Summary
Um paradigma lesão utilizando a Drosophila larval cordão nervoso ventral para investigar a regeneração do sistema nervoso central e de reparação é descrito. Stabbing seguido por varredura a laser microscopia confocal em amostras de lapso de tempo e fixa, combinada com a análise quantitativa, com software desenvolvido propositadamente e genética, são utilizados para investigar os mecanismos moleculares do CNS regeneração e reparo.
Abstract
Um método experimental foi desenvolvida para investigar as respostas celulares ao sistema nervoso central (SNC) utilizando a lesão mosca da fruta Drosophila. Reparação compreensão e regeneração em animais é uma questão-chave na biologia. O CNS danificadas humanos não se regenera, e compreender a forma de promover a regeneração é um dos principais objetivos da neurociência médica. O kit de ferramentas poderoso genética de Drosophila pode ser usado para resolver o problema da regeneração do SNC.
A lesão da medula nervosa SNC ventral (VNC, equivalente à medula espinal vertebrado) é aplicado manualmente com uma agulha de tungsténio. O VNC pode, posteriormente, ser filmado em time-lapse usando microscopia confocal de varredura a laser por até 24 horas para acompanhar o desenvolvimento da lesão ao longo do tempo. Alternativamente, podem ser cultivadas, em seguida, fixadas e coradas através de imunofluorescência para visualizar neurónios e células da glia com microscopia confocal. Utilizando marcadores apropriados, changes na morfologia celular e do estado das células, como resultado de lesão pode ser visualizada. Com ImageJ e desenvolvido propositadamente plug-ins, análises quantitativas e estatística pode ser realizada para medir alterações no tamanho da ferida ao longo do tempo e os efeitos da lesão da proliferação celular e da morte celular. Estes métodos permitem a análise de amostras de grande tamanho. Eles podem ser combinados com as poderosas da genética de Drosophila para investigar os mecanismos moleculares subjacentes CNS regeneração e reparação.
Introduction
Regeneração de células animais, revela que o crescimento do organismo sentir quando é ordenada e completa, e como a integridade estrutural de um organismo é alcançado e mantido. Entender essas misteriosas habilidades de células é de grande interesse na biologia. Estimular a regeneração é um dos objectivos-chave para médicos neurociência. Nos seres humanos, o sistema central nervoso danificado (CNS) não se regenera. Modelos de roedores de lesão medular são utilizados para compreender como as células respondem a lesões. No entanto, as preocupações éticas, altos custos e do ciclo de vida dos animais lento restringir o progresso.
A mosca da fruta Drosophila é um organismo modelo amplamente utilizado em biologia do desenvolvimento e da neurociência. Graças às suas poderosas ferramentas genéticas e ciclo de vida curto, Drosophila tem recorrentemente levou à descoberta de funções de genes e as redes de genes com interesse para a compreensão dos seres humanos e contra a doença. Há evidência abundante de con evolutivaconservação da função do gene das moscas a humanos.
Nos últimos anos, vários paradigmas de lesão do sistema nervoso foram estabelecidas em Drosophila. Alguns consistem de danificar os nervos periféricos que correm ao longo da asa ou axotomia de nervos periféricos, incluindo um sensorial e axônios motor 2. No entanto, os sistemas nervosos periférico e central diferem em muitos aspectos, e sabe-se bem que em muitos animais do sistema nervoso periférico podem regenerar enquanto que o SNC não pode. Assim, compreender CNS regeneração, lesão directa ao sistema nervoso central é mais adequado. Lesão Stabbing com uma agulha tem sido aplicado com sucesso para o cérebro adulto Drosophila para investigar a resposta a lesão 3,4. Usando outra abordagem, Ayaz et al. Axônios cortados do SNC em cérebros adultos cultivados com uma potência Piezo microdissector, e analisou a sua regeneração por 4 dias 5. A vantagem destes u conjunto mais tarde experimentalps é que se concentram sobre o cérebro, que é, sem dúvida, de grande interesse. A desvantagem é que o cérebro é muito mais complexo do que o VNC, que lida apenas com motor e controle de sensorial. Trabalho sobre o cérebro adulto também é mais demorado. A larva está pronto para experiências em 4 dias, enquanto que leva cerca de 10 dias para a emergência de adultos, e, em seguida, mais 5 dias para a sua maturação. O cérebro adulto é também mais difícil de manusear, uma vez que é encapsulado no cutícula espessa, que é difícil de remover. O VNC tem a vantagem adicional de ser funcionalmente equivalente ao cabo de vertebrado vertebral.
A larva Drosophila é amplamente usado como um organismo modelo para neuroscience 6-9. Embora estritamente falando, a larva está numa fase de desenvolvimento, ele também pode ser considerado um animal totalmente funcional. A larva tem de locomoção, sentidos múltiplos, incluindo gosto olfato, e nocicepção, aprendizagem e memória. Assim, a larva VNC wescolhido como o modelo ideal para lesões do SNC.
VNCs de larva e pupa pode ser dissecada e cultivadas no prato, ainda mantendo a integridade celular por até 24 horas 10. Isto sugeriu que a lesão poderia ser aplicado ao VNC, que poderiam então ser gravado no lapso de tempo para ao longo deste período de tempo, ou em cultura e fixado em qualquer ponto de tempo desejado durante este período.
Aqui, apresentamos um paradigma experimental para CNS lesão usando a Drosophila larval VNC. O VNC é primeiro dissecados da larva e lesão penetrante é aplicado manualmente com uma agulha de tungsténio. O VNC é então colocada em uma lamela com fundo de vidro, e filmado com lapso de tempo de varredura a laser microscopia confocal. Alternativamente, os VNCs podem ser cultivadas por um período de tempo desejado, e os efeitos celulares do ferimento pode ser analisado em amostras fixadas, utilizando microscopia confocal e imunocoloração. A área da ferida pode ser medida, e análise quantitativa de células number (proliferação celular e da morte celular) pode ser realizada com o software desenvolvido propositadamente. Grandes tamanhos de amostra podem ser facilmente manipulados, resultando em resultados estatisticamente validados. Estes métodos têm sido combinados com sucesso com a genética poderosos de Drosophila para descobrir uma rede de genes subjacentes a resposta regenerativa da glia para lesão do SNC 11.
Protocol
1. Encenado coleção de larvas
- Lugar 15 do sexo feminino e 15 moscas machos adultos em uma gaiola cilíndrica Perspex para pôr ovos em uma placa de Petri com agar de sumo de uva e suplementados com uma pequena concha de levedura colar durante 3 horas a 25 ° C. Mudar a placa 3-4 vezes por dia, e descartar o primeiro prato (isto é, a partir de O / N ovo-lay). Descartar também as placas a partir do primeiro dia. A partir do segundo dia, manter as placas com os ovos a 25 ° C. Após 7 dias de coleta de ovos, comece com uma nova configuração de moscas pai.
- Após cerca de 24 horas, as larvas eclodem dos ovos. Ligando larvas com um pincel ou diluído com um par de pinças, transferir 35 larvas do agar de uva para um frasco contendo alimentos mosca padrão (10 ml) (Figura 1A).
- Manter os frascos contendo larvas por 3 dias (96 horas após a postura do ovo, AEL) a 25 ° C.
2. Dissecação de larval cordões nervosos ventrais para a Cultura
- Limpe sernch e as mãos com álcool 70%. Mergulhe 4 blocos de coloração, 2 pares de fórceps e uma agulha com etanol 70%, e deixar secar naturalmente.
- Prepare quatro blocos de coloração com as seguintes mídias: uma com água destilada (DW) para limpar e para as larvas piscina limpa, um segundo com 2 ml de Proteção e médio Sang M3 inseto com penicilina e estreptomicina 1%, ecdisona livre (M3 PS média) para dissecar as larvas, um terceiro com 2 ml de meio M3 PS para piscina dissecados cordas nervosas ventrais (VNCs), e um quarto com 2 ml de meio M3 PS stab VNCs. Todos os reagentes devem ser pré-aquecida até à TA.
- Adicionar água ao frasco contendo 96 hr larvas AEL. Em seguida, usando uma espátula, delicadamente espalhar comida com larvas do frasco para uma toalha de papel húmido. Transferem-se 10 larvas de um bloco de coloração contendo DW para lavar a comida. Substituir DW 6 vezes. Em seguida, substitua com M3 médio PS.
- Transfira uma das larvas para um bloco de coloração contendo 2 ml de meio M3 PS.
- Sob um microscópio de dissecação, dissect um cérebro larval cuidadosamente usando métodos padrão 12, mas para minimizar danos nos tecidos, ter um cuidado especial, procedendo da seguinte maneira. Coloque o lado dorsal larva, e segure o dorso de um terço da extremidade anterior com duas pinças (uma em cada mão). Enquanto segurando a seção anterior, afastar a extremidade posterior com a pinça, e rasgar a epiderme. O cérebro e o VNC deve ser visível a partir da borda posterior da metade anterior. Cuidadosamente isolar o cérebro e complexo VNC, removendo a gordura do corpo, intestino e epiderme. Quando os VNCs são danificados demasiado, as VNCs irá degenerar total ou parcialmente, mesmo sem lesão penetrante. Leve em conta os seguintes pontos:
- Não puxe ou rasgar os discos imaginais e os nervos periféricos do VNC torácica como isso irá danificar o VNC. Para cortar os nervos periféricos, manter os nervos periféricos com dois pares de fórceps colocados perto uns dos outros, e em seguida, puxe os nervos com o deceps. Discos imaginais e partes da boca pode ser deixado ligado ao VNC.
- Deixar a glândula anel e gânglio linfático ligado ao cérebro.
- Cortar o intestino, no ponto mais próximo para o cérebro, onde os alimentos não muito está contido.
- Ao utilizar um Pipetman P20 com a ponta cortada e se arregalaram um pouco, transfira o VNC a um bloco coloração contendo fresco M3 médio PS. Antes de transferir o VNC, pipeta primeiro para cima e para baixo, somente o meio utilizado para a dissecação, a fim de impedir que o VNC se colem à ponta.
3. Stabbing Lesão ao larval Drosophila VNC
Esta seção descreve como executar lesão apunhalar os VNCs, e preparar-VNCs esfaqueado por lapso de tempo de análise e imunocoloração. Condições pós-esfaqueamento cultura e duração são descritos na seção 5 (por lapso de tempo de análise) e na seção 6 (para imunomarcação).
- Depois de reunir VNCs suficientes (4-5 para o lapso de tempoe mais 24 para imunomarcação), a transferência de um VNC a um bloco de coloração limpo contendo M3 PS.
- Orientar o VNC, de modo que o neurópilo dorsal está em vista sob o microscópio de dissecação (Figura 1B). Esta é a orientação mais natural para VNCs para deitar em quando ligado aos lobos óptica.
- Stab manualmente, utilizando uma agulha de tungsténio sob o microscópio de dissecação, a partir do lado dorsal praticamente em ângulo recto e com vista para a metade do VNC abdominal (Figura 1B).
Tome especial atenção ao seguinte:
- Stab apenas uma vez.
- Stab até que a agulha atinge a parte inferior do vidro. No entanto, tenha cuidado para não danificar a ponta da agulha.
- A haste do suporte da agulha não deve tocar o meio durante esfaqueamento.
- A ferida não é visível ao microscópio de dissecção.
Nota: degeneração Stab lesão não-relacionado
O procedimentopode resultar em degeneração celular distinto dentro do VNC a partir da lesão penetrante. Resultados degeneração em furos no neurópilo e, ocasionalmente, os furos têm sido observados no córtex de espécimes não-stabbed. As amostras com degeneração afeta a degeneração neurópilo ou generalizado que afecta também a superfície VNC deve ser descartado. Degeneração podem ser identificados como se segue:
- Superfície áspera, especialmente na área lateral / ventral do tórax, em 22 horas de esfaqueamento. Em casos extremos, o VNC parece se projetava.
- Buracos ou vacúolos no neurópilo torácico, que pode ser visível como orifícios de sinal de fundo com a imunocoloração de fluorescência.
4. Manutenção de Agulha e Fórceps
- Rotineiramente verificar se a ponta da agulha é afiado o suficiente. A ponta da agulha pode ser dobrada ou romba depois usá-la para várias experiências. Neste caso, o aguçar a ponta usando uma pedra do Arkansas ou equivalente.
- As pontas das pinças deveatender perfeitamente. As pontas podem ficar danificados com o uso. Neste caso, ajustar a ponta usando uma pedra do Arkansas ou equivalente.
5. Cultura e lapso de tempo de gravação de VNCs Stabbed
Para visualizar a neurópilo axonal no VNC vivo, uma linha de armadilha proteína GFP que rotula todos os axônios G9 - 13 - podem ser utilizadas, e para visualização de todas as células da glia (excepto a glia linha média) do condutor repoGAL4 glial pode ser usado para expressar o UASdsRed S197Y 14 repórter. Pelo cruzamento G9 voa para UASdsRedS197Y;; repoGAL4 moscas, larvas VNCs de progênie são obtidos com axônios verde e vermelho da glia que podem ser gravados em um tecido vivo.
- Após VNCs agrupamento 4-5, transferência de um VNC a um bloco de coloração limpo contendo 2 ml de M3 PS, e esfaquear o meia abdominal do VNC, como indicado na seção 3.
- Transfira o VNC esfaqueado a um poli-L-lisina 3,5 milímetros revestido prato fundo de vidro Petri contendo 1 ml de M3PS. Coloque o lado dorsal VNCs baixo. Com cuidado, empurre o VNC usando o lado liso de um par de fórceps para permitir que o VNC para manter o prato.
- Suavemente adicionando 1 ml de M3 PS FBS 15% tornar a concentração final de FBS a 7,5%.
- Aquisição de imagens usando o laser microscopia confocal. Digitalizar o VNC, coletando uma série Z-seção toda a sua espessura inteiro. Utilizou-se um microscópio invertido Leica SP2 confocal com uma temperatura da câmara de cultivo. Qualquer microscópio confocal equivalente deve funcionar, no entanto, ele pode exigir a optimização das condições para a exploração. Os ajustes para a microscopia confocal de lapso de tempo foram os seguintes: A temperatura da câmara de ambiente: 25 ° C; 20X objectiva com zoom 4 vezes; modo de digitalização xyzt, com resolução de 512x512 pixels, z = 1 uM e os passos de 1 hora ou 2 - intervalos de uma hora.
- A Leica microscópio confocal SP2 tem uma limitação no tamanho do arquivo para digitalização. Com essas configurações, 8-9 timepoints pode ser digitalizada. Comoutros microscopia confocal, que deveria ser possível adquirir pilhas de imagens para os pontos mais longos, ou seja, sobre a extensão de até 24 horas.
6. Cultura e imunocoloração de VNCs esfaqueado e Corrigido
- Prepara-se uma placa de 24 poços de cultura de tecido, contendo 500 ul de M3 PS 7,5% de FBS, por poço.
- Repita dissecção de mais de 24 VNCs para uma placa de cultura de tecidos de 24 cavidades.
- Ao utilizar o P20 Pipetman com a ponta de corte, transferir 12 VNCs não stabbed da piscina para o prato de cultura, utilizando-se um VNC por poço.
- Stab resto do VNCs na piscina, como descrito na seção 3. Transfira cada VNC esfaqueado a um bem cada.
- Coloque o prato de 24 cavidades na incubadora a 25 ° C durante um período desejado, dependendo da experiência. A integridade celular é inalterado durante pelo menos 24 horas.
- Após o cultivo, transferir os 12 VNCs em 250 ul de PEM de formaldeído a 4% em um tubo de 1,5 ml, utilizando o P20 Pipetman com a ponta de corte. Em seguida, o fixative é cuidadosamente pipetado para fora, tomando cuidado para não danificar os VNCs. Uma pequena quantidade de fixador suficiente para cobrir as amostras devem permanecer em cada tubo. Seguidamente, adicionar fixador fresco, e agitar suavemente durante 50 minutos à temperatura ambiente.
- Enxaguar duas vezes com 0,3% de Triton X PBS, e em seguida, lavar duas vezes durante 10 min com 0,3% de Triton X PBS à temperatura ambiente.
- VNCs bloco por incubação com soro de cabra normal a 10% em 0,3% de Triton X PBS durante 1 h à RT. As amostras podem ser armazenadas a 4 ° C durante pelo menos um mês.
- Incubar VNCs com anticorpos primários durante mais de 20 horas a 4 ° C.
- Enxaguar duas vezes com 0,3% de Triton X PBS, em seguida, lava-se 3 vezes durante 10 min com 0,3% de Triton X PBS à temperatura ambiente.
- Incubar VNCs com anticorpos secundários durante mais de 16 horas a 4 ° C.
- Enxaguar duas vezes com 0,3% de Triton X PBS, em seguida, lava-se 3 vezes durante 10 min com 0,3% de Triton X em PBS quarto RT (no escuro, se utilizando anticorpos fluorescentes secundárias).
- Substituir PBS com glicerol a 50%: 50% PBS durante, pelo menos, umahora.
- Em seguida, substitua com glicerol a 80%: 20% PBS durante pelo menos uma hora.
- Montar um VNC em uma janela feita em duas camadas de fita-violoncelo (aproximadamente 0,06 mm) sobre uma lâmina de vidro de microscópio. Ajuste a orientação, e colocar uma lamela (18x18 mm) sobre a janela. Dois VNCs pode ser montado sobre uma lâmina utilizando este método.
Utilizando uma variedade de anticorpos primários, diferentes respostas celulares à lesão pode ser analisada (por exemplo, alterações no número de células e a forma da célula).
7. Analisar dados usando ImageJ e uma gama de Plugins
Se o VNC não tem stabbing degeneração relacionada, a amostra deve ser contado em para a análise, independentemente do tamanho da lesão. Como facada é feito manualmente, o tamanho da lesão é diferente a cada vez. Assim, é importante analisar estatisticamente o efeito de esfaqueamento, sempre que possível.
- Wound medição do tamanho. O tamanho da ferida é um indicador de reparação 15.A lesão esfaqueamento é visível como desprovido de expressão GFP. Área de lesão pode ser medido utilizando dados lapso livremente disponível software ImageJ, como se segue:
- Usando ImageJ, abra uma pilha de imagens confocal de menu "Arquivo", selecione "Importar" e aqui selecionar "seqüência de imagens". Isto irá transformar a coleção de imagens individuais em uma pilha.
- Depois altere a "pilha" em um "Hyperstack", indo para "Imagem", selecione "Hyperstack", selecione "Pilha de Hyperstack".
- Defina o tamanho do voxel usando "Propriedades" do menu "Imagem". Nos dados adquiridos utilizando o microscópio Leica SP2 confocal, o tamanho do voxel pode ser obtido a partir da verificação de software, e a partir do ficheiro de texto de metadados guardada juntamente com as imagens. Com a nossa configuração como descrito na Seção 3, dimensões de pixels são XY = 0,366211 ^ m e z = 0,99709 jam.
- Ao examinar todas as fatias em um ponto de tempo, desenhe o contorno máximo da área de lesão com a ferramenta de polígono de seleção na barra de ferramentas. Este é oRegião de interesse (ROI).
- Adicione o ROI para o gerente de ROI, indo para "Analisar" menu, rolar para baixo e selecione "Ferramentas", depois em "gerenciador de ROI", depois em "adicionar".
- Repita este procedimento para os todos os pontos de tempo.
- Clique no botão "Medida" botão no gerenciador de ROI para obter o tamanho da área de cada ROI.
- Correção do movimento VNC durante lapso de tempo gravações. "Stackreg" e "Turboreg" plugins 16 (a partir do site ImageJ http://rsbweb.nih.gov/ij/ ): estes plugins permitem corrigir movimentos pequena amostra durante lapso de tempo. Construir uma pilha com uma seção representativa equivalente óptico através de todos os pontos de tempo e aplicar os plugins. Ela ajuda a visualizar como as mudanças de lesão ao longo do tempo. Os detalhes sobre esses métodos e ao manual de instruções estão disponíveis a partir do grupo de pesquisa que desenvolveu esses plugins. ( http://bigwww.epfl.ch / Thévenaz / stackreg /).
- A contagem automática de células gliais. "DeadEasy glia" plug-in ( www.biosciences-labs.bham.ac.uk/hidalgo/Software.html ): esta foi desenvolvida para contar o número de células positivas para REPO gliais no larval Drosophila VNC e examinar a mudança no glial número causadas por esfaqueamento lesão 17. O plug-in funciona com precisão, com um erro de 0,1% de falsos positivos e falsos negativos 4,3% 17. Para usar este plug-in rótulo, primeiro tudo o glia (exceto a linha média) na amostra usando imunofluorescência com anticorpos anti-REPO. Em seguida, instalar o plug-in no ImageJ, abra uma pilha de imagens confocal e executar plug-in. Conta células gliais automaticamente em cerca de 30 segundos.
- A contagem automática de células apoptóticas. "Larvas Caspase DeadEasy" plug-in ( www.biosciences-labs.bham.ac.uk/hidalgo/Software.html) 18: Este foi desenvolvido para contar o número de células marcadas com anticorpo anti--clivada Caspase3, e uma nova versão foi adaptada para os VNCs larvais. Stabbing lesão provoca um aumento da morte celular programada 11. Para usar este plug-in, as células apoptóticas primeira etiqueta na amostra usando imunofluorescência com anti-clivada-caspase-3 anticorpos. Em seguida, instalar o plug-in no ImageJ, abra uma pilha de imagens confocal e executar plug-in. Conta células apoptóticas automaticamente em cerca de 30 segundos.
8. Reagentes
- Meio de cultura: Shield e Sang meio de insecto M3, 7,5% de soro fetal bovino, 1% de penicilina e estreptomicina 1%.
- 0,01% de poli-L-lisina em DW estéril.
- Fixador: formaldeído a 4%, em PEM Ultra puro (0,1 M PIPES, EGTA 2 mM, 1 mM de MgSO4) a solução.
- Solução de bloqueio para a imunocoloração: soro de cabra normal a 10% em 0,3% de Triton X PBS.
- Anti-Glutamina Sintetase2 anticorpos: 1:250 em solução de bloqueio.
- Anti-GFP anticorpos: 1:1000 em solução de bloqueio.
- Anticorpos anti-REPO: 1:250 em solução de bloqueio.
- Anti-anticorpos ELAV: 1:250 em solução de bloqueio.
- Anti-caspase 3 clivada anticorpos: 1:1000 em solução de bloqueio.
- Anticorpos secundários: 1:250 em solução de bloqueio.
Representative Results
Aqui nós mostramos como executar lesão esfaquear a larva Drosophila VNC e analisar as respostas celulares a danos usando lapso de tempo e imunocoloração microscopia de fluorescência confocal.
Por lapso de tempo dados, a lesão é visualizado como uma zona de GFP-negativa dentro do neurópilo de exemplares portando o marcador axonal G9 (Figura 2). Pouco após esfaquear GFP-negativas, pequenas áreas, que se parecem com buracos ou vacúolos, começam a aparecer (Figura 2A). Tal GFP-negativas áreas geralmente aumenta-se a cerca de 6 a 8 horas após esfaquear (Figura 2A). Subsequentemente, as áreas de GFP-negativas encolher e pode mesmo desaparecer (Figura 2B). Até 22 horas após a facada, a área ocupada pela ferida é geralmente menor do que a área máxima foi de 6 a 8 horas após esfaquear (Figuras 2A, B). Da mesma forma a área DsRed-negativa nos processos gliais inicialmente aumenta também, mas Shrinks por 22 horas após o esfaqueamento. Curiosamente, muitas vezes DsRed-positivos processos gliais preencher os buracos GFP-negativos no neurópilo antes do seu desaparecimento (Figura 2C).
Usando imunomarcação em amostras fixadas, multa processos gliais e sua resposta à lesão pode ser visualizado com resolução melhor do que com o lapso de tempo imagens. Isto pode ser feito, por exemplo, utilizando o controlador repoGAL4 glial para induzir a expressão de um repórter tethered membrana (por exemplo, UAS-mCD8GFP) em moscas de visualizar todas as células da glia (excepto a glia linha média). Isto pode também ser combinado com outros marcadores gliais, tais como anti-GS2, que rotula neurópilo associadas células gliais (Figuras 3A, B). Aqui nós mostramos que, embora o cordão nervoso ventral é esfaqueado do lado dorsal, apunhalando lesão resulta em um dente ventral (Figura 3A, pontas de seta). Esfaqueamento parece afetar mais severamente o neurópilo e neurópilo associada ª células glialuma superfície e células do córtex da glia (Figura 3B). Processos gliais aparecem desorganizado no neurópilo, enquanto eles ainda mantêm sua malha como organização no córtex. Provoca lesões no GS2 positivo restos celulares, que é distinta das células normais como fragmentos de detritos são muito menores e não ligado a um corpo celular. Isto revela danos neurópilo associadas células gliais (Figura 3B). Degeneração neurópilo associados células gliais também foram observados por microscopia eletrônica de 15. Anti-clivada Caspase 3 + coloração apoptose é observada em neurópilo associados células gliais 15, mostrando que eles sofrem apoptose após esfaquear lesão. Células gliais associadas neurópilo também foram mostrados para fagocitar restos neuronal 15, e GS2 + sinal pode também revelar a imersão dos neurônios apoptóticos por processos gliais. Clivados Caspase-apoptóticas + células também são observados no córtex, pelo menos, algumas das quais correspondem a Elav + neurónios ( Utilizando amostras fixadas e imunocoloração também permite análises quantitativas de respostas celulares à lesão, tais como efeitos na proliferação e apoptose. Para isso, desenvolveu propositadamente dois ImageJ plug-ins, Larva Caspase DeadEasy e Glia DeadEasy, a contar automaticamente o número de células gliais e células apoptóticas, respectivamente. Eles foram validados para trabalhar em VNCs larval e são muito precisos. Utilizando estes, é possível observar um aumento do número de células positivas para REPO gliais causadas por lesão penetrante, até 22 horas (Figura 4A) 15. Há também um aumento do número de anti-clivada da caspase-3 de células apoptóticas por 6 h pós-stabbing (Figura 4B) 15. Tal aumento da proliferação glial e apoptose em resposta a uma lesão no SNC de Drosophila é reminiscente da resposta a uma lesão no SNC de vertebrados. Um aspecto crucial deste protocol é a qualidade do VNC dissecações. É difícil dizer, no momento da dissecção se os VNCs ter sido danificado ou não no processo. É importante ter um cuidado especial para realizar dissecções suaves. No entanto, as amostras de má qualidade, inevitavelmente, ser produzido, e é essencial que estes sejam identificadas em fases posteriores e descartados. Em nossas mãos, degeneração VNC parece estar relacionado com a lesão, mas sim causado por dissecção áspera. Não foram observados um tamanho crítico, em que a ferida ferimento, e analisar todas as amostras de feridas que não são degradados. Quando VNCs manter a sua integridade, a superfície tende a parecer VNC lisa e brilhante, e não há furos no neurópilo são observados (Figura 5A). Degradação de VNCs pode ser reconhecido por 24 hr pós-dissecação da superfície áspera das áreas VNC ventral e lateral (Figura 5B). Degradação do neurópilo relacionada com lesão penetrante pode também ocorrer, e é reconhecido como neurópilo holes do sinal de fundo das amostras de imunomarcação. As amostras com estes sinais de degeneração deve ser eliminado (Figura 5C). Em nossas mãos, a taxa de sucesso para a dissecção e lesão no controle intacto e esfaqueou (yw) moscas são ambos em torno de 70%. Esta taxa pode variar com a perícia da pessoa que executa as experiências, e com o genótipo. 
Figura 1. Desenho esquemático da larva estadiamento e esfaquear lesão. (A) No dia 0, as moscas estão autorizados a colocar ovos em um prato suco de uva Petri por 3 hr. No dia 1, o eclodidos larvas de primeiro estádio (L1) são recolhidos e colocados em frascos contendo alimento levedura padrão, onde são mantidos por mais 3 dias. No dia 4, as larvas são recolhidas do frasco de alimentos, e usado para as experiências agudas. (B) vista lateral do sistema central nervoso larval.A região abdominal do cordão nervoso ventral é perfurado com uma agulha a partir do lado dorsal. Anterior é para a esquerda, e posterior para a direita. 
Figura 2. Time-lapse progressão da lesão VNC. Microscopia confocal em VNCs ao vivo com axônios GFP-rotulados e DsRed-rotulados células gliais. Genótipo:. UASDsRed / +; G9 / +; repoGAL4 / + (A) A lesão é reconhecida pela ausência de fluorescência do neurópilo axonal. Depois de esfaquear, GFP-negativas buracos aparecem, a partir daí a aumentar em tamanho e número. Projeções de cinco secções ópticas de cada ponto de tempo após esfaquear lesão. (B) O axonais neurópilo encolhe lesão de nove horas após esfaquear. Estas imagens são únicas secções ópticas de diferentes momentos após esfaquear lesão. Para identificar as posições equivalentes em cada amostra, o número de fatia mesmo eAch ponto de tempo em que a pilha de lapso de tempo de dados foi escolhido. Ao comparar os padrões visualizados com UASmCD8GFP> G9 e repoGAL4 na área não afectada pela facada, as fatias foram verificados como sendo de posições equivalentes ao longo do eixo Z. As linhas a tracejado em (A, B) indica o bordo da ferida. (C) alta ampliação de feridas no neurópilo. GFP-negativas buracos foram enchidos com DsRed-positivos processos gliais, e posteriormente desapareceu (pontas de seta). Visão horizontal. Se anterior. 
Figura 3. Caracterização da lesão celular VNC. VNCs tendo uma membrana repórter GFP tethered para todas as células da glia (exceto glia linha média) corados com anti-GFP e anti-GS2, um neurópilo associada marcador de células glial. Genótipo:. + / +; UASmCD8GFP / +; repoGAL4 / + (A) VNCs foram esfaqueados da dorsal lado, mas isto causa um dente ventralmente (pontas de seta). Vista sagital de secções ópticas individuais, para a esquerda e para cima dorsal anterior. (A, B) Stabbing lesão afeta mais severamente neurópilo-associado do que as células gliais do córtex e da superfície das células gliais. Provoca lesões no GS2 positivo restos celulares (setas em B). Vista (B) Horizontal de um único secções ópticas, se anterior. Pontas de seta apontam para GS2 + restos celulares. (C) Colocalisation do marcador anti-apoptótica clivada da caspase-3 e o marcador neuronal anti-Elav mostrando que após a lesão de algumas das células moribundas do córtex são neurónios. np, neurópilo; cx, córtex. 
Figura 4. Contagem automática de células gliais e células apoptóticas usando DeadEasy. (A) Exemplo de uso "glia DeadEasy larval 'para contar REPO positivocélulas gliais. Esquerda: metades VNC ventral corados com anticorpos anti-REPO; médias: saída da glia larval DeadEasy mostrando células identificadas pelo plug-in, para a direita: fundir. Os números à direita são o número de células positivas para REPO contados automaticamente por uma pilha inteira de secções ópticas confocais em cerca de 30 segundos. Aumenta o número de células gliais nos VNCs esfaqueado. (B) Exemplo de uso de 'larva Caspase DeadEasy'. Projeções de cinco seções ópticas confocal corados com anti-clivada caspase 3 anticorpos; médias:: Esquerda saída mostrando células identificadas pelo plug-in, para a direita: fundir. Os números à direita são o número de células positivas para CASPASE contados automaticamente por uma pilha inteira de secções ópticas confocais em cerca de 30 segundos. O número de células apoptóticas aumenta no VNC esfaqueado. 
Figura 5. Exemplos de degeneration. (A) Um VNC saudável. Não existem sinais de degeneração. (B) O lado do tórax é degenerado (cabeças de seta) numa amostra esfaqueado. Asterisco indica local da lesão. (C) Buracos no neurópilo torácica (seta branca) e no córtex (laranja ponta de seta) em um VNC não esfaqueado. As amostras com vacuolização neurópilo e extensa danificado deve ser descartado. Aqui VNCs foram coradas com o marcador associado neurópilo glial anti-Ebony. Visão horizontal, se anterior.
Discussion
Nós estabelecemos um protocolo para esfaquear lesão ao SNC Drosophila larval para investigar as respostas celulares para a reparação de lesão e regeneração. VNCs larvas são dissecados e esfaqueado, após o que eles são filmados com lapso de tempo fixado para microscopia ou imuno fluorescência para visualizar glia e neurônios, apoptose ou a divisão celular. A progressão da lesão ao longo do tempo podem ser medidos. Este método é acompanhado por um software desenvolvido propositadamente para a análise quantitativa e estatística das alterações do número de células e sobre ferimentos durante a reparação.
Nós esfaqueou 96 horas larvas AEL (e estes foram fixados ou autorizados a desenvolver ainda mais), um estágio de desenvolvimento antes da transição para a pupa e depois mosquito adulto. Às 96 h, VNCs são suficientemente grandes para esfaqueamento, eles estão no meio da fase de terceiro instar e, portanto, não estão submetidos a pupação ainda, e o sistema nervoso é já totalmente funcional semelhante ao do anúncioUlt. Pode ser possível para apunhalar um pouco mais tarde em larvas eo sincronismo preciso deve ser escolhido de acordo com a questão de pesquisa. No entanto, dependendo das questões dirigidas, que será geralmente necessário para a cultura das VNCs durante algum tempo para observar as respostas celulares à lesão. Algum tempo depois de 120 horas começa pupação AEL, um período em que o SNC é remodelado e é, portanto, melhor evitar. Assim, a janela de tempo para cultura mais penetrante na larva é bastante restrita. Usando larvas ainda tem uma grande vantagem sobre o uso de técnicas adultos: enquanto que, à semelhança do adulto, o sistema nervoso é já completamente funcional, a análise da resposta à lesão é consideravelmente mais fácil e rápido de larvas.
Quando se compara o tamanho e morfologia de cérebros e VNCs dissecados e cultivados em um prato de VNCs que são dissecadas em um ponto de tempo equivalente mais tarde sem cultura em um prato, parece que o desenvolvimento é mais lento do que em cultura in vivo. Em outros aspectos,desenvolvimento continua normalmente na cultura, a integridade do tecido é preservado e as células são vivas mostrando múltiplas respostas. Expansão ferida, reparo neurópilo e proliferação glial ocorrer dentro de 22 horas pós-esfaqueamento. Isto mostra que a resposta celular a lesão ter lugar em cultura e não há provavelmente não há necessidade de manter os explantes por mais de um dia. Se a cultura de longo prazo foram desejado, o protocolo pode exigir maior otimização, tais como a utilização de uma inserção de placa de cultura 5.
É importante para identificar amostras de boa qualidade daqueles em degeneração. Otimizando este protocolo tem alguma habilidade e inevitavelmente degeneração ocorrerá em alguns espécimes. O VNC pode adquirir uma "couve-flor" aparência que reflete uma avaria da integridade do tecido (Figura 5B). Degeneração é também reconhecido pela vacuolização do VNC independentemente da facada, que podem estar presentes em intactas, não-stabbed espécimes (Figura 5C
Neste protocolo, que se aproveitou de uma linha de armadilha proteína de moscas para visualizar a neurópilo em paralelo com a visualização de processos gliais que usam o sistema GAL4-UAS tradicional. Essas ferramentas podem ser também combinados com outros sistemas binários de expressão, tais como o LexA 19 e Q-sistema 20, que são independentes da GAL4. Isto iria permitir a análise de interacções por exemplo entre axónios e os processos gliais, em resposta a uma lesão. Por mais combinando-a com outras ferramentas genéticas, como repórteres para dendritos 21 ou 22 influxo de cálcio, este método oferece uma grande oportunidade para analisar a biologia celular atrás da resposta à lesão de células gliais, os axônios e dendritos neuronais no SNC. Finalmente, este método pode ser combinado com a genética padrão, mutações e sobre-expressão de genes, para testar a função de um gene em resposta a lesão e da regeneração.
Este protocolo, com sucesso, levou à descoberta de uma rede de genes subjacentes a resposta regenerativa glial a lesão do SNC 11. Dada a conservação evolutiva da função do gene, desvendar esses eventos celulares e as funções dos genes em frutos-moscas é provável que fornecer informações significativas para a compreensão da maCNS mmalian resposta à lesão e regeneração.
Disclosures
Não há conflito de interesse declarado.
Acknowledgments
Agradecemos Mei Ann Lim para a leitura crítica do manuscrito e outros membros do nosso laboratório para suas discussões ao longo do curso deste trabalho. Este trabalho foi financiado por Yamada Science Foundation e da Royal Society Bolsas visita curta e Marie Curie da UE Internacional GRR Fellowship entrada para KK, e Projeto BBSRC Grant (BB/H002278/1) e Wellcome Trust Equipamento Grant (073228/Z/03/Z) para AH
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Staining block | Brunel Microscope | ||
| Forceps No. 5 | Fine Science Tools | e.g. 11251-20 | |
| Tungsten needle: rod diameter, 0.5 mm; tip size, 1 μm; length, 2 inch | Roboz Surgical Instrument | RS-6065 | |
| Needle holder | Roboz Surgical Instrument | RS-6060 | |
| Arkansans stones: Repair Kit for Dumont Forceps | Fine Science Tools | 29000-00 | |
| 35 mm Petri dish with 27 mm glass base | Iwaki | 3930-035 | |
| Leica SP2-AOBS confocal inverted microscope with environment chamber | Leica | ||
| Reagent | |||
| Shield and Sang M3 insect medium (ecdysone free) | Sigma | S3652-500 ml | |
| Penicillin and streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | See 12 | ||
| FBS | Sigma | F7524 | |
| Poly-L-lysin | Sigma | P1399-25mg | |
| Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure | Polysciences | 04018-1 | |
| Mouse anti-glutamine synthetase antibodies | Millipore | MAB302 | |
| Rabbit anti-GFP antibodies | Life technologies | A11122 | |
| Mouse anti-REPO antibodies | Developmental Studies Hybridoma bank | 8D12 | |
| Rat anti-ELAV antibodies | Developmental Studies Hybridoma bank | 7E8A10 | |
| Rabbit anti-active caspase 3 antibodies | Abcam | ab13847 | |
| Normal goat serum | Vector Laboratories | S-1000 | |
| Anti-rabbit Alexa Fluor 488 | Life technologies | A11034 | |
| Anti-mouse Alexa Fluor 647 | Life technologies | A21236 | |
| Anti-rat Alexa Fluor 647 | Life technologies | A21247 | |
References
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