Summary
Somitogenesis er en rytmisk udviklingsproces, der rumligt mønstre kroppens akse hvirveldyr embryoner. Tidligere har vi udviklet transgene zebrafisk linjer, der bruger fluorescerende journalister til at observere de cykliske gener, der driver denne proces. Her har vi kulturen spredte celler fra disse linjer og billede deres svingninger over tid in vitro.
Abstract
Segmentering er en periodisk og sekventiel morfogenetisk proces i hvirveldyr. Denne rytmiske dannelse af blokke af væv kaldet somitter langs kroppen akse er tegn på en genetisk oscillator mønstret embryo under udvikling. I zebrafisk er den intracellulære ur kørsel segmentering består af medlemmer af Hendes / Hes transskription faktor familie organiseret i negativ feedback loops. Vi har for nylig skabt transgene fluorescerende reporter linjer for den cykliske gen HER1 der rekapitulere spatio-temporale mønster af svingninger i presomitic mesoderm (PSM). Ved hjælp af disse linjer, har vi udviklet et in vitro kultur system, der giver real-time analyse af segmentering ur svingninger inden for de enkelte, isolerede PSM celler. Ved at fjerne PSM væv fra transgene embryoner og derefter sprede celler fra oscillerende regioner på glasbund retter, vi genererede kulturer egnet til time-lapse billeddannelse af fluorescens signal fraindividuelle ur celler. Denne fremgangsmåde giver en eksperimenterende og konceptuelle rammer for direkte manipulation af segmentering ur med hidtil uset encellede opløsning, så dets celle-selvstændig og væv niveau egenskaber, der skal skelnes og dissekeret.
Introduction
Den periodiske dannelse af segmenter langs hvirveldyr kroppens akse, eller somitogenesis, er tegn på en rumlig og tidsmæssig oscillator i udviklingen af embryoet. Den foretrukne mekanisme kontrollerende somitogenesis er begrebsmæssigt beskrives ved en "ur og bølgefront" model 1, hvor "ur" bestående af cellulære oscillatorer, nu menes at være intracellulært drevet af den rytmiske ekspression af et sæt af cykliske gener 2, flåter fra formationen af somitter fra presomitic mesoderm (PSM). Da fosteret udvikler sig, en modning "bølgefront" i PSM bevæger sig i samråd med regression væv mod bageste, langsommere og anholde cellulære oscillatorer, som det passerer 3. Sammen er dette spatiotemporally dynamisk system kaldes segmentering ur. Nuværende tilgange til at studere segmentering ur span tre stigende niveauer af organisationen fra den genetiske oscillator i enkelte celler til lokale koblings thved opstår mellem celler og endelig til global regulering af positionelle oplysninger i den kollektive PSM væv 4..
Tidligere undersøgelser tyder på celle-autonome segmentering oscillator i zebrafisk består af gener og protein produkter fra transskription hendes / hes factorfamily, som menes at danne en negativ feedback loop gennem transkriptionel repression 5-7. Delta / Notch signalvejen synkroniserer svingninger mellem naboceller og regulerer den kollektive periode af befolkningen 8-10. FGF signalmolekyler produceret i tailbud synes at bygge en gradient tværs zebrafisk PSM, og derved hypotese at bidrage til at bremse og anholde oscillerende celler i den forreste 11. Indtil nu har de funktionelle roller hver af disse molekyler i somitogenesis blevet undersøgt af genetisk mutation, morpholino injektion, varme-shock over-udtryk, og antagonist drug treatment af ur komponenter og signalering mellem celler 5,7,10,12. Ved hjælp af disse forstyrrelser har segmentering urfunktion udledes af væv niveau beskrivelser af somite defekter og tab af ensartede svingninger i ekspression af cykliske gener som HER1, her7, og delta C. Men næsten alle disse data fra faste embryoner og undlader at præcist at indfange ændringer, der er uløseligt forbundet med den dynamiske funktion segmentering ur. For nylig er flere embryo time-lapse imaging afslørede første mutanter med ændret oscillator periode, men disse observationer blev også foretaget på vævsniveau 7,13. Således ikke blevet observeret adfærd hypotese celle-autonom oscillator under somitogenesis.
Statiske snapshots af somitogenesis et ufuldstændigt billede, fordi sagens natur, er processen drives af en oscillerende system. Tidligere arbejde i mus og chick celler viste, at niveauet af udskriftog protein stiger og falder, men prøveudtagning en ca 2 hr svingning hver 30 eller 45 min nødvendigvis begrænser de indsamlede data og dermed de konklusioner, der kan drages 14,15. Undersøgelse af andre biologiske oscillatorer, især, døgnrytmen ure, har bevæget sig væk fra iscenesatte målinger af gen-og protein udtryk til real-time overvågning ved hjælp af fluorescerende og selvlysende reportere 16,17. Disse værktøjer er afgørende for at demonstrere ur egenskaber af enkeltceller 18. Et bioluminescerende reporter af Hes1 cykliske gen er blevet udviklet og kortvarigt kendetegnet ved enkelt mus PSM celler 19. Den gennemsnitlige varighed og varians blev beregnet for et lille antal celler, som viser, at svingninger vare ved i flere cyklusser in vitro. Men disse undersøgelser ikke kvantitativt fat på stabilitet og robusthed af oscillator frekvens og amplitude, hvorvidt cellerne spontant kan komme ind eller udrejse svingninger,og hvordan cellerne opretholder deres faserelationer. Derudover er virkningerne af signalmolekyler fundet i embryonet celle-autonom ur ikke har været direkte testet. Derfor er disse fundamentale egenskaber af enkelt celle oscillator være fuldstændig ukendt.
Vi har for nylig udviklet transgene fisk linjer ved hjælp af BAC recombineering 20 til at køre Venus (YFP) fluorescens reportere HER1 udtryk 30. Sådanne linier udnytte de regulatoriske tidskoder af den intakte kromosomale locus, hvor de er indlejret og rekapitulere de tidsmæssige dynamik og rumlige mønster af HER1. Dette gennembrud giver mulighed for real-time overvågning af genekspression i udviklingslandene zebrafisk embryo in vivo. At studere de fundamentale egenskaber af celle-autonome svingninger og hvordan en sådan ekspression reguleres over tid, vi for nylig udviklet en pålidelig metode til at isolere og optage fra PSM celler in vitro. Denne protocol beskriver, hvordan vi har udnyttet vores transgene reporter linjer til at generere spredte cellekulturer, hvorfra vi kan karakterisere svingninger zebrafisk segmentering uret i enkeltceller. Vi kan derved løse de udestående spørgsmål i det felt, der ikke var tilgængelige med statisk eller vævs-level analyse, såvel som direkte manipulere segmentering ur på enkelt celle niveau med signalmolekyler og inhibitorer.
Protocol
1.. Før Dissektion
- På dagen før dissektion, få embryoner fra en incross af zebrafisk par heterozygote for den transgene allel.
- Hæv embryoner i E3 medium uden methylenblåt ved 28 o C indtil skjold etape (6 timer efter befrugtningen).
- Overfør embryoner i E3 medium uden methylenblåt til 20 o CO / N. Ved 20 o C vil embryoner udgør 1 somite per time, når de når tailbud stadie. Efter 17-20 timers O / N på 20 o C bør embryoner være på 5 til 8 somite iscenesætte den følgende morgen ved begyndelsen af dissektion protokollen.
- Saml værktøjer og nødvendige reagenser til dissektion.
- Fire-poleret glas pipette til overførsel af embryoner og væv
- Par fine tænger til fjernelse af chorions fra fostre
- Sylgard-coated 35 mm skål til dissektion - Hæld Sylgard polymer til en 35 mm skål og helbrede O / N i et 37 ° C. Gør dissektion godt brugeen nål for at fjerne en lille mængde hærdet polymer. Skålen kan rengøres og efterfølgende genbruges.
- Skærpede, fladtrykt wolfram wire værktøjer til PSM væv manipulation
- Micro-skalpel til at skære de ønskede stykker af PSM til kultur
- 35 mm plastik skål til trypsin inkubation
- L15-medium indeholdende 10% føtalt bovint serum
- 0,25% trypsin / EDTA-opløsning
- Sigmacoted gel-loading tips til spredning
- Plastic petriskåle indeholdende E3 medium uden methylenblåt.
- Dæk glasbund imaging fad med Fibronectin1 substrat (10 ug / ml i PBS). Lad parabol på bænken til pels under dissektion.
- Brug stereoskop med passende fluorescens-filtre til at identificere og sortere positive transgene embryoner (5 til 8 somite fase).
- Identificer transgene embryoner ved at undersøge presomitic mesoderm (PSM) for YFP udtryk under fluorescens kanal (figur 1A). Fluorescens should være synlige i området fra den sidste dannede somite til tailbud. Vælg fostre med lyseste signal; 25% af afkommet være homozygote embryoner med 2 kopier af transgenet. Antallet af identificerede embryoner nødvendige varierer baseret på eksperimentet. En dissekeret tailbud stykke vil give 1.000 celler i gennemsnit. Typisk et par yderligere positive embryoner er nyttigt i tilfælde af fejl er lavet under dissektion.
- Brug transmitteret lys som en positionel reference til at skelne enhver autofluorescens, især i blommen celle, fra signalet.
- Overfør positive embryoner til en separat plastik petriskål indeholdende E3 medium uden methylenblåt.
2.. PSM Dissektion og spredning
- Forbered embryoner til dissektion.
- Under en dissektion mikroskop, ved hjælp af fine tænger, fjern forsigtigt chorion fra hvert foster i E3 medium. Vær sikker på ikke at beskadige embryo eller forstyrre æggeblomme celle. Fyld Sylgard-belagte dissekere fad med L15-medium med serum. Brug pincet eller en anden flad værktøj, fjerne eventuelle luftbobler fra overfladen af Sylgard.
- Overfør dechorionated embryoner ved hjælp af brand-poleret glas pipette til dissektion fad.
- Ved hjælp af wire værktøjer, flytte alle embryoner til den ene side af dissekere fad.
- Dissekere PSM fra et enkelt foster.
- Orient et enkelt embryo på sin laterale side i den lille godt lavet i Sylgard lag i dissekere skål (figur 1B).
- Ved hjælp af mikro-skalpel skive gennem embryo og æggeblomme celle lige foran baghjerne og gennem den ventrale pol af embryo (figur 1B, oversået rød linje).
- Fjern den forreste stykke af embryonet fra brønden, flytte det væk til den side af skålen, og derefter bruge wire værktøjer til at skrabe væk resterende æggeblomme celle granulat fra den bageste sektion inklusive PSM.
- Når blommen er skrabet væk, flade og orientere PSM med den forreste ende pegende væk fra forsøgslederen og den bageste peger mod forsøgslederen (figur 1C).
- Hvis det tynde lag af ectoderm ikke er trukket ud af dette punkt, skal du bruge wire værktøjer til at flå det væk fra toppen af PSM væv.
- Ved hjælp af mikro-skalpel skære tailbud den mest bageste spids af PSM forbi enden af rygstrengen, væk fra resten af vævet (figur 1C, prikket rød linje). BEMÆRK: Andre stykker af væv fra PSM, for eksempel anterior PSM tættere til den sidste dannede somit, kan også tages i kultur, afhængigt af den eksperimentelle spørgsmål.
- Flyt tailbud stykke til et hjørne af skålen væk fra dissekere område. Brug wire værktøjer til at rydde enhver snavs og uønsket foster væv fra dissekere felt.
- Gentag med den næste foster.
- Pool tailbud stykker fra flere embryos, afhængigt af hvor mange celler vil være behov for eksperimentet. I gennemsnit et enkelt stykke tailbud væv giver 1000 celler.
- Fyld tom 35 mm plastik skål med en lille mængde trypsin-EDTA.
- Brug af ild-poleret glas pipette tailbud stykker fra dissekere fad i skål indeholdende trypsin / EDTA. Inkuber tailbud stykker i trypsin / EDTA i 20 minutter ved RT.
- Mens vævet bliver inkuberes i trypsin fjerne Fibronectin1 opløsningen fra glas-bund imaging fad.
- Vask opløsningen fra glas 3 gange med MilliQ vand. Brug sugning hver vask og sikre fadet er helt tørt.
- Disperger tailbud stykker i medium til billeddannelse.
- Tilsæt 100 ul L15 medium med serum i imaging fad.
- Ved hjælp af en belagt gel spids, fjern tailbud brikker fra trypsin / EDTA i så lille et volumen som muligt.
- Pipette tailbud brikker i mediet ibilleddannelse skålen. Pipette brikkerne op og ned flere gange for at bryde dem fra hinanden og suspendere cellerne i mediet. Vær forsigtig med ikke at indføre luftbobler. Check for celleklumper under lup og sprede mere efter behov.
- Tillad spredte celler i suspensionen til rette på Fibronectin1-belagt glas i 20 minutter ved RT.
- Tilføj en lille mængde ekstra L15 medium med serum til cellerne, før du begynder billeddannelse. Vær forsigtig ikke at forstyrre afviklede celler.
- I betragtning af den eksperimentelle spørgsmål, tilføje supplerende eller medicinsk behandling til kulturen.
3.. Imaging spredte PSM celler
- Opsæt imaging fad i temperatur kammer på time-lapse imaging mikroskop. Indstil Warner kammer til den ønskede temperatur til eksperimentet. Tillad parabol til ligevægt i mindst 30 minutter, før du begynder billede erhvervelse. Krydstjekning temperatur med ekstern temperaturføler anbragt i skålen, hvis det kræves. BEMÆRK: På grundsammenhængen mellem temperatur og somitogenesis rate 21 stabil temperaturkontrol er afgørende for nøjagtige målinger af tid i enkelt PSM celler.
- Anskaf testbilleder i fluorescens kanal for at kontrollere, at eksponeringstid og vinde giver et stort dynamikområde af intensiteter uden mætning for at sikre god signal til støjniveauet. En typisk fluorescensbillede erhvervet fra dispergerede celler genereret fra vores linjer ved hjælp af denne protokol kræver 400 msek og 40 msek for en transmitteret lys billede med en EMCCD kamera opererer på en EM Gevinst på 85. Desuden pre-amp gain og udlæsning hastighed fra Kameraet er også vigtigt at maksimere signal over støj.
- Ved hjælp af transmitteret lys kanal, skal du vælge områder af celler til time-lapse købet.
- Kør time-lapse erhvervelse protokol til den ønskede længde af tid.
- Erhverve en transmitteret lys og en fluorescens billede pr felt. BEMÆRK: Indstil et interval mellem erhvervelse rounds, der vil fange tidsmæssige dynamik uden fotoblegende over længere billedbehandling eller inducere toksicitet i cellerne. Denne protokol anvender en 2 min interval.
- Tjek time-lapse set-up lejlighedsvis under optagelse for at sikre, at cellerne forbliver i fokus, ingen software eller hardware fejl osv.
4.. Image Processing af erhvervede Time-lapse film
- Åbent filmarkiv for en erhvervet felt i et billedbehandlingsprogram software. BEMÆRK: Fiji blev brugt til al forarbejdning i denne protokol.
- Split transmitteret lys og fluorescens frames fra et felt til at oprette 2 stakke af billeder.
- Spor en enkelt celle i det transmitterede lys kanal.
- Placer en cirkulær ROI (region af interesse) omkring den markerede celle i den første ramme i det lys kanal. BEMÆRK:.. Kun celler, at 1 er sunde i slutningen af optagelsen, 2 ikke bevæge sig uden for det område, og 3 ikke kommer i kontakt med andre ce.LLS spores.
- Gem et ROI hvert par rammer til ROI manager. Spor celle, indtil den sidste ramme.
- Måle intensiteten brug af de gemte ROI'er på fluorescens kanal.
- Vælg fluorescens stak og med den gemte ROIs bruge brugerdefinerede cirkel interpolator plug-in og makro til at måle intensiteten af sporet celle over tid.
- Kontroller output spor fra makroen. Hvis spor kvalitativt fanger funktioner i fluorescens time-lapse, eksportere værdierne til et Excel-regneark.
- Gem listen ROI for cellen.
- Gentag sporing i transmitteret kanal og måle fluorescens kanal for andre celler i området.
- Gentag alle trin for yderligere felter fra eksperimentet.
Representative Results
Denne protokol producerer kulturer af levedygtige, dispergerede, enkelt PSM celler til time-lapse billeddannelse af fluorescens signal (figur 2). Vores transgen genererer en journalist, hvis cyklus i produktionen, og der sker en nedbrydning med lignende dynamik til endogene gen og protein i embryonet, om rækkefølgen af en halv time. På grund af dets hurtige omsætning bør YFP signal i enkelte celler detekteres hurtigt at minimere blegning og med en høj tidsopløsning at fange funktionerne i hver oscillerende cyklus. Også i betragtning af den relative dimness af signalet, kultur og erhvervelse betingelser er blevet omhyggeligt afstemt for at sikre følsomme og robuste resultater. Vi har fundet følgende faktorer er vigtige i at skabe optimale PSM cellekulturer til billeddannelse:. 1. En ECM substrat, der anvendes til belægning dyrkningsskålene glasbund. 2.. Tilsætning af serum til dissektion og billeddannende medie. 3.. Dissektion af PSM fra identificerede embryoner taget efter parring HETErozygous par, hvis afkom potentielt bære 2 kopier af transgen. 4.. Billede erhvervelse inden for et optimalt Forstørrelsesområde, ved hjælp af en højere NA målsætning at sikre en effektiv indfangning af fluorescens-signalet. 5.. Belysning med en solid-state lyskilde for at minimere intensitetsfluktuationer der kan bidrage til baggrundsstøj. 6.. Signalgenkendelse med en meget følsom EM-CCD-kamera for at maksimere signal udlæsning.
Optimale kulturer indeholde celler, der ikke forbliver afrundet og sundt hele optagelsen. Vi antager, at vores ECM-substrat, et fragment af zebrafisk fibronectin1 holder cellerne i en udifferentieret PSM-lignende tilstand i sammenligning med andre almindeligt anvendte substrater som poly-lysin eller laminin. Andre substrater vi testede forårsagede celler til at flade på glasset, og tabet af oscillerende fluorescerende signal i løbet af optagelsen. Vi fandt også, at tilsætning af serum til mediet under dissektion, spredning,og registrering var ikke kun vigtigt at slukke anvendes trypsin til dissociation, men også forøget fluorescens intensitet over baggrunden, sandsynligvis på grund af forbedret cellelevedygtighed. For at sikre optimal signal opsamling fra enkelte celler, vi brugte en 40x objektiv specielt designet til fluorescensimagografi (Zeiss Plan NeoFluor serien) med en høj NA. Vi fandt også, at en solid-state lyskilde givet mere stabil belysning end traditionelle kviksølvlamper, hvilket er kritisk for at minimere baggrunden udsving, der bidrager til støjende billeder. Disse ændringer er vigtige for at sikre robuste resultater.
Ved anvendelse af denne protokol, forventer vi kulturer, hvor størstedelen af celler i et givet område er fluorescerende på et tidspunkt under optagelsen. Vi finder, at fluorescerende celler typisk forblive afrundet og er til tider ganske bevægelige under optagelser. Enkelte celler, herunder fluorescerende celler, kan blive apoptotisk under optagelsen. Disse celler er udelukket fra enhver aNALYSE. Vi har også udelukke celler, der kommer i kontakt med andre celler eller bevæge sig uden for synsfeltet. I gennemsnit ser vi en 12% reduktion i celleantal pr område ved afslutningen af 10 timers optagelse som måles ved at tælle antallet af sunde celler i transmitteret lys kanal. Dette tab omfatter både celledød, og celler, der er flyttet ud af feltet. På baggrund af disse forbehold kan vi i gennemsnit spor 5 fluorescerende celler pr der forbliver levedygtig og synlig og typisk optage 6 felter pr tilstand. For eksempel vil et forsøg med fire betingelser har 24 total felter erhvervet og typisk omkring 30 sporede celler pr tilstand. Under standard billedbehandling betingelser med L15 medium indeholdende 10% føtalt bovint serum, finder vi, at PSM celler (n = 101 celler fra 4 eksperimentelle gentagelser) kan producere mellem 2 og 7 toppe med middelværdi og standardafvigelse på 3 ± 1 toppe (2 -3 cykler). Medianen maksimale antal, samt 25% percentilen, er 2 toppe og 75% fraktilen iS 3 toppe. Ved hjælp af vores semi-automatiseret sporing og analyse, kan vi hurtigt generere fluorescens intensitet over tid spor for de enkelte PSM celler, med en repræsentant celle spor vist i figur 2C. Disse rå spor kan derefter bruges til at lave kvantitative målinger af egenskaber af de oscillerende PSM celler, såsom frekvens, amplitude, antal cyklusser, og timingen af toppe.
Fig. 1. Identifikation af transgene embryoner og skemaer af deres dissektion. (A) sidebillede af en transgen zebrafisk embryo udtrykker YFP fluorescens på ~ 5-somit fase. Billedet er en overlejring af transmitteret lys og fluorescens-kanal. Pile viser områder af signal, der starter ved spidsen af tailbud hele PSM, mod l ast dannede somite. Indsat viser skematisk reporter transgen (for mere information om dets udvikling og in vivo-opførsel refererer til Soroldoni et al. 30.. (B) Skematisk af lateral syn på embryo inden første skåret under dissektion. Røde linie angiver det første snit gøres i hele baghjerne, selvom æggeblomme celle lige bag tailbud. (C) Skematisk visning af fladtrykt PSM efter fjernelse af æggeblomme granulater og epidermal lag, orienteret langs dens anteriore-posteriore akse. røde linie angiver andet snit til at fjerne spidsen af tailbud for spredning og kultur. Klik her for at se en større version af dette tal.
07fig2.jpg "/>
Figur 2.. Repræsentative billeder og spor fra en enkelt celle i en spredt PSM kultur. (A) Montage af transmitteret lys billeder af en enkelt PSM celle i en 6-h tidsforskudt optagelse. Bemærk, at cellen forbliver afrundede og sunde under hele optagelsen. (B) Tilsvarende montage af fluorescens billeder fra en enkelt PSM celle. Toppe i intensitet af cellen er nummereret i løbet af optagelsen. (C) Gennemsnit intensitet over tid, målt fra et ROI placeret på denne celle. Værdier er taget fra hver billede fra en film med en frame rate på én per 2 minutter ved hjælp af cirklen interpolator plug-in og brugerdefinerede makro skrevet i Fiji. Peaks i intensitet igen nummereret hele spor. Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
At studere en cellulær proces, der finder sted i løbet af fosterudviklingen, biologer benytter typisk en tilgang til hele foster. Men for fuldt ud at forstå, hvordan en enkelt celle opfører sig inden for en udviklingsmæssig tidsramme, en metode til at undersøge og forurolige de enkelte celler i isolation er også meget gavnligt. Ved at generere spredte PSM cellekulturer ved hjælp af transgene zebrafisk embryoner har vi nu et redskab til direkte at studere cellen selvstændige karakter af genetiske svingninger i segmentering ur på en kvantitativ måde. Det er muligt at måle dynamikken i svingninger i vores fluorescerende reporter i hundredvis af celler under en række betingelser.
Den observerede periode af enkelt celler i kultur er længere end somitogenesis periode i den intakte embryoet. Vi observerer, at en intakt PSM explant i kultur udviser også langsommere svingninger end den intakte embryo (data ikke vist), hvilket tyder på that længere periode observeret i isolerede celler er ikke blot på grund af skader fra spredning. Observeres En variabel periode og amplitude i de fleste af vores serie encellede tid. Kilden til denne variation er ukendt, men bør afsløre vigtige detaljer om segmentering ur tempo-making kredsløb.
Med denne metode kan vi studere de genetiske komponenter af segmentering på celleniveau samt behandle spørgsmål, der er udfordrende at undersøge i hele embryoet. For eksempel ved kontrolleret tilsætning af kendte signalmolekyler findes i udviklingen af embryoet til vores kulturer, kan vi undersøge deres virkninger på det indre PSM cellulære oscillator i en robust og reproducerbar analyse. Vores PSM kultur-system åbner døren til en streng vurdering af, hvilke faktorer, alene eller i kombination fremmer svingninger i disse celler, hvilke faktorer hæmmer disse svingninger, og for at afprøve samspillet mellem disse molekyler. Med disse værktøjer i hånden, vi sigter mod atevaluere eksisterende modeller for somitogenesis der er baseret på offentliggjorte data væv niveau, samt brug resulterer i enkelte celler til at generere forudsigelser, der kan testes i hele embryoet.
Til vores viden, dette er den første zebrafisk primær cellekultur protokol for akut tidsforskudt optagelse af fluorescens i enkeltceller; videreudvikling og forfining af denne protokol er ingen mulig tvivl. Andre protokoller anvender ofte zebrafisk embryoner til at generere stabile cellelinjer, der kan transficeres med journalister, og som anvendes til langsigtet billeddannelse 27-29. Mens stabile linjer er nyttige til billeddannelse en proces, der ikke er bundet til udviklingen timing, såsom den døgnrytmen ur, spørgsmålet om embryonale segmentering nødvendiggør øjeblikkelig billeddannelse mens cellerne er stadig i deres oscillerende, stamfader tilstand. Når celler stoppe oscillerende, de antager en differentieret celle skæbne, og da i vævet, vil blive indarbejdet i en somite. Det er possible at med den rette faktor eller faktorer i vitro vi kunne generere PSM-lignende zebrafisk cellekultur linjer, der ville forblive oscillerende, således betydeligt længere sigt observationer, flere sekventielle perturbationer eller high-throughput screening.
Vi forventer, at denne metode til fremstilling af primære kulturer af dispergerede celler til time-lapse imaging er velegnet til studiet af enhver cellulær proces, der forekommer inden for en udviklingsmæssig tidsramme, som ikke er tilgængelige ved hjælp af stabile zebrafisk cellelinjer. Isoleringen af distinkte celletyper på forskellige udviklingsstadier fra de relevante transgene reporter linier, enten via dissektion eller via FACS efter embryonale dissociation, kunne give de startende celler. Nogle optimering af dyrkningsbetingelserne, styret af den embryonale oprindelse af cellerne, kan være påkrævet. Ved at kombinere denne fleksible og følsomme protokol med den hastigt voksende samling af transgene zebrafisklinjer, håber vi at fremme en in vitro udviklingsmæssige biologi tilgang, der er et supplement til de klassiske genetiske og embryologiske metoder.
Disclosures
Forfatter bidrag:
ABW udviklet og forfinet spredning, kultur, billedbehandling og cellesporing protokoller. DS genererede de transgene linjer og overså udformningen af time-lapse fluorescens mikroskop anvendes i denne protokol. AO pioner indledende proof-of-principle eksperimenter at tage afstand og image PSM celler i kultur. JS skrev cirklen interpolator plugin værktøj i Fiji bruges til at måle fluorescens intensitet fra time-lapse film. ABW og ACO skrev manuskriptet.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af en EMBO Langsigtet stipendium (ABW), en National Science Foundation International Postdoc Research Fellowship (ABW), Max Planck Gesellschaft (ABW, DS, JS, ACO), en graver-BB-stipendium (AO) og Det Europæiske Forskningsråd under De Europæiske Fællesskabers syvende rammeprogram STG-207.634 (DS, ACO). Vi takker Ravi Desai for nyttige kommentarer til manuskriptet. Vi vil også gerne takke MPI-CBG protein udtryk facilitet til produktion af zebrafisk Fibronectin1 fragmentet, MPI-CBG fisk facilitet personale til pleje og vedligeholdelse af vores fisk linjer og MPI-CBG lysmikroskopi facilitet til billeddannelse support.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Epifluorescence microscope | Olympus | Model: SZX16 | |
| Epifluorescence microscope | X-cite Illumination | Series: 120Q | |
| Dissection microscope | Olympus | Model: SZX12 | |
| Fine forceps no. 55 | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Glass transfer pipettes | Assistent | 567/2 | |
| 35 mm plastic petri dishes | Greiner | 627102 | |
| 60 mm plastic petri dishes | Greiner | 628102 | |
| Sylgard polymer | SASCO | 266727 | |
| Manipulation tools | Made in-house | For description of manipulation tools Ref. 22 | |
| Microsurgical knife | World Precision Instruments | 500249 | |
| L15 medium | Invitrogen | 57322 | |
| Penicillin/streptomyocin | PAA | P11-010 | |
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 257322 | |
| 0.05% trypsin / 0.02% EDTA | PAA | L11-004 | |
| Gel loading tips | Fisher Scientific | 253188 | |
| Sigmacote | Sigma Aldrich | 254589 | |
| Micropipette set | Gilson International | F167300 | |
| Zebrafish Fibronectin1 70 kD fragment | MPI-CBG protein facility | Generated in-house from construct based on previously published work Ref. 23-25 | |
| Glass bottom imaging dishes | Mattek (single well) | P35G-1.5-14-C | |
| Glass bottom imaging dishes | Greiner (CellView -multi-well) | 262502 | |
| E3 medium without methylene blue | Made in-house | From The Zebrafish Book, 5th Ed. Ref. 26 | |
| Plastic transfer pipettes | Ratiolab | 260011 | |
| Warner heating/cooling chamber | Warner Instruments | TC-324B/344B | |
| EM-CCD camera | Andor | Model: iXOn 888 | |
| Wide-field fluorescence microscope with Venus filter set | Zeiss | Model: Axiovert 200M | |
| Wide-field fluorescence microscope with Venus filter set | NeoFluor 40x, NA 0.75 | ||
| Wide-field fluorescence microscope with Venus filter set | Lumencor Light Engine | Model: Spectra X | |
| Wide-field fluorescence microscope with Venus filter set | BrightLine HC 575/15 | F39-575 |
References
- Cooke, J., Zeeman, E. C. A clock and wavefront model for control of the number of repeated structures during animal morphogenesis. J Theor Biol. 58, 455-476 (1976).
- Oates, A. C., Morelli, L. G., Ares, S. Patterning embryos with oscillations: structure, function and dynamics of the vertebrate segmentation clock. Development. 139, 625-639 (2012).
- Dequeant, M. L., Pourquie, O. Segmental patterning of the vertebrate embryonic axis. Nat Rev Genet. 9, 370-382 (2008).
- Oates, A. C., Gorfinkiel, N., Gonzalez-Gaitan, M., Heisenberg, C. P. Quantitative approaches in developmental biology. Nat Rev Genet. 10, 517-530 (2009).
- Oates, A. C., Ho, R. K. Hairy/E(spl)-related (Her) genes are central components of the segmentation oscillator and display redundancy with the Delta/Notch signaling pathway in the formation of anterior segmental boundaries in the zebrafish. Development. 129, 2929-2946 (2002).
- Lewis, J. Autoinhibition with transcriptional delay: a simple mechanism for the zebrafish somitogenesis oscillator. Curr Biol. 13, 1398-1408 (2003).
- Schroter, C., Oates, A. C. Segment Number and Axial Identity in a Segmentation Clock Period Mutant. Curr Biol. 20, 1254-1258 (2010).
- Riedel-Kruse, I. H., Muller, C., Oates, A. C. Synchrony dynamics during initiation, failure, and rescue of the segmentation clock. Science. 317, 1911-1915 (2007).
- Ozbudak, E. M., Lewis, J. Notch signalling synchronizes the zebrafish segmentation clock but is not needed to create somite boundaries. PLoS Genet. 4, e15 (2008).
- Herrgen, L., et al. Intercellular Coupling Regulates the Period of the Segmentation Clock. Curr Biol. 20, 1244-1253 (2010).
- Sawada, A., et al. Fgf/MAPK signalling is a crucial positional cue in somite boundary formation. Development. 128, 4873-4880 (2001).
- Giudicelli, F., Ozbudak, E. M., Wright, G. J., Lewis, J. Setting the tempo in development: an investigation of the zebrafish somite clock mechanism. PLoS Biol. 5, e150 (2007).
- Herrgen, L., Schroter, C., Bajard, L., Oates, A. C. Multiple embryo time-lapse imaging of zebrafish development. Methods Mol Biol. 546, 243-254 (2009).
- Hirata, H., et al. Oscillatory expression of the bHLH factor Hes1 regulated by a negative feedback loop. Science. 298, 840-843 (2002).
- Maroto, M., Dale, J. K., Dequeant, M. L., Petit, A. C., Pourquie, O. Synchronised cycling gene oscillations in presomitic mesoderm cells require cell-cell contact. Int J Dev Biol. 49, 309-315 (2005).
- Reppert, S. M., Weaver, D. R. Coordination of circadian timing in mammals. Nature. 418, 935-941 (2002).
- Welsh, D. K., Imaizumi, T., Kay, S. A. Real-time reporting of circadian-regulated gene expression by luciferase imaging in plants and mammalian cells. Methods Enzymol. 393, 269-288 (2005).
- Soroldoni, D., Oates, A. C. Live transgenic reporters of the vertebrate embryo's Segmentation Clock. Curr Opin Genet Dev. 21, 600-605 (2011).
- Masamizu, Y., et al. Real-time imaging of the somite segmentation clock: revelation of unstable oscillators in the individual presomitic mesoderm cells. Proc Natl Acad Sci USA. 103, 1313-1318 (2006).
- Soroldoni, D., Hogan, B. M., Oates, A. C. Simple and efficient transgenesis with meganuclease constructs in zebrafish. Methods in molecular biology. 546, 117-130 (2009).
- Schroter, C., et al. Dynamics of zebrafish somitogenesis. Dev Dyn. 237, 545-553 (2008).
- Picker, A., Roellig, D., Pourquie, O., Oates, A. C., Brand, M. Tissue micromanipulation in zebrafish embryos. Methods in molecular biology. 546, 153-172 (2009).
- Mould, A. P., et al. Identification of multiple integrin beta1 homologs in zebrafish (Danio rerio). BMC Cell Biol. 7, 24 (2006).
- Mould, A. P., Koper, E. J., Byron, A., Zahn, G., Humphries, M. J. Mapping the ligand-binding pocket of integrin alpha5beta1 using a gain-of-function approach. Biochem J. 424, 179-189 (2009).
- Zhao, Q., Liu, X., Collodi, P. Identification and characterization of a novel fibronectin in zebrafish. Exp Cell Res. 268, 211-219 (2001).
- Westerfield, M. In The zebrafish book : a guide for the laboratory use of zebrafish (Brachydanio rerio). , (1993).
- Vallone, D., Santoriello, C., Gondi, S. B., Foulkes, N. S. Basic protocols for zebrafish cell lines: maintenance and transfection. Methods Mol Biol. 362, 429-441 (2007).
- Carr, A. J., Whitmore, D. Imaging of single light-responsive clock cells reveals fluctuating free-running periods. Nat Cell Biol. 7, 319-321 (2005).
- Whitmore, D., Foulkes, N. S., Sassone-Corsi, P. Light acts directly on organs and cells in culture to set the vertebrate circadian clock. Nature. 404, 87-91 (2000).
- Soroldoni, D., et al. A Doppler effect in embryonic pattern formation. Science. 345, DOI. 222-225 (1126).
