Summary
Un metodo per l'assemblaggio di gradienti adesivi e solubile in una camera per gli studi di microscopia vivi migrazione cellulare è descritto. L'ambiente di ingegneria combina superfici antivegetative e le tracce adesive con pendenze soluzione e permette quindi di determinare l'importanza relativa di spunti di orientamento.
Abstract
Cellule possono percepire e migrare verso concentrazioni più elevate di stimoli adesive come le glicoproteine della matrice extracellulare e spunti solubili come fattori di crescita. Qui, descriviamo un metodo per creare gradienti opposti di segnali adesivi e solubile in una camera microfluidica, che è compatibile con imaging cellulare vivo. Un copolimero di poli-L-lisina e polietilene glicole (PEG-PLL) è impiegato per passivare coprioggetto e prevenire adsorbimento non specifico di biomolecole e cellule. Successivamente, la stampa microcontatto o litografia dip penna sono utilizzati per creare percorsi di streptavidina sulle superfici passivati per servire come punti di ancoraggio per il peptide biotinilato arginina-glicina-acido aspartico (RGD) come cue adesivo. Un dispositivo microfluidico è disposto sulla superficie modificata e utilizzata per creare il gradiente di segnali adesivi (100% allo 0% RGD RGD) sulle tracce streptavidina. Infine, lo stesso dispositivo microfluidico è usato per creare un gradiente di suc chemoattractanth come siero bovino fetale (FBS), come cue solubile in direzione opposta del gradiente di segnali adesivi.
Introduction
Migrazione cellulare Regia è una proprietà fondamentale di molte cellule ed è un aspetto fondamentale di molti processi fisiologici, tra cui lo sviluppo embrionale, la difesa contro le infezioni e guarigione della ferita. Inoltre, la migrazione cellulare gioca anche un ruolo importante in molte malattie quali malattia vascolare, cellule tumorali e metastasi 1,2 infiammazione cronica. Mentre gli stati classici della migrazione cellulare - polarizzazione, estensione protrusione, la formazione di adesione, la generazione di forza e retrazione posteriore - sono generalmente accettate 3,4, la delucidazione dei meccanismi spazio-temporali da cui esso è coordinato integrazione del segnale è stato più impegnativo.
La matrice extracellulare (ECM) serve come substrato per l'adesione cellulare, e attraverso chimica e fisica inerente 5 6 diversità, fornisce indicazioni direzionali per cella 7,8 navigazione. In aggiunta a questi segnali adesive 9, fattori solubili 10-12 </ Sup>, come chemochine e fattori di crescita in grado di indurre la migrazione delle cellule attraverso i recettori chemiotattico diretto e la loro segnalazione a valle motogenic. Attualmente, non è noto se l'impegno e segnalamento attraverso recettori di adesione integrine (cioè) o recettori chemoattraente, come recettore tirosina chinasi (RTK), sono dominanti. Non è neppure noto se gerarchie di sistemi recettoriali sono tipo specifico delle cellule.
Microscopia di cellule in diretta dà una ricchezza di informazioni che non è accessibile nei test di massa e può essere combinato con dispositivi microfluidici per generare gradienti immobilizzati di spunti 13,14 e solubile 15 16. Il metodo qui descritto utilizza una serie di semplici passaggi e consolidata per modificazione superficiale in combinazione con una camera disponibile in commercio microfluidica per creare un saggio di imaging per la migrazione cellulare che può essere facilmente implementato in un laboratorio di biologia cellulare (Figura 1). L'assemblatodispositivo a microfluidi ha qualità ottiche che sono paragonabili al vetro 17 e il gradiente di molecole diffusibili sono stabili per almeno 16 ore. Il sistema può essere utilizzato per tecniche epifluorescenza e avanzate. A differenza di altre configurazioni chemiotassi 18, questo sistema è adatto per la registrazione lenta migrazione, cellule aderenti. Importante, il sistema è modulare e permette facilmente l'introduzione di adesivo alternativa o segnali migrazione solubili e l'esame di vari tipi cellulari.
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Protocol
1. Passivazione di vetrini con PLL-PEG-biotina
Questa fase ha lo scopo di passivazione della superficie in modo che le cellule aderiscono e migrare su regioni specifiche sul vetrino di vetro che vengono creati con la stampa microcontract (Fase 2-3a) o litografia dip penna (Step 3b). Per la passivazione, un co-polimero di poli-L-lisina (PLL) e polietilene glicole (PEG) viene utilizzato in cui il 20% delle molecole di PEG sono stati innestati biotina (PLL-PEG-biotina).
- Per la pulizia coprioggetto di vetro (18 mm x 18 mm), immergere in un rack in 100% di etanolo e la cremagliera in un bagno sonicating per 30 minuti. Asciugare i vetrini in aria o in corrente di azoto.
- Successivamente, i vetrini sonicazione per 30 min in 1 M NaOH. Successivamente sciacquare le superfici in vetro con cautela immergendo il rack in un bicchiere pieno di 1.5 L Milli-Q H 2 O. Ripetere il processo di risciacquo tre volte utilizzando fresco Milli-Q H 2 O di volta in volta. Asciugare i vetrini inun forno a 60 ° C.
- Mezzo posto del vetro pulito coprioggetti singolarmente in una camera umida, che è fatto di una piastra a 24 pozzetti parzialmente riempito con H 2 O. Goccia 15 ml di PLL biotina-PEG-(1 mg / ml) in PBS su ciascun vetrino coprioggetto. Prendere l'altra metà dei restanti coprioggetto di vetro pulito e con attenzione a sandwich la soluzione PEG. Lasciare i vetrini per 1 ora nella camera umida. Far scorrere i coprioggetti sandwich delicatamente distanza l'uno dall'altro, senza raschiare il PEG superficie verniciata e sciacquarle con Milli-Q H 2 O. L'acqua deve scorrere via facilmente sul lato PEG-trattati. Se necessario, asciugare i vetrini su carta assorbente con la superficie trattata rivolta verso l'alto. Conservare i vetrini in un essiccatore sotto vuoto fino all'uso successivo.
2. Fabbricazione di francobolli per la stampa microcontatto
Descriviamo due processi alle tracce streptavidina modello sui vetrini passivati. Il primo, microfonorocontact stampa, tipicamente richiede la realizzazione di un master di silicio da cui viene colato un timbro PDMS. Nel nostro caso, il modello del timbro PDMS sono 100 um livello linee che sono distanziati 290 micron da centro a centro con un'altezza caratteristica di 25 micron. Qui di seguito, si descrive brevemente come fabbricare un maestro adatto al silicio (Step 2,1-2,3) e timbro PDMS (Fase 2.4). Tuttavia, ci sono più protocolli per la stampa microcontatto descritti in letteratura 19-23, che sono adatti per la stampa su modelli proteici coprioggetto. Master può anche essere fatta su misura e acquistati da fonti commerciali.
- Prima, pulire il wafer di silicio (4 "di diametro) incubando in soluzione Piranha (3:1 v: v di acido solforico e perossido di idrogeno al 30%). Per 20 min Sciacquare accuratamente il wafer 10 volte con MilliQ H 2 O. Essiccare il wafer in un forno a 150 ° CO / N.
- Risciacquare il wafer di silicio pulita ed essiccata con il 100% di acetone, seguito da 100% di alcol isopropilico. Prossimospin-coat 2 ml di GM1070 SU-8 photoresist (Gersteltec Sarl) sul wafer a 3.100 rpm per 40 secondi per creare un 25 spesso strato micron. Il campione viene quindi cotta su una piastra calda a 65 ° C per 5 minuti seguiti da un ulteriore 5 min a 95 ° C.
- Esporre il SU-8 fotosensibile ai raggi UV per 60 secondi sotto un fotomaschera con il modello desiderato (ad esempio utilizzando un Quintel Q6000 maschera allineatore) e ripetere il processo di cottura descritto al punto 2.2. Allora il campione è sviluppato immergendo il wafer in SU-8 developer (Gersteltec Sarl) per 4 min, sciacquati in 100% alcool isopropilico ed essiccato sotto flusso di azoto. L'area del SU-8 photoresist che non è stato esposto a luce UV viene quindi rimosso, creando il pattern inverso del timbro PDMS.
- Il passo successivo è quello di lanciare un timbro PDMS dal master silicio. Primo, mescolare 1 parte (w / w) del catalizzatore con 10 parti di prepolimero elastomero (Sylgard 184). Per eliminare eventuali bolle d'aria, la miscela degas in un essiccatore collegato a una linea di vuotoper 1 ora. Successivamente, versare l'elastomero PDMS sul master silicio all'interno una capsula di Petri a circa 1 cm di altezza e curare la miscela master e PDMS in un forno a 70 ° C per 1 ora. Infine, il timbro PDMS viene rimosso dal master silicio e tagliato a misura.
3. Patterning streptavidina o Cue adesivi sul coprioggetto di vetro passivato
Dopo passivante vetrini, profili proteici sono stampate con stampa microcontact (3a Fase) o dip-pen litografia (Step 3b). Nel nostro caso, streptavidina viene stampato come linee, che costituiscono la base per gradienti RGD (Passaggio 4). La stessa procedura può essere utilizzata anche per la stampa di proteine di matrice per creare modelli adesivi.
Un metodo alternativo per la stampa microcontatto per il patterning di biomolecole su superfici è litografia dip penna. In litografia dip penna, un cantilever viene utilizzato per trasferire un piccolo volume di soluzione sulla superficie. Le dimensioni dei cantilever, viscosità della soluzione, il tempo di contatto del cantilever sulla superficie, idrofobicità della superficie e l'umidità nella camera di stampa determina la dimensione delle caratteristiche stampati. Il vantaggio di questo metodo è che diversi modelli possono essere stampati per ogni esperimento, in quanto non vi è alcuna necessità di fabbricare maestri e timbri. Lo svantaggio è che ci vuole più tempo per stampare un dato modello e che litografia dip penna necessita di uno strumento specializzato che potrebbe non essere disponibile in molti laboratori. La penna strumento tuffo litografia che abbiamo usato era l'NanoeNabler da Bioforce nanoscienze. Qui, abbiamo stampato piccoli punti che erano <10 micron di diametro, per il quale abbiamo usato SPT10 cantilever.
3a. Microcontact Stampa (μCP) Tecnica
- Per pulire e rendere il timbro PDMS più idrofila, trattare lato modellato dei francobolli PDMS in un UV e ozono (per esempio, Procleaner ozono UV Bioforce da Nanoscience) per 1,5 ore. In alternativa, utilizzare un plasmapulitore per un tempo più breve per lo stesso scopo. Questo processo crea una superficie ossidata PDMS 24, che migliora il processo di stampa.
- Immediatamente dopo il trattamento con ozono o plasma, luogo e diffondere 10 microlitri di streptavidina (1 mg / ml in PBS) sui francobolli PDMS e lasciare per 1 ora in una camera umida (come parzialmente riempito piastra da 6 pozzetti, vedere il punto 1.3) . Se le tracce dovrebbero essere visibili al microscopio a fluorescenza, utilizzare streptavidina che è coniugato ad un fluorocromo come streptavidina-AlexaFluor350.
- Rimuovere streptavidina in eccesso dal timbro con carta velina e asciugare all'aria il timbro per circa 1 min. Premere leggermente il timbro sul PLL-PEG-biotina-rivestite coprioggetto di vetro.
- Se streptavidina fluorescente è stata utilizzata in 3.a2 Passo, esaminare lo schema usando sotto un microscopio a epifluorescenza. Conservare le superfici stampate in un essiccatore.
3b. Dip Pen Litografia
- Primo, miscelare 1 parte di 1 mg / ml o streptavidina Streptavidin-AlexaFluor350 con 10 parti di glicerolo (v / v) e caricare 5 microlitri della miscela sulla cantilever. Poi inizia il processo di stampa come descritto nel manuale di istruzioni dello strumento litografia dip penna. Per ridurre la dimensione del punto di circa 5 micron, regolare la velocità di stampa, il tempo di contatto del cantilever sulla distanza o superficie verticale del cantilever alla superficie. Nell'esempio illustrato in figura 2c, puntini sono stati stampati in una linea con riga e colonna di separazione impostato a 10-15 micron. Questa distanza è sufficiente per evitare punti di fusione in loro ma permette la visualizzazione di punti multipli in un unico campo di vista con impostazioni maggior microscopio.
- Conservare le superfici stampate in un essiccatore.
4. Creazione di sfumature adesivo sul streptavidina-modello Superfici
Creiamo gradienti adesive di biotina-RGD su vetrini rivestiti con streptavidina (Figura 3) o contain modelli streptavidina su vetrini passivato (Figura 5). Per creare un gradiente di superficie, è stato utilizzato un dispositivo disponibile in commercio microfluidica (chiamato sticky-Slide chemiotassi 3D Ibidi) che crea un gradiente stabile soluzione per diffusione passiva. Competere per i siti di legame streptavidina, abbiamo impiegato due opposti gradienti di biotina-RGD e biotina che non era coniugato RGD (vedi Figura 1).
- Rispettare le streptavidina rivestite coprioggetto di vetro o con motivi sul lato adesivo del appiccicoso-Slide dispositivo chemiotassi 3D. Per garantire che non vi siano perdite per diverse ore, i bordi del dispositivo sono sigillate con un sottile strato di vaselina riscaldato e con un secondo strato di una miscela di 1 parte di vaselina 1 parte di paraffina (w / w).
- Riempire il canale del dispositivo con 6 microlitri PBS nel canale. Quindi riempire i due serbatoi con 70 microlitri di 0,03 mg / pl biotina-4-fluoresceina in PBS e 70 & mu; l di 0,03 mg / pl biotina-RGD in PBS, rispettivamente. Incubare i campioni a temperatura ambiente al buio per 1 ora.
- Rimuovere la biotina soluzioni e risciacquare accuratamente la superficie mentre è ancora collegata al dispositivo microfluidico due volte con PBS. Segnare la direzione del gradiente adesivo e, se necessario, lasciare il dispositivo riempito con PBS a 4 ° C per ma assicurare che il dispositivo non si asciughi. Se necessario, analizzare il gradiente adesivo con un microscopio a fluorescenza.
5. Etichettatura di celle con fluorofori per l'imaging cellulare in diretta
Le cellule sono etichettati con coloranti fluorescenti che aiutano il monitoraggio delle cellule sotto il microscopio a fluorescenza. Sonde comuni sono marcatori fluorescenti organelli, come Syto 64 Rosso, che etichetta il nucleo cellulare. Per fare ciò, le cellule vengono prima lavati tre volte con PBS e poi incubate con 1 pM Syto 64 Rosso in terreni di coltura per 45 min ed infine lavato altre tre volte con PBS. Si prega di notare che le cellule non deve esseremantenuto in PBS per lunghi periodi di tempo.
Coloranti alternativi per il monitoraggio delle cellule sono serie CellTracker che macchia il citoplasma e vengono mantenuti durante la migrazione e la divisione cellulare. Trasfezione di cellule con proteina di fusione fluorescente è particolarmente utile per registrare la distribuzione subcellulare di una proteina di interesse durante la migrazione. Tuttavia, proteine fluorescenti tipicamente foto-bleach veloce di coloranti organici così che osservazioni a lungo termine può non essere possibile.
6. Caricamento di celle con una sfumatura solubile nel dispositivo microfluidica
- Contare fluorescente cellule marcate e divise in due provette di numero di cellule uguali. Lavare e risospendere un tubo di cellule con supporti contenenti il fattore chemiotattico, come il basso glucosio Eagle modificato da Dulbecco (DMEM) con 10% di siero bovino fetale (FBS). Lavare e risospendere l'altro tubo di cellule nei media senza il chemiotattico, cioè DMEM con 0% FBS. La concentrazione finaledi cellule in ciascun tubo deve essere di 5 x 10 5 cellule / ml.
- Rimuovere tutte le soluzioni dal dispositivo microfluidica (dal punto 4.3) e posizionarlo sul palco microscopio (vedi punto 7). Carico 70 microlitri di cellule (5 x 10 5 cellule / ml in DMEM 0% FBS) in un serbatoio e 70 microlitri di cellule HeLa (5 x 10 5 cellule / ml in DMEM 10% FBS) in un altro. Liberamente inserire un nastro sopra i serbatoi per evitare l'evaporazione. Se le cellule sulla superficie sono pre-incubato prima imaging, è opportuno che le cellule vengono caricate nel dispositivo in terreni di coltura senza il gradiente. Il dispositivo viene quindi posto sul piatto microscopio e mezzi sostituito con gradiente supporti cioè DMEM senza FBS in un serbatoio e DMEM con 10% FBS nell'altro.
7. Vivo imaging cellulare e analisi dei dati
- Accendere il microscopio (Nikon Ti-E) e riscaldare il palco, almeno 1 ora prima di avviare l'esperimento.
- Assicurarsi che il canale del micrDispositivo ofluidic è nel campo di vista e cellule sono a fuoco. Selezionare il parametro di acquisizione immagine, come i tempi di esposizione e filtri fluorescenti, sequenza di immagini del campo chiaro e fluorescenza in grado di catturare le cellule e le tracce così come i punti di tempo e la durata di registrazione (ad esempio ogni 15 minuti per 16 ore).
- Analizzare i dati con i software appropriati quali ImageJ Allineamento manuale o Ibidi chemiotassi e strumento di migrazione.
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Representative Results
Per capire come integrare i segnali di cellule migratorie 25, abbiamo sviluppato un metodo per celle di immagine con microscopia a fluorescenza che migrano in un ambiente con concorrenti gradienti adesivi e solubili (Figura 1). Tracce adesive che contenevano streptavidina fluorescente e RGD biotinilato sono stati creati con le tracce microcontatto stampati e litografia dip penna (Figura 2). Stampa microcontact successo è indicato dalla linea profilo dell'intensità di fluorescenza tra i binari dove tracce adesive e antivegetativi regioni possono essere chiaramente distinti (Figura 2b). Dots stampate con litografia dip penna appare arrotondato, non a forma di lacrima, che indica la riuscita del processo di stampa. Chimica di superficie e umidità influenza il risultato del processo di stampa. In generale, più idrofobica la superficie è, meglio i risultati di stampa.
Un gradiente di spunti adesivisulla traccia stampata sono stati creati con un semplice dispositivo microfluidica caricando biotina-4-fluoresceina e biotina-RGD, nel lato opposto di una camera di microfluidica (Figura 3). Poiché entrambe le molecole si legano competitivamente il brano streptavidina sulla superficie di vetro, un gradiente immobilizzato di ligandi RGD è generato. Dopo aver rimosso la biotina / biotina-RGD soluzione, la camera stessa può essere utilizzata per introdurre un gradiente solubile, che è stabile all'interno del canale microfluidico per almeno 16 ore (Figura 4).
Abbiamo introdotto cellule HeLa nella camera con un gradiente chemiotattico, per cui è stato utilizzato FBS. A basse densità, cellule HeLa preferenzialmente rispettate e migrare sulle piste streptavidina / RGD (cellule N = 50), evitando le antivegetative regioni PEG (cellule N = 19). La posizione delle singole celle è stato registrato in 16 ore ed analizzata con un software di monitoraggio cella. In un esperimento in cui adesivo e soluzionigradienti bili sono opposti l'uno all'altro (figura 5), le traiettorie delle singole cellule hanno mostrato che più cellule HeLa migrate verso la fonte delle chemoattractant (tracce rosse in figura 5c, tracce N = 36) che verso concentrazioni più elevate di aderente RGD (nero tracce in Figura 5c, tracce N = 14). La distanza media che le cellule migrate contro (tracce nere) o (tracce rosse) la direzione del gradiente FBS (x-componente di spostamento medio di ogni traiettoria) era 0,1700 ± 0,1172 e 0,2278 ± 0,1280, rispettivamente (p <0,0001, Student t-test), anche se non vi era alcuna differenza statisticamente significativa di cilindrata media tra le tracce nere (56,18 ± 32,27 micron) e le tracce rosse (72,86 ± 45,05 micron, P> 0.05, test t di Student). Migrazione di cellule HeLa con una velocità media di 17,47 ± 4,72 um / h in presenza sia di gradiente di adesivocue (cioè RGD) e solubile cue (FBS esempio). I dati quindi suggeriscono che le cellule HeLa, il gradiente FBS determina la direzione di migrazione delle cellule mentre mantenere una velocità intrinseca migrazione sulle tracce adesive.
Abbiamo inoltre valutato la migrazione della linea cellulare macrofagica J774. In assenza di gradienti di adesivi e solubile, queste cellule migrano a velocità molto elevate (38,55 ± 17,88 um / hr) rispetto alle cellule HeLa (16,47 ± 4,28 um / hr) ma con minore persistenza cioè cellule J774 cambio di direzione (direzionalità di 0,059 ± 0,091 ), definito come il rapporto di spostamento per rintracciare lunghezza più spesso di cellule HeLa (0,57 ± 0,12) su microcontatto tracce stampate fibronectina. Cellule J774 sono anche meno dipendente contatto di cellule HeLa. Lo spostamento di cellule J774 era più alta nelle regioni PEG (102,20 ± 54,73 micron) che su piste fibronectina (42,95 ± 39,90 micron). Inoltre, cellule J774 unappeared di adattarsi alla chimica di superficie diverso, modificando il loro meccanismo di migrazione da mesenchimale a ameboide. In conclusione, segnali adesivi non sono importanti per cellule J774 come sono per cellule HeLa. Entrambi i tipi di cellule migrate preferenzialmente verso la direzione della stecca solubile.
Figura 1. Schematica del processo di fabbricazione di una configurazione microfluidico che permette l'imaging di cellule migranti rispondere a gradienti opposti spunti adesive rispetto solubile. Un. Vetrini sono passivato biotinilato PLL-PEG. B. Modelli adesivo contenente streptavidina fluorescente sono stampati sul biotinilato superficie sia come linee utilizzando la stampa microcontatto (b) o punti tramite dip litografia penna (b '). c. D. Cells e un gradiente chemiotattico solubile del 0-10% FBS vengono caricati nel dispositivo microfluidico. Dopo cellule aderiscono alla superficie, vivono migrazione cellulare su gradienti RGD su binari streptavidina e in presenza di FBS gradienti può essere ripreso nel canale che collega i due serbatoi.
Figura 2. Modelli cellulari adesivi (linee e punti) può essere prodotto con due diverse tecniche di stampa un'immagine fluorescente di microcontact stampato streptavidina-AlexaFluor350 brani (Abs: 346 nm, Em: 442 nm; grigio).. Il PLL-PEG rivestite coprioggetto. La maschera di stampa microcontract è stato progettato come linee che erano 100 micron di larghezza con 290 micron di centro-to-center spazio. b. L'intensità media di fluorescenza microcontact stampato tracce streptavidina, come indicato in A, da cinque superfici separate le sezioni da cima a fondo. La larghezza media della pista è di 90 ± 6 micron e la media da centro a centro di distanza è di 293 ± 2 pm. C. Un'immagine campo chiaro di streptavidina contenenti punti generati con litografia dip penna. I diametri dei puntini variava 6-9 micron con 15 micron da centro a centro di spazio. Barre di scala e in un c sono 100 pm.
Figura 3. Biotina-4-fluoresceina gradiente (0 mg / pl - 0,03 mg / mL). Su una superficie di vetro uniformemente rivestite con streptavidina biotina-4-fluoresceina e biotina-RGD sono stati caricati in uno dei serbatoi del dispositivo microfluidica (sticky-Slide chemiotassi 3D , Ibidi) che sonocollegati da un canale 1 mm. Dopo una incubazione di 1 ora, il dispositivo è stato lavato con PBS e riempito con PBS. Un. Mosaico 60 immagini sono state prese con una lunghezza totale immagine 3072 um b ed è stata misurata l'intensità di fluorescenza in tutta la lunghezza del intero mosaico. Linee di tendenza lineari sono montati l'intensità di fluorescenza per indicare la pendenza RGD nel canale.
Figura 4. L'intensità di fluorescenza di un gradiente di fluoresceina (0 - 1 pM pM) in un canale microfluidico subito dopo la configurazione (T = 0 ore) e b dopo una incubazione 16 hr PBS senza e con 1 pM fluoresceina è stato caricato da sinistra e destra. serbatoio del dispositivo microfluidica (sticky-Slide chemiotassi 3D, Ibidi), rispettivamente. Il canale microfluidico è di 1 mm esi trova in posizione da 50 a 1050 micron. Il gradiente è stabile per almeno 16 ore.
Figura 5. HeLa migrazione cellulare in una camera microfluidica (sticky-Slide chemiotassi 3D, Ibidi) con pendenza opposta adesivo (RGD immobilizzato su binari streptavidina) e gradiente solubile (0-10% FBS). Un. Un'immagine rappresentativa di cellule in una camera con microfluidica opposti gradienti. Barra di scala è di 50 micron. B time-lapse immagini di una cella prese con un microscopio a epifluorescenza (Nikon Ti-E). Le immagini sono state prese a intervalli di 15 min per 20 ore e la traiettoria delle cellule (linea blu) ottenuta mediante il posizionamento di cellule centroide (ImageJ plugin di tracciamento manuale). Barra di scala è di 50 micron. C. Cellule traiettoria da immagini come indicato in b. Cella trajectories che migrarono verso la più alta concentrazione di FBS solubile sono mostrati in rosso (traccia n = 36); traiettorie delle cellule che la migrazione verso concentrazioni più elevate di RGD aderenti sono mostrati in nero (tracce n = 14). Clicca qui per ingrandire la figura .
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Discussion
In questo protocollo, abbiamo utilizzato un dispositivo disponibile in commercio microfluidica (sticky-Slide chemiotassi 3D Ibidi) per studiare gli effetti delle superfici chimicamente modificati e le sfumature chemoattractant sulla migrazione delle cellule. Questa configurazione microfluidica non richiede un flusso perché il gradiente è stabilito per diffusione lungo la lunghezza del canale. Questo è importante perché il flusso differenziale potrebbe influenzare le cellule migrano lentamente come i fibroblasti che formano stabili adesioni focali e veloci come la maggior parte delle cellule che migrano leucociti che formano piccoli complessi focali e sinapsi 26. Tensione tangenziale di flusso laminare può incidere sulla stabilità della adesione cellulare ai segnali adesivi e chemiotassi di cellule verso spunti solubili 27,28. Abbiamo trovato differenze di comportamento di migrazione tra lenti cellule HeLa in movimento e in rapida evoluzione J774 cellule mostrando così che l'installazione microfluidica è applicabile per entrambi i tipi di cellule aderenti e meno aderente. Tali confronti anche revealed differenza interessante tra i tipi di cellule in risposta di adesione e la migrazione di modelli di superficie che conteneva entrambi i segnali adesivi (peptidi RGD o fibronectina) e anti-fouling regioni (aree PEG).
Modelli di superficie sono stati creati con la stampa microcontatto 29 e dip-pen litografia 30,31. Stampa microcontact è un semplice e relativamente veloce, processo di patterning riproducibile. Tuttavia, la progettazione e la fabbricazione dello stampo PDMS, che viene ottenuta mediante fotolitografia, è più complessa e richiede tempo. Introduce anche i suoi limiti che le caratteristiche di piccole dimensioni (<5 um) sono difficili da ottenere e dipendono dal rapporto di aspetto del modello. In breve, la stampa microcontatto è ideale per i modelli grandi fino a centinaia di micron e in esperimenti, in cui gli stessi schemi devono creare molte volte. D'altra parte, litografia dip pin può essere usato per generare micron a modelli nanoscala. È più adatto per punti di stampadi linee, linee, anche se possono essere realizzati. Dip litografia pin consente una maggiore libertà nel design pattern, in quanto non vi è alcuna necessità di pre-fabbricati maschere, maestri o timbri. Tuttavia, la velocità del processo di patterning è lento, rendendo la stampa di grandi aree ingombranti e accesso a uno strumento specializzato è cruciale. I due metodi di patterning sono degni di considerazione perché la dimensione e la forma del pattern cue adesive influenzare l'organizzazione e distribuzione di macchinari biomeccaniche che regolano la migrazione cellulare 32,33. Inoltre, la limitazione del dispositivo microfluidico commerciale utilizzato qui è che la lunghezza del canale (1 micron) non può essere alterato e quindi non si può controllare la pendenza massima dei gradienti adesivi e solubile. Se pendenze più ripide sono necessarie, sarebbe necessario per fabbricare un dispositivo microfluidico con un canale più breve tra i due serbatoi. Uno dei principali vantaggi del protocollo qui descritto è la struttura modulare in modo che do diversorfaces, chimiche superficiali, approcci patterning e dispositivi microfluidici possono essere combinati per una vasta gamma di esperimenti dal vivo imaging cellulare.
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Disclosures
Noi non abbiamo interessi commerciali da dichiarare.
Acknowledgments
Gli autori riconoscono il finanziamento della Australian Research Council e National Health and Medical Research Council of Australia e anche ringraziare la Australian National impianto di produzione per il SU-8 master per la stampa microcontatto. SHN è sostenuta dal Ministero dell'Istruzione Superiore e Malesia Universiti Sains Malaysia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Coverglass staining outfits | Thomas Scientific | 8542 E40 | Coverslip rack |
| Oven | Binder | ED 53 series | |
| Silicon wafer | Silicon Quest | 708-007 | Boron doped <100> wafer, 4" diameter, 500 μm, single side polished |
| GM1070 SU-8 photoresist | Gersteltec Sarl | ||
| SU-8 developer | Gersteltec Sarl | ||
| Sylgard 184 curing agent | Dow Corning | ||
| Sylgard 184 elastomer prepolymer | Dow Corning | ||
| PLL-PEG-biotin (20%) | SuSos AG | PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)/PEG(3.4)-Biotin (20%) | 1 mg/ml in PBS |
| Fluorescein | Sigma | 46955 | 1 mM in PBS |
| Streptavidin-AlexaFluor350 | Invitrogen | S-11249 | 1 mg/ml in PBS |
| Biotin-4-fluorescein | Invitrogen | B-1370 | 0.03 μg/μl in PBS |
| Biotin-RGD | GenScript | SC1208 | 0.03 mg/ml in PBS |
| Syto 64 Red | Invitrogen | S-11346 | 1 μM in PBS |
| Sticky slide chemotaxis 3D | Ibidi | 80328 | |
| 200 μl Greiner yellow bevelled tip | Greiner Bio-One | 739261 | |
| Vaseline | Sigma | 16415 | |
| Paraffin wax, mp 55-57 °C | Sigma | 327204 | |
| Nano eNabler 10 μm cantilever | BioForce | SPT-S-C-10s | |
| Image J software | National Institute of Health | rsbweb.nih.gov/ij/download.html | |
| Manual Tracking plugin | Fabrice Cordelières | rsb.info.nih.gov/ij/plugins/track/track.html | |
| Chemotaxis and Migration Tool | Ibidi GmbH | www.ibidi.com/applications/ap_chemotaxis.html |
References
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