תוספת. הוא מביא בחשבון באופן אוטומטי בתאי גליה בערך 30 שניות.
- ספירה אוטומטית של תאים אפופטוטיים. "זחלי DeadEasy caspase" תוספת (www.biosciences-labs.bham.ac.uk/hidalgo/Software.html) 18: זה פותח כדי לספור את מספר התאים שסומנו ב- בקע-Caspase3 אנטי, וגרסה חדשה הותאמה לVNCs הזחל. דקירת פציעה גורמת לעלייה במות תאים מתוכן 11. כדי להשתמש בזה תוספת, תאים אפופטוטיים תווית הראשונות בדגימה באמצעות immunofluorescence עם נוגדנים נגד בקעו-caspase-3. לאחר מכן להתקין את התוסף בImageJ, פתח ערימה של תמונות confocal ולהפעיל תוספת. הוא מביא בחשבון באופן אוטומטי בתאים אפופטוטיים בערך 30 שניות.
8. ריאגנטים
- תרבות בינונית: חומה ובינונית סאנג M3 חרקים, 7.5% בסרום שור עוברי, 1% פניצילין וסטרפטומיצין 1%.
- 0.01% פולי-L-המס בסטרילית DW.
- מקבע: פורמלין 4%, אולטרה טהור בPEM (0.1 צינורות M, 2 מ"מ, 1 המ"מ EGTA 4 MgSO) פתרון.
- פתרון לחסימת immunostaining: 10% סרום עיזים רגיל ב0.3% טריטון X-PBS.
- Synthetase Anti-גלוטמין2: נוגדנים 1:250 בחסימת פתרון.
- נוגדני Anti-GFP: 1:1,000 בחסימת פתרון.
- נוגדני Anti-Repo: 1:250 בחסימת פתרון.
- נוגדני Anti-ELAV: 1:250 בחסימת פתרון.
- 3 נוגדני Anti-בקע caspase: 1:1,000 בחסימת פתרון.
- נוגדנים משניים: 1:250 בחסימת פתרון.
Representative Results
כאן אנו מראים כיצד לבצע את פציעת דקירת תסיסנית זחל VNC ולנתח את התגובות התאיות לפגיעה באמצעות זמן לשגות וimmunostaining מיקרוסקופ פלואורסצנטי confocal.
לנתוני זמן לשגות, הנגע מיוצג כאזור GFP שלילי בתוך neuropile דגימות הנושאות את סמן axonal G9 (איור 2). זמן קצר לאחר דקירת GFP שליליים, קטן אזורים, שנראה כמו חורים או vacuoles, מתחיל להופיע (איור 2 א). תחומים כגון GFP שליליים בדרך כלל להגדיל עד כ 6-8 שעות לאחר הדקירה (איור 2 א). כתוצאה מכך, אזורי GFP השליליים יתכווצו ואולי אפילו ייעלמו (איור 2 ב '). ב 22 שעות לאחר הדקירה, השטח שנכבש על ידי הפצע הוא בדרך כלל קטן יותר מהשטח המרבי היה ב6-8 שעות לאחר הדקירה (איורים 2 א, ב). בדומה לאזור DsRed השלילי בתהליכי גליה תחילה מגביר מדי, אבל shrinks ב 22 שעות לאחר הדקירה. מעניין, לעתים תהליכי גליה DsRed חיוביים למלא את חורי GFP-השליליים בneuropile לפני היעלמותם (האיור 2C).
שימוש בדגימות immunostaining קבועים, תהליכי גליה עדינים ותגובתם לפציעה יכול להיות דמיין עם רזולוציה טובה יותר מאשר בתמונות זמן לשגות. ניתן לעשות זאת, למשל, באמצעות מנהל ההתקן של גליה repoGAL4 לגרום לביטוי של כתב קשור קרום (למשל כטב"מ-mCD8GFP) בזבובים כדי לחזות את כל תאי גליה (למעט גליה קו האמצע). זה יכול גם להיות משולב עם סמני גליה אחרים, כגון אנטי GS2, שמתייג תאי גליה neuropile הקשורים (3A מספרים, ב '). כאן אנו מראים כי למרות שצינור עצבי הגחון הוא נדקר מהצד הגבה, דקירת תוצאות פציעה בשקע ventrally (3A דמות, ראשי חץ). דקירה כנראה משפיעה על תאי גלייה ה neuropile וneuropile הקשורים בצורה חמורה יותרמשטח ותאים בקליפת מוח גליה (איור 3 ב '). תהליכי גליה נראים לא מאורגנים בneuropile, בעוד שהם עדיין לשמור על הרשת שלהם כמו ארגון בקליפת המוח. תוצאות פגיעה בפסולת GS2 חיובית סלולרית, והוא שונה מתאים נורמלים כמו שברי פסולת הן הרבה יותר קטנות ולא מחוברות לגוף תא. זה חושף את הניזק לתאי גלייה neuropile הקשורים (איור 3 ב '). תאי גליה המתנוונת neuropile הקשורים גם נצפו על ידי מיקרוסקופי אלקטרונים 15. אנטי בקע-caspase 3 + מכתים אפופטוזיס נצפה בתאי neuropile הקשורים גליה 15, מראה שהם עוברים אפופטוזיס על דקירת פציעה. תאי גליה Neuropile קשורים הוצגו גם phagocytose פסולת עצבית 15, וGS2 + אות עשויה גם לחשוף את הבליעה של תאי עצב בתהליכים אפופטוטיים גליה. תאים בקעו-caspase + אפופטוטיים גם נצפים בקליפה, לפחות חלק מהם מתאימים לElav + נוירונים ( באמצעות דגימות קבועות וimmunostaining גם מאפשר ניתוחים כמותיים של תגובות תאיות לפגיעה, כגון אפקטים בהתפשטות ואפופטוזיס. לשם כך, אנו בכוונה פתחנו שתי ImageJ תוספות, זחל caspase DeadEasy וגליה DeadEasy, כדי לספור את מספר תאי גליה ותאים אפופטוטיים באופן אוטומטי, בהתאמה. הם אומתו לעבוד על VNCs זחל ומאוד מדויקים. באמצעות אלה, ניתן לצפות לעלייה במספר תאי גליה ריפה חיוביים שנגרמו על ידי פציעת דקירה, ב 22 שעות (תרשים 4 א) 15. יש גם עלייה במספר התאים אפופטוטיים אנטי בקעו-caspase-3 של 6 שעות לאחר הדקירה-(איור 4B) 15. עלייה כזו בהתרבות ואפופטוזיס גליה בתגובה לפציעה במערכת העצבים מרכזיים תסיסנית היא מזכירה גם את תגובת פגיעה במערכת עצבים המרכזיים של בעלי החוליות. היבט חיוני של זה הפרtocol היא האיכות של נתיחות VNC. קשה לומר בזמן הנתיחה אם VNCs ניזוקו או לא בתהליך. חשוב לטפל בפרט לבצע ניתוחים עדינים. עם זאת, דגימות באיכות גרועה בהכרח להיות מיוצרות, וזה הכרחי כי אלה מזוהים בשלבים מאוחר יותר ומושלך. בידות שלנו, ניוון VNC נראה שאינם קשור לפציעה, אבל במקום שנגרם על ידי נתיחה מחוספסת. יש לנו לא נצפו גודל קריטי בפצע פציעה, ואנחנו מנתחים את כל דגימות פצועים שאינם מושפלים. כאשר VNCs לשמור על שלמותם, משטח VNC נוטה להיראות חלק ומבריק, ואין חורים בneuropile הם נצפו (5A איור). שפלה של VNCs יכולה להיות מוכרת על ידי נתיחה שלאחר 24 שעות מהמשטח המחוספס של אזורי הגחון ורוחב VNC (5B איור). שפלה של neuropile שאינם הקשור לפציעת דקירה יכולה להתרחש גם, והכרה בו כneuropile holes באות הרקע של דגימות immunostained. דגימות עם אלו סימנים של התנוונות חייבות להיות מושלכות (איור 5 ג). בידות שלנו, שיעור ההצלחה לנתיחה ופגיעה בשליטה שלמה ודקרה (י.ו.) זבובים הם גם סביב 70%. שיעור זה עשוי להשתנות עם המיומנות של האדם שבצע את הניסויים, ועם גנוטיפ. 
איור 1. ציור סכמטי של זחל בימוי ודקירת פציעה. (א) ביום 0, זבובים מותרים להטיל ביצים בצלחת פטרי מיץ ענבים ל3 שעות. ביום 1, זחלי instar 1 בקעו (L1) נאספים והניחו בבקבוקונים המכילים מזון שמרים סטנדרטי, שבו הם נשמרים למשך 3 ימים נוספים. ביום 4, זחלים נאספים מבקבוקון מזון, ומשמשים לניסויי הדקירה. (B) נוף צדדי של מערכת העצבים מרכזי הזחל.אזור הבטן של חוט עצב הגחון הוא נדקר במחט מהצד הגבה. קדמי הוא בצד השמאל, ואחורי בצד ימין. 
איור 2. התקדמות זמן לשגות של נגע VNC. מיקרוסקופיה confocal על VNCs לחיות עם האקסונים-GFP שכותרת-ותאי גלייה DsRed כותרת-. גנוטיפ:. UASDsRed / +; G9 / +; repoGAL4 / + () הנגע הוא מוכר על ידי העדר פלואורסצנטי על neuropile אקסונלית. לאחר הדקירה, החורים GFP-שליליים מופיעים, לאחר מכן הולכים וגדלו בגודל ובמספר. התחזיות של 5 חלקים אופטיים מכל נקודת זמן לאחר שדקר פציעה. (ב) מתכווצות axonal neuropile הנגעים מ 9 שעות לאחר הדקירה. תמונות אלה הן סעיפים אופטיים בודדים מנקודתי זמן שונות לאחר שדקר פציעה. כדי לזהות תפקידים מקבילים בכל מדגם, ואותו מספר פרוסה מeaנקודת זמן הפרק בערימה של נתוני זמן לשגות נבחרה. על ידי השוואה בין הדפוסים דמיינו בG9 וrepoGAL4> UASmCD8GFP באזור אינו מושפע מהדקירה, את הפרוסות אומתו כמתפקידים מקבילים בציר Z. קווים מקווקווים ב( A, B) מצביעים על היתרון של הפצע. (ג) גדלה גבוהה מפצעיו בneuropile. חורי GFP שליליים היו מלאים בתהליכי גליה DsRed חיוביים, ולאחר מכן נעלמו (ראשי חץ). נוף אופקי. עד קדמי. 
איור 3. אפיון תאי של נגע VNC. VNCs נושאות כתב GFP קרום קשור לכל תאי גליה (למעט גליה קו אמצע) מוכתמים אנטי GFP ואנטי GS2, סמן תא גלייה neuropile-משויך. גנוטיפ:. + / +; UASmCD8GFP / +; repoGAL4 / + () VNCs נדקרו מהדורצד סאל, אבל זה גורם שקע ventrally (ראשי חץ). השקפת sagittal של חלקים אופטיים בודדים, שמאל הגבה וקדמי. (A, B) דקירת פציעה משפיעה על תאי גלייה בצורה חמורה יותר neuropile הקשורים מאשר תאים בקליפת מוח ומשטח גליה. תוצאות פגיעה בפסולת סלולרית GS2 החיובית (ראשי חץ בבוקר). (B) נוף אופקי של חלקים אופטיים בודדים, עד קדמי. ראשי חץ מצביעים על GS2 + פסולת תא. (C) Colocalisation של סמן אפופטוטיים אנטי בקע-caspase-3 וסמן העצבי אנטי Elav מראה כי עם פציעת חלק מהתאים המתים בקליפת המוח הוא תאי עצב. נ.פ., neuropile; CX, קליפה. 
איור 4. ספירה אוטומטית של תאי גליה ותאים אפופטוטיים באמצעות DeadEasy. () דוגמה לשימוש 'גליה DeadEasy זחל' לספור ריפיתי חיוביתתאי גליה. משמאל: חצאים VNC גחון מגואלים בנוגדנים נגד ריפו; ביניים: פלט מגליה הזחל DeadEasy מראה תאים שזוהו על ידי תוספת; נכון: מיזוג. מספרים על הזכות הם מספר התאים ריפו חיוביים שנספרו באופן אוטומטי בכל ערימה של חלקי confocal אופטיים בכ 30 שניות. מספר גדל גליה בVNCs נדקר. (ב ') הדוגמא לשימוש' זחל caspase DeadEasy '. תחזיות של 5 חלקים confocal אופטיים מוכתמים עם 3 נוגדנים כנגד בקע-caspase; ביניים:: Left פלט מראה תאים שזוהו על ידי תוספת; נכונות: מיזוג. מספרים על הזכות הם מספר התאים caspase-חיוביים שנספרו באופן אוטומטי בכל ערימה של חלקי confocal אופטיים בכ 30 שניות. מספר התאים אפופטוטיים מגדיל בVNC נדקר. 
איור 5. דוגמאות לdegeneratיון. () VNC בריא. אין כל סימנים של התנוונות. (ב) הצד של בית החזה מתנוונת (ראשי חץ) בדגימה נדקרה. כוכבית מציינת אתר נגע. (C) חורים בneuropile החזי (ראש החץ לבן) והקליפה (כתום ראש החץ) בVNC לא דקר. דגימות עם vacuolization neuropile והנרחב פגומים שצריכים להיות מושלכות. הנה VNCs הוכתם נגד איבוני סמן גליה neuropile המשויך. נוף אופקי, עד קדמי.
Discussion
הקמנו פרוטוקול לדקירת פגיעה במערכת העצבים המרכזיים תסיסנית הזחל כדי לחקור את התגובות התאיות לניזקים, תיקון והתחדשות. VNCs זחל הם גזורים ונדקר, לאחר שהם צולמו עם מיקרוסקופיה זמן לשגות או קבועים לimmunostaining פלואורסצנטי לדמיין גליה ונוירונים, אפופטוזיס או חלוקת תא. ההתקדמות של הנגע לאורך זמן ניתן למדוד. שיטה זו מלווית בתוכנה שפותחה בכוונה לניתוח הכמותי וסטטיסטי של שינויי מספר תא על פגיעה, ובמהלך התיקון.
אנחנו נדקרנו זחלי 96-AEL שעה (ואלה היו קבועים או אפשרו לפתח עוד יותר), שלב התפתחותי לפני המעבר לגולם ולאחר מכן לטוס למבוגרים. בגיל 96 שעות, VNCs גדול מספיק לדקירה, הם באמצע שלב instar השלישי, ולכן לא מבצע התגלמות עדיין; ומערכת העצבים היא כבר מלא פונקציונלית דומה לזה של המודעהult. זה עשוי להיות אפשרי לדקור מעט מאוחר יותר בזחלים והתזמון המדויק יש לבחור כדי להתאים לשאלת המחקר. עם זאת, בהתאם לשאלות המופנות, זה בדרך כלל יהיה צורך לתרבות את VNCs במשך זמן מה כדי לבחון את התגובות התאיות לפציעה. זמן מה לאחר 120 התחלות התגלמות AEL HR, תקופה שבה מערכת העצבים המרכזיים היא שופצה ולכן הוא נמנע טוב ביותר. לכן חלון הזמן לדקירת התרבות בתוספת בזחל הוא די מוגבל. שימוש זחלים עדיין יש יתרון טכני רב על שימוש במבוגרים: בעוד, בדומה למבוגרים, מערכת העצבים הוא כבר מתפקד במלואה, ניתוח התגובה לפציעתו קלה ומהיר יותר במידה ניכרת בזחלים.
כאשר משווים את הגודל והמורפולוגיה של המוח וVNCs הגזורים ותרבית בצלחת לVNCs שנתחו בנקודה זהה כעבור זמן בלי culturing בצלחת, נראה כי ההתפתחות היא איטית יותר בתרבות מאשר בגוף חי. במובנים אחרים,הפיתוח ממשיך בדרך כלל בתרבות, יושרת רקמה נשמרה ותאי חיים מראים תגובות אפשריות. התרחבות פצע, תיקון neuropile וריבוי גליה להתבצע בתוך 22 שעתי הודעת דקירה-. זה מראה כי תגובות תאיות לניזקים תתקיימנה בתרבות, ויש סיכוי טוב ביותר לא צריך לשמור את explants ליותר מיום אחד. אם תרבות טווח ארוך יותר הייתה רצויה, הפרוטוקול עשוי לדרוש אופטימיזציה כגון באמצעות הוספת צלחת תרבות 5 נוספת.
חשוב לזהות דגימות באיכות טובה מאלה המנוונים. אופטימיזציה של פרוטוקול זה לוקח קצת מיומנות ובהכרח התנוונות תתרחש בדגימות מסוימות. VNC יכול לרכוש מראה 'כרובית' שמשקף את ההתמוטטות של שלמות רקמות (איור 5 ב). ניוון גם מוכר על ידי vacuolization של VNC באופן עצמאי מדקירה, שיכול להיות נוכח בדגימות שאינן שלמות, נדקרו-(איור 5 ג
בפרוטוקול זה, לקח את היתרון של קו מלכודת חלבון של זבובים לדמיין neuropile במקביל להדמיה של תהליכי גליה באמצעות המערכת המסורתית GAL4-כטב"מ. כלים אלו יכולים גם להיות משולבים עם מערכות ביטוי בינאריות אחרות כגון LeXA 19 ו 20 ש-מערכת, אשר אינם תלויים בGAL4. הדבר יאפשר הניתוח של אינטראקציות, למשל, בין אקסונים ותהליכי גליה, בתגובה לפציעה. על ידי שילוב אותו עוד יותר עם כלים גנטיים אחרים כגון כתבים לדנדריטים 21 או זרם סידן 22, שיטה זו מספקת הזדמנות מצוינת לנתח את הביולוגיה של התא מאחורי תגובת פציעתם של תאי גליה, אקסונים ודנדריטים עצביים במערכת העצבים המרכזיים. לבסוף, שיטה זו יכולה להיות משולבת עם גנטיקה רגילה, מוטציות וביטוי יתר של גנים, כדי לבדוק את תפקוד גן בתגובה לפציעה והתחדשות.
פרוטוקול זה הוביל בהצלחה לגילוי של רשת גנים שבבסיס תגובת גליה משובים לפגיעה במערכת עצבים מרכזיים 11. בהתחשב השימור האבולוציוני של תפקוד גן, נפרם האירועים הללו סלולריים ופונקציות גן בפרותי זבובים עשוי לספק תובנה משמעותיות להבנה של maCNS mmalian תגובה לפציעה והתחדשות.
Disclosures
אין ניגוד האינטרסים הכריז.
Acknowledgments
אנו מודים למיי אן לים לקריאה ביקורתית של כתב היד ושאר חברי המעבדה שלנו לדיונים שלהם ברחבי במהלך עבודה זו. עבודה זו מומנה על ידי מלגות לביקור קצרות חברה מלכותית יאמאדה קרן מדע והאיחוד האירופי וgrr מארי קירי הבינלאומי נכנס למלגת KK, וBBSRC הפרויקט גרנט (BB/H002278/1) וקרן Wellcome ציוד גרנט (073228/Z/03/Z) לAH
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Staining block | Brunel Microscope | ||
| Forceps No. 5 | Fine Science Tools | e.g. 11251-20 | |
| Tungsten needle: rod diameter, 0.5 mm; tip size, 1 μm; length, 2 inch | Roboz Surgical Instrument | RS-6065 | |
| Needle holder | Roboz Surgical Instrument | RS-6060 | |
| Arkansans stones: Repair Kit for Dumont Forceps | Fine Science Tools | 29000-00 | |
| 35 mm Petri dish with 27 mm glass base | Iwaki | 3930-035 | |
| Leica SP2-AOBS confocal inverted microscope with environment chamber | Leica | ||
| Reagent | |||
| Shield and Sang M3 insect medium (ecdysone free) | Sigma | S3652-500 ml | |
| Penicillin and streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | See 12 | ||
| FBS | Sigma | F7524 | |
| Poly-L-lysin | Sigma | P1399-25mg | |
| Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure | Polysciences | 04018-1 | |
| Mouse anti-glutamine synthetase antibodies | Millipore | MAB302 | |
| Rabbit anti-GFP antibodies | Life technologies | A11122 | |
| Mouse anti-REPO antibodies | Developmental Studies Hybridoma bank | 8D12 | |
| Rat anti-ELAV antibodies | Developmental Studies Hybridoma bank | 7E8A10 | |
| Rabbit anti-active caspase 3 antibodies | Abcam | ab13847 | |
| Normal goat serum | Vector Laboratories | S-1000 | |
| Anti-rabbit Alexa Fluor 488 | Life technologies | A11034 | |
| Anti-mouse Alexa Fluor 647 | Life technologies | A21236 | |
| Anti-rat Alexa Fluor 647 | Life technologies | A21247 | |
References
- Fang, Y., Soares, L., Teng, X., Geary, M., Bonini, N. M. A novel Drosophila model of nerve injury reveals an essential role of Nmnat in maintaining axonal integrity. Curr. Biol. 22, 590-595 (2012).
- Xiong, X., et al. Protein turnover of the Wallenda/DLK kinase regulates a retrograde response to axonal injury. J. Cell Biol. 191, 211-223 (2010).
- Leyssen, M., et al. Amyloid precursor protein promotes post-developmental neurite arborization in the Drosophila brain. EMBO J. 24, 2944-2955 (2005).
- Kato, K., Awasaki, T., Ito, K. Neuronal programmed cell death induces glial cell division in the adult Drosophila brain. Development. 136, 51-59 (2009).
- Ayaz, D., et al. Axonal injury and regeneration in the adult brain of Drosophila. J. Neurosci. 28, 6010-6021 (2008).
- Rohrbough, J., O'Dowd, D. K., Baines, R. A., Broadie, K. Cellular bases of behavioral plasticity: establishing and modifying synaptic circuits in the Drosophila genetic system. J. Neurobiol. 54, 254-271 (2003).
- Babcock, D. T., Landry, C., Galko, M. J. Cytokine signaling mediates UV-induced nociceptive sensitization in Drosophila larvae. Curr. Biol. 19, 799-806 (2009).
- Gomez-Marin, A., Louis, M. Active sensation during orientation behavior in the Drosophila larva: more sense than luck. Curr. Opin. Neurobiol. 22, 208-215 (2012).
- Schleyer, M., et al. A behavior-based circuit model of how outcome expectations organize learned behavior in larval Drosophila. Learn Mem. 18, 639-653 (2011).
- Brown, H. L., Cherbas, L., Cherbas, P., Truman, J. W. Use of time-lapse imaging and dominant negative receptors to dissect the steroid receptor control of neuronal remodeling in Drosophila. Development. 133, 275-285 (2006).
- Kato, K., Forero, M. G., Fenton, J. C., Hidalgo, A. The glial regenerative response to central nervous system injury is enabled by pros-notch and pros-NFkappaB feedback. PLoS Biol. 9, e1001133 (2011).
- Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. Drosophila protocols. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
- Morin, X., Daneman, R., Zavortink, M., Chia, W. A protein trap strategy to detect GFP-tagged proteins expressed from their endogenous loci in Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 15050-15055 (2001).
- Verkhusha, V. V., et al. An enhanced mutant of red fluorescent protein DsRed for double labeling and developmental timer of neural fiber bundle formation. J. Biol. Chem. 276, 29621-29624 (2001).
- Kato, K., Forero, M. G., Fenton, J. C., Hidalgo, A. The glial regenerative response to central nervous system injury is enabled by Pros-Notch and Pros-NFkB feedback. PLoS Biol. 9, e1001133 (2011).
- Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing: A Publication of the IEEE Signal Processing Society. 7, 27-41 (1998).
- Forero, M. G., Kato, K., Hidalgo, A. Automatic cell counting in vivo in the larval nervous system of Drosophila. J. Microsc. 46, 202-212 (2012).
- Forero, M. G., Pennack, J. A., Learte, A. R., Hidalgo, A. DeadEasy caspase: automatic counting of apoptotic cells in Drosophila. PLoS One. 4, e5441 (2009).
- Lai, S. L., Lee, T. Genetic mosaic with dual binary transcriptional systems in Drosophila. Nat. Neurosci. 9, 703-709 (2006).
- Potter, C. J., Tasic, B., Russler, E. V., Liang, L., Luo, L. The Q system: a repressible binary system for transgene expression, lineage tracing, and mosaic analysis. Cell. 141, 536-548 (2010).
- Nicolai, L. J., et al. Genetically encoded dendritic marker sheds light on neuronal connectivity in Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 20553-20558 (2010).
- Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nat. Methods. 6, 875-881 (2009).
