Summary
Um método para a montagem de gradientes de adesivo e solúvel em uma câmara de microscopia para estudos de migração de células vivas é descrito. O ambiente artificial combina superfícies antivegetativas e faixas adesivas com gradientes de solução e, portanto, permite que se determine a importância relativa das pistas de orientação.
Abstract
As células podem detectar e migram para as concentrações mais elevadas de pistas adesivas, tais como as glicoproteínas da matriz extracelular e as pistas solúveis, tais como factores de crescimento. Aqui, descrevem um método para criar gradientes opostos de pistas adesivas e solúvel em uma câmara de microfluidos, que é compatível com imagens de células vivas. Um copolímero de ácido poli-L-lisina e o polietileno glicol (PEG-PLL) é empregada para passivar lamelas de vidro e prevenir a adsorção não especifica de biomoléculas e células. Microcontact impressão seguinte, ou litografia dip caneta são usados para criar as faixas de estreptavidina nas superfícies passivadas para servir como pontos de fixação para o péptido biotinilado arginina-glicina-ácido aspártico (RGD) como a pista adesiva. Um dispositivo de microfluidos é colocada sobre a superfície modificada e usados para criar o gradiente de pistas adesivas (100% RGD a RGD 0%) nas faixas de estreptavidina. Finalmente, o mesmo dispositivo de microfluidos é usado para criar um gradiente de uma suc chemoattractanth como soro fetal bovino (FBS), como o cue solúvel na direcção oposta do gradiente de pistas adesivas.
Introduction
Migração dirigida de células é uma propriedade fundamental de muitas células e é um aspecto-chave de muitos processos fisiológicos normais, incluindo o desenvolvimento embrionário, a defesa contra a infecção e cicatrização de feridas. Além disso, a migração de células também desempenha um papel importante em várias doenças tais como a doença vascular, metástase de células tumorais e de 1,2 a inflamação crónica. Embora os estados clássicos da migração das células - polarização, extensão saliência, a formação de aderência, a geração de forças de retracção e de trás - são geralmente aceites 3,4, a elucidação dos mecanismos de espaço-temporais, que por integração do sinal é coordenado tem sido mais difícil.
A matriz extracelular (ECM), que serve como um substrato para a adesão celular, e através de química inerente 5 e 6 diversidade física, fornece indicações direccionais para navegação célula 7,8. Além destas pistas adesivas 9, factores solúveis 10-12 </ Sup>, como quimiocinas e fatores de crescimento pode induzir a migração de células por meio de receptores dirigido quimioatratantes e sua sinalização a jusante motogenic. Actualmente, não se sabe se o acoplamento e a sinalização através de receptores de adesão (integrinas, por exemplo) ou de receptores quimiotáticas, tais como receptor da tirosina quinase (RTK), são dominantes. Também não é conhecido se as hierarquias de sistemas receptores são específicos do tipo de célula.
Microscopia de células vivas dá uma riqueza de informações que não é acessível em ensaios a granel e pode ser combinado com dispositivos microfluídicos para gerar gradientes de imobilizados pistas 13,14 e solúvel 15 16. O método descrito aqui utiliza uma série de passos simples e bem estabelecida para a modificação de superfície em conjunto com uma câmara comercialmente disponível microfluídico para criar uma imagem de ensaio para a migração de células que podem ser facilmente implementados em um laboratório de biologia das células (Figura 1). O montadodispositivo micro tem qualidades ópticas que são comparáveis aos do vidro 17 e os gradientes de moléculas difusíveis são estáveis durante pelo menos 16 horas. O sistema pode ser usado para as técnicas de microscopia de epifluorescência e avançado. Ao contrário de outras configurações de quimiotaxia 18, este sistema é adequado para a gravação lentamente migram, as células aderentes. É importante notar que o sistema é modular e facilmente permite a introdução de adesivo alternativa ou pistas de migração solúveis e análise de vários tipos de células.
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Protocol
1. Passivação de lamínulas com PLL-PEG-biotina
Este passo é projetado para passivar a superfície para que as células aderem e migram para regiões específicas na lamela de vidro que são criados com a impressão microcontract (Passo 2-3a) ou mergulho litografia caneta (Passo 3b). Para a passivação, um co-polímero de poli-L-lisina (PLL) e polietileno glicol (PEG) é usado em que 20% das moléculas de PEG são enxertados com biotina (PLL-PEG-biotina).
- Para limpar lamelas de vidro (18 mm x 18 mm), submergindo-os em uma cremalheira em etanol a 100% e colocar o suporte de um banho de sonicação durante 30 min. Secam-se as lamelas de vidro em ar ou sob uma corrente de azoto.
- Em seguida, sonicar as lamelas de vidro durante 30 min em 1 M NaOH. Depois enxaguar as superfícies de vidro por imersão cuidadosamente o suporte em um recipiente cheio com 1,5 L Milli-Q H 2 O. Repetir o processo de lavagem três vezes com água Milli-Q fresco H 2 O a cada vez. Secam-se as lamelas de vidro emnum forno a 60 ° C.
- Coloque metade o vidro limpo Lamelas individualmente numa câmara húmida, a qual é feita de uma placa de 24 cavidades parcialmente cheio com H 2 O. Gota 15 ul de PEG-PLL-biotina (1 mg / ml) em PBS em cada lamela de vidro. Levar a outra metade dos restantes lamelas de vidro limpo e cuidadosamente sanduíche a solução PEG. Deixar as lamelas durante 1 hora na câmara húmida. Deslize suavemente as lamelas ensanduichada longe um do outro sem raspar a superfície de PEG-revestido e lavá-los com água Milli-Q H 2 O. A água deve deslizar facilmente sobre o lado PEG-tratada. Se necessário, o ar de secagem as lamelas de vidro sobre uma toalha de papel com a superfície tratada para cima. Armazenar as lamelas de vidro num exsicador de vácuo até à sua utilização.
2. Fabricação de carimbos para impressão microcontact
Descrevemos dois processos para faixas estreptavidina padrão para as lamínulas passivadas. O primeiro, microcontact impressão, tipicamente requer a fabricação de um mestre de silício a partir do qual um carimbo de PDMS é moldado. No nosso caso, o padrão sobre o selo PDMS são 100 mm de largura, as linhas que estão espaçados 290 uM de centro-a-centro, com uma altura característica de 25 um. Abaixo, descrevemos resumidamente como fabricar um mestre silício adequado (Passo 2,1-2,3) e PDMS selo (Passo 2.4). No entanto, existem vários protocolos para a impressão microcontact descritos na literatura 19-23, que são adequados para a impressão de padrões de proteínas sobre lamelas de vidro. Mestres também podem ser feitas sob encomenda e adquirido a partir de fontes comerciais.
- Em primeiro lugar, limpar a bolacha de silício (4 "de diâmetro) através da incubação em solução piranha (3:1 v: v de ácido sulfúrico e peróxido de hidrogénio a 30%). Durante 20 minutos Lavar cuidadosamente a bolacha 10 vezes com H 2 O. MilliQ Seca-se a bolacha em um forno a 150 ° CO / N.
- Enxaguar a bolacha de silício limpo e seco com acetona a 100%, seguido de 100% de álcool isopropílico. Próximospin-coat-2 ml de GM1070 SU-8 fotoresistente (Gersteltec Sarl) sobre a bolacha em 3100 rpm durante 40 segundos para criar uma camada de 25 ^ M de espessura. A amostra é depois cozido numa placa quente a 65 ° C durante 5 minutos seguido por mais 5 min a 95 ° C.
- Expor o material fotoresistivo SU-8 à luz UV durante 60 segundos sob uma fotomáscara com o padrão desejado (por exemplo, usando uma máscara alinhador Quintel Q6000) e repetir o processo de cozimento descrever em 2.2. Em seguida, a amostra é desenvolvido por imersão da bolacha em SU-8 revelador (Gersteltec Sarl) durante 4 minutos, lavadas em 100% de álcool isopropílico e secou-se sob um fluxo de azoto. A área do fotorresiste SU-8, que não foi exposta à luz UV é assim removido, criando o padrão inverso do carimbo de PDMS.
- O próximo passo é para lançar um selo PDMS do mestre de silício. Em primeiro lugar, misturar 1 parte (w / w) do agente de cura com 10 partes de pré-polímero de elastómero (Sylgard 184). Para remover quaisquer bolhas de ar, desgaseifica-se a mistura num exsicador ligado a uma linha de vácuodurante 1 h. Em seguida, despejar o elastómero PDMS sobre o mestre de silicone dentro de uma placa de Petri com cerca de 1 cm de altura e curar a mistura principal e PDMS, em um forno a 70 ° C durante 1 h. Finalmente, o selo PDMS é removido do mestre de silício e cortadas à medida.
3. Estreptavidina padronização ou Cues adesivas em lamínulas PASSIVATED
Depois de passivação lamínulas, padrões de proteínas são impressos com impressão microcontact (3a Etapa) ou dip-pen litografia (Passo 3b). No nosso caso, a estreptavidina é impresso como linhas, que formam a base para gradientes de RGD (Passo 4). O mesmo procedimento pode também ser utilizado para a impressão de proteínas da matriz para criar padrões de adesivo.
Um método alternativo para a impressão microcontact para a modelação de biomoléculas sobre superfícies é dip litografia caneta. Na litografia dip caneta, um cantilever é usado para transferir um pequeno volume de solução sobre a superfície. O tamanho das consolas, viscosidade da solução, o tempo de contacto do cantilever sobre a superfície, a hidrofobicidade da superfície, e a humidade na câmara de impressão determinar o tamanho dos elementos impressos. A vantagem deste método é que os padrões diferentes podem ser impressos, para cada experiência, como não há necessidade de fabricar mestres e selos. A desvantagem é que demora mais tempo para imprimir um determinado padrão e que a litografia de imersão pena requer um instrumento especializado que pode não estar disponível em muitos laboratórios. O mergulho instrumento litografia caneta que usamos foi o NanoeNabler de Bioforce Nanociência. Aqui, é impresso pequenos pontos que eram <10 um de diâmetro, para o qual foi utilizado Spt10 consolas.
3a. Microcontact Técnica de impressão (μCP)
- Para limpar e fazer o selo PDMS mais hidrofílica, o tratamento do lado modelado dos selos PDMS numa UV e ozono (por exemplo, a partir de Procleaner Ozone UV Bioforce Nanociência) durante 1,5 h. Em alternativa, utilizar um plasmaproduto de limpeza para um tempo mais curto para o mesmo fim. Este processo cria uma superfície oxidada PDMS 24, o que melhora o processo de impressão.
- Imediatamente após o tratamento com ozono ou plasma, o lugar e espalhar 10 uL de estreptavidina (1 mg / ml em PBS) para os carimbos de PDMS e deixar durante 1 hora numa câmara húmida (tal como um parcialmente cheio placa de 6 poços, ver Passo 1.3) . Se as faixas devem ser visíveis ao microscópio de fluorescência, utilizar estreptavidina que é conjugado com um fluoróforo tal como estreptavidina-AlexaFluor350.
- Remover o excesso de estreptavidina o selo com papel de seda e secar o selo durante aproximadamente 1 min. Pressionar ligeiramente o selo para a lamela de vidro PLL-PEG-biotina-revestido.
- Se fluorescente estreptavidina foi usado em 3.a2 etapa, examine o padrão utilizando sob um microscópio de epifluorescência. Armazenar as superfícies impressas em um dessecador.
3b. Dip litografia da pena
- Em primeiro lugar, misturar 1 parte de 1 mg / ml de estreptavidina ou streptavidin-AlexaFluor350 com 10 partes de glicerol (v / v) e 5 ul de carregar a mistura para o cantilever. Em seguida, começa o processo de impressão, tal como descrito no manual de instruções do instrumento de litografia dip caneta. Para reduzir o tamanho da mancha de cerca de 5 um, ajustar a velocidade de impressão, o tempo de contacto do cantilever com a distância da superfície ou vertical do cantilever para a superfície. No exemplo mostrado na Figura 2c, os pontos foram impressos numa linha com linha e coluna de separação definida para 10-15 ^ m. Esta distância é suficiente para impedir que os pontos de fusão em si, mas permite a visualização de pontos múltiplos num único campo de visão do microscópio, com a maioria das configurações.
- Armazenar as superfícies impressas em um dessecador.
4. Criando Gradientes adesivo na Estreptavidina padrão-Superfícies
Nós criar gradientes adesivas de biotina-RGD em lamelas de vidro que são revestidas com estreptavidina (Figura 3) ou copadrões ntain estreptavidina sobre lamelas de vidro passivado (Figura 5). Para criar um gradiente de superfície, foi utilizado um dispositivo comercialmente disponível de microfluidos (chamado pegajoso Slide-A quimiotaxia de Ibidi 3D) que cria um gradiente de solução estável por difusão passiva. Para competir por sítios de ligação de estreptavidina, foram empregados dois gradientes opostos de biotina-RGD e biotina que não foi conjugada com RGD (ver Figura 1).
- Respeite as lamelas de vidro revestidas com estreptavidina ou com estampas para o lado adesivo do dispositivo Quimiotaxia Slide-pegajoso 3D. Para assegurar que não haja qualquer perda durante várias horas, as extremidades do dispositivo são selados com uma camada fina de vaselina aquecido e com uma segunda camada de uma mistura de 1 parte de vaselina para 1 parte de cera de parafina (w / w).
- Encher o canal do dispositivo com 6 ul de PBS no canal. Em seguida, encher os dois reservatórios com 70 ul de 0,03 ug / uL biotina-4-fluoresceína em PBS e 70 & mu, l de 0,03 ug / uL biotina-RGD em PBS, respectivamente. Incubar as amostras à temperatura ambiente no escuro durante 1 hora.
- Remover a solução de biotina e lavar cuidadosamente a superfície, enquanto ainda está ligado ao dispositivo de microfluidos por duas vezes com PBS. Marcar o sentido do gradiente de adesivo e, se necessário, o dispositivo de armazenamento cheio com PBS a 4 ° C para assegurar que, mas o dispositivo não seque. Se necessário, analisam o gradiente de adesivo com um microscópio fluorescente.
5. Rotulagem de células com fluoróforos para imagens de células vivas
As células são marcadas com corantes fluorescentes que auxiliam rastreamento de células sob um microscópio fluorescente. Sondas comuns são marcadores fluorescentes organelas, tais Syto 64 Vermelha, que rotula o núcleo da célula. Para fazer isso, as células são em primeiro lugar lavou-se três vezes com PBS, depois incubadas com 1 uM Syto Red 64 em meios de cultura durante 45 min e, finalmente, lavada mais três vezes com PBS. Por favor, note que as células não deve sermantidas em PBS por períodos de tempo longos.
Corantes alternativos para rastreamento de celular são séries CellTracker que manchar o citoplasma e são mantidas durante a migração e divisão celular. A transfecção de células com a proteína de fusão fluorescente é particularmente útil para registar a distribuição subcelular de uma proteína de interesse, durante a migração. No entanto, as proteínas fluorescentes tipicamente foto-branqueamento mais rápidos do que os corantes orgânicos de modo que as observações a longo prazo pode não ser possível.
6. Carregamento de células com um Gradiente solúvel no dispositivo Microf
- Contar células marcadas por fluorescência e dividida em dois tubos de números de células iguais. Lavar e ressuspender um tubo de células com meio contendo a chemoattractant, tais como a modificação de Dulbecco, glicose baixa Eagle Médium (DMEM) com 10% de soro fetal bovino (FBS). Lavar e ressuspender o outro tubo de células em meio sem o quimioatractor, isto é DMEM com 0% de FBS. A concentração finalde células de cada tubo deve ser de 5 x 10 5 células / ml.
- Remova todas as soluções do dispositivo micro (do passo 4.3) e colocá-lo no palco microscópio (veja Passo 7). Carregar 70 uL de células (5 x 10 5 células / ml em DMEM FBS 0%) em um reservatório e de 70 ul de células HeLa (5 x 10 5 células / ml em DMEM 10% FBS) no outro. Frouxamente colocar uma fita sobre os reservatórios, para evitar evaporação. Se as células na superfície são pré-incubados antes da imagiologia, é aconselhável que as células são carregadas no dispositivo de meio de crescimento sem o gradiente. O dispositivo é então colocado sobre a platina do microscópio e os meios de comunicação substituído com gradiente meios ie DMEM sem FBS em um reservatório e DMEM com FBS a 10% na outra.
7. Viver imagens de células e Análise de Dados
- Ligue o microscópio (Nikon Ti-E) e aquecer a fase de pelo menos 1 hora antes de começar a experiência.
- Certifique-se de que o canal do microfluidic dispositivo está no campo de visão e as células estão no foco. Selecione o parâmetro de aquisição de imagem, tais como o tempo de exposição e filtros fluorescentes, seqüência de imagem de campo claro e fluorescência que captura células e faixas, bem como pontos de tempo e tempo de gravação (por exemplo, a cada 15 minutos para 16 horas).
- Analisar os dados com softwares apropriados, como ImageJ manual de Rastreamento ou Quimiotaxia Ibidi e ferramenta de migração.
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Representative Results
Para compreender como a célula de integrar os sinais migratórios 25, foi desenvolvido um método para células de imagem com a microscopia de fluorescência, que migram em um ambiente com concorrentes gradientes adesivas e solúvel (Figura 1). Faixas adesivas que continham estreptavidina fluorescente e RGD biotinilado foram criados com faixas microcontact impressos e mergulho litografia caneta (Figura 2). Impressão microcontact sucesso é indicado pela linha de perfil de intensidade de fluorescência através das vias em que as faixas adesivas e anti-incrustantes regiões podem ser claramente distinguidos (Figura 2b). Pontos impressos com mergulho litografia caneta aparecer arredondado, não rasgar forma, indicando um processo de impressão de sucesso. Química de superfície e humidade influencia o resultado do processo de impressão. De um modo geral, o mais hidrofóbico da superfície é, melhores são os resultados de impressão.
Um gradiente de pistas adesivasna pista impresso foram criadas com um dispositivo de microfluidos simples através do carregamento de biotina-4-fluoresceína e biotina-RGD para o lado oposto da câmara de microfluidos (Figura 3). Uma vez que ambas as moléculas se ligam competitivamente a faixa estreptavidina sobre a superfície de vidro, um gradiente de ligandos RGD imobilizado é gerado. Após a remoção da solução de biotina / biotina-RGD, a mesma câmara pode ser utilizada para introduzir um gradiente solúvel, que é estável dentro de um canal microfluídico durante pelo menos 16 horas (Figura 4).
Introduzimos células HeLa para a câmara com um gradiente chemoattractant, para o qual foi utilizado FBS. Em densidades baixas, células HeLa, preferencialmente adere a e migraram nas faixas de estreptavidina / RGD (células de N = 50) e evitar as regiões antivegetativos PEG (células de N = 19). A posição das células individuais foi registada ao longo de 16 horas e analisadas com um software de controle da pilha. Numa experiência onde adesiva e soluble gradientes são opostas uma à outra (figura 5), as trajectórias das células individuais mostraram que as células HeLa mais migrou para a fonte dos quimiotáticas (traços vermelhos na Figura 5c, N vestígios = 36) do que para concentrações mais elevadas de RGD (aderente preto traços na Figura 5c, N = 14) vestígios. A distância média que as células migraram contra (traços pretos) ou na (traços vermelhos) no sentido do gradiente de FBS (x-componente de deslocamento médio de cada trajectória) foi 0,1700 ± 0,1172 e 0,2278 ± 0,1280, respectivamente (P <0,0001, Student t-teste), embora não houve diferença estatisticamente significativa na média de deslocamento entre os traços pretos (56,18 ± 32,27 mm) e os traços vermelhos (72,86 ± 45,05 | im; P> 0,05, teste t de Student). As células HeLa migram com uma velocidade média de 17,47 ± 4,72 um / h, na presença de tanto do gradiente de adesivocue (ie RGD) e solúvel em cue (ie FBS). Os dados sugerem, portanto, que, para as células HeLa, o gradiente de FBS determina a direcção da migração das células, enquanto mantêm uma velocidade de migração intrínseco sobre as faixas adesivas.
Temos também avaliada a migração da linha celular de macrófagos J774. Na ausência de gradientes de adesivo e solúvel, estas células migram a velocidades muito mais altas (38,55 ± 17,88 | iM / h) do que as células HeLa (16,47 ± 4,28 um / h), mas com menos persistência J774 ie células mudam de direcção (direccionalidade de 0,059 ± 0,091 ), medida como a proporção de deslocamento para rastrear comprimento mais frequentemente do que as células HeLa (0,57 ± 0,12) em microcontact impressos faixas fibronectina. Células J774 também são menos dependentes de contacto do que as células HeLa. O deslocamento de células J774 foi maior nas regiões de PEG (102,20 ± 54,73 mm) do que em faixas de fibronectina (42,95 ± 39,90 mm). Além disso, células J774 umppeared de se adaptar a química de superfície diferente alterando seu mecanismo de migração de mesenquimal para amebóide. Em conclusão, pistas adesivas não são tão importantes para células J774 como eles são para as células HeLa. Ambos os tipos de células, preferencialmente, migraram para a direcção do cue solúvel.
Figura 1. Esquemática do processo de fabricação de uma configuração que permite que o microfluídico imagiologia de células que migram para responder gradientes opostos de pistas adesivas contra solúvel. Uma. Lamelas de vidro são passivado com biotinilado PLL-PEG. B. Padrões adesivas contendo estreptavidina fluorescente são impresso sobre a biotinilado superfície ou como linhas usando impressão microcontact (b) ou pontos, utilizando litografia de imersão caneta (b '). c. D. Células e um gradiente chemoattractant solúvel de 0-10% de FBS são carregados para dentro do dispositivo de microfluidos. Após as células aderem à superfície, viver a migração de células sobre gradientes de RGD em pistas de estreptavidina e na presença de FBS gradientes podem ser visualizados no canal que liga os dois reservatórios.
Figura 2. Padrões de células adesivas (linhas e pontos) pode ser produzido com duas diferentes técnicas de impressão de uma imagem fluorescente de microcontact impresso estreptavidina-AlexaFluor350 faixas (Abs: 346 nm, Em: 442 nm; cinza).. Em lamelas PLL-PEG revestidos de vidro. O revestimento de impressão microcontract foi concebido como linhas que eram 100 mm de largura, com 290 uM de centro-a-center espaço. b. A intensidade média de fluorescência de microcontact impresso faixas de estreptavidina, como mostrado em A, a partir de cinco superfícies separadas como cortes de cima para baixo. A largura média da faixa é de 90 ± 6 ^ m e o espaçamento centro a centro médio é de 293 ± 2 um. C. A imagem de campo claro de estreptavidina contendo pontos gerados com dip litografia caneta. Os diâmetros dos pontos variaram 6-9 com 15 uM espaço de centro a centro jim. Barras de escala em um e c são 100 mm.
Figura 3. Biotin-4-f luoresceina gradiente (0 ug / uL - 0,03 ug / uL). Em uma superfície de vidro uniformemente revestidas com estreptavidina biotina-4-fluoresceína e biotina-RGD foram carregados em qualquer um reservatório do dispositivo de microfluidos (Slide-pegajoso Chemotaxis 3D , Ibidi) que sãoligadas por um canal de 1 mm de comprimento. Após uma incubação de 1 h, o dispositivo foi lavado com PBS e novamente cheio com PBS. Uma. 60 imagens de mosaico foram tiradas com um comprimento total de imagem 3072 um e b a intensidade de fluorescência foi medida através do comprimento inteiro do mosaico. Linhas de tendência linear foram ajustados para a intensidade de fluorescência para indicar a inclinação RGD no canal.
Figura 4. A intensidade de fluorescência de fluoresceína de um gradiente de (0 uM - 1 uM) no canal microfluídico uma imediatamente após a configuração (T = 0 horas) e b após uma incubação de 16 h com PBS e sem 1 ^ M de fluoresceína foi carregado a partir da esquerda e da direita. reservatório do dispositivo de microfluidos (pegajoso Slide-Chemotaxis 3D, Ibidi), respectivamente. O canal microfluídico é de 1 mm de comprimento ese encontra na posição 50 a 1050 | im. O gradiente foi estável durante pelo menos 16 horas.
Figura 5. Migração de células HeLa numa câmara de microfluidos (pegajoso-Slide Chemotaxis 3D, Ibidi) com gradiente opostas adesiva (RGD imobilizado em pistas estreptavidina) e gradiente solúvel (0-10% de FBS). Uma. Uma imagem representativa de células em uma câmara com microfluidics opondo gradientes. Barra de escala é de 50 m. B lapso de tempo imagens de uma célula tirada com um microscópio de epifluorescência (Nikon Ti-E). Imagens foram feitas em intervalos de 15 minutos para 20 horas e trajetória de células (linha azul), obtida através do posicionamento da célula centróide (ImageJ plugin de rastreamento manual). Barra de escala é de 50 m. C trajetória. Celular a partir de imagens, como mostrado na b. Célula trajectories que migraram para a maior concentração de FBS solúvel são mostrados em vermelho (traços N = 36); trajetórias de células que migraram para concentrações mais elevadas de RGD aderente são mostradas em preto (traços n = 14). Clique aqui para ver maior figura .
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Discussion
Neste protocolo, foi utilizado um dispositivo disponível comercialmente microfluídicos (sticky Slide-Quimiotaxia 3D a partir de Ibidi) para estudar os efeitos de superfícies quimicamente modificados e gradientes quimioatratantes sobre a migração celular. Esta instalação não requer microfluídico porque o gradiente de fluxo é estabelecido por difusão ao longo do comprimento do canal. Isto é importante porque o fluxo poderia afectar diferencialmente células migram lentamente, tais como fibroblastos, que formam estáveis adesões focais e rápidas células que migram, como a maioria dos leucócitos que formam pequenos complexos focais e sinapses 26. Tensão de cisalhamento a partir de um fluxo laminar pode afectar a estabilidade da adesão celular a estímulos adesivas e quimiotaxia de células em relação pistas solúveis 27,28. Encontramos diferenças no comportamento de migração entre lentas células HeLa e móveis em movimento rápido J774 células mostrando assim que a configuração de microfluídica é aplicável para ambos os tipos de células aderentes e menos aderente. Tais comparações também revealed diferença interessante entre os tipos de células de adesão e migração de respostas aos padrões de superfície que continham ambas as pistas adesivas (peptídeos RGD ou fibronectina) e anti-incrustantes regiões (domínios de PEG).
Padrões de superfície foram criados com impressão microcontact 29 e dip-pen litografia 30,31. Impressão microcontact é um simples e relativamente rápido, processo de padronização reprodutível. No entanto, a concepção e fabrico do selo PDMS, o que é conseguido por fotolitografia, é mais complicado e demorado. Além disso, introduz as suas próprias limitações, em que as características pequenas (<5 mm) são difíceis de conseguir e dependem da relação de aspecto do padrão. Em resumo, a impressão microcontact é ideal para os padrões grandes até centenas de micron de tamanho e em experimentos, onde os mesmos padrões necessários para criar muitas vezes. Por outro lado, dip litografia pino pode ser usado para gerar os padrões nanométricos micron. É mais adequado para os pontos de impressãoque as linhas, as linhas, embora possa ser fabricada. Dip litografia pino proporciona maior liberdade nos projetos padrão, já que não há necessidade de pré-fabricados máscaras, mestres ou selos. No entanto, a velocidade do processo de padronização é lenta, tornando a impressão de grandes áreas pesados e acesso a um instrumento especial é crucial. Os dois métodos de modelação são relevantes para a consideração porque o tamanho ea forma dos padrões de sinalização adesivas influenciar a organização e distribuição de máquinas biomecânicos que regulam a migração celular 32,33. Além disso, a limitação do dispositivo comercial microfluídico empregue aqui, é que o comprimento do canal (1 uM) não pode ser alterado e portanto não se pode controlar a inclinação máxima dos gradientes de adesivo e solúvel. Se gradientes mais íngremes são necessárias, seria necessário para o fabrico de um dispositivo de microfluidos com um curto canal entre os dois reservatórios. Uma das principais vantagens do protocolo descrito aqui é o design modular para que su diferenterfaces, químicas superficiais, abordagens de modelação e dispositivos microfluidicos podem ser combinados para uma grande variedade de experiências de imagem de células vivas.
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Disclosures
Nós não temos interesses comerciais para divulgar.
Acknowledgments
Os autores reconhecem o financiamento do Australian Research Council e National Health and Medical Research Council da Austrália, e também gostaria de agradecer a Australian instalação de fabricação nacional para o SU-8 mestre para a impressão microcontact. SHN é apoiado pelo Ministério do Ensino Superior Malásia e Sains Universiti Malaysia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Coverglass staining outfits | Thomas Scientific | 8542 E40 | Coverslip rack |
| Oven | Binder | ED 53 series | |
| Silicon wafer | Silicon Quest | 708-007 | Boron doped <100> wafer, 4" diameter, 500 μm, single side polished |
| GM1070 SU-8 photoresist | Gersteltec Sarl | ||
| SU-8 developer | Gersteltec Sarl | ||
| Sylgard 184 curing agent | Dow Corning | ||
| Sylgard 184 elastomer prepolymer | Dow Corning | ||
| PLL-PEG-biotin (20%) | SuSos AG | PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)/PEG(3.4)-Biotin (20%) | 1 mg/ml in PBS |
| Fluorescein | Sigma | 46955 | 1 mM in PBS |
| Streptavidin-AlexaFluor350 | Invitrogen | S-11249 | 1 mg/ml in PBS |
| Biotin-4-fluorescein | Invitrogen | B-1370 | 0.03 μg/μl in PBS |
| Biotin-RGD | GenScript | SC1208 | 0.03 mg/ml in PBS |
| Syto 64 Red | Invitrogen | S-11346 | 1 μM in PBS |
| Sticky slide chemotaxis 3D | Ibidi | 80328 | |
| 200 μl Greiner yellow bevelled tip | Greiner Bio-One | 739261 | |
| Vaseline | Sigma | 16415 | |
| Paraffin wax, mp 55-57 °C | Sigma | 327204 | |
| Nano eNabler 10 μm cantilever | BioForce | SPT-S-C-10s | |
| Image J software | National Institute of Health | rsbweb.nih.gov/ij/download.html | |
| Manual Tracking plugin | Fabrice Cordelières | rsb.info.nih.gov/ij/plugins/track/track.html | |
| Chemotaxis and Migration Tool | Ibidi GmbH | www.ibidi.com/applications/ap_chemotaxis.html |
References
- Pulsipher, A., Yousaf, M. N. Surface Chemistry and Cell Biological Tools for the Analysis of Cell Adhesion and Migration. Chem. BioChem. 11, 745-753 (2010).
- Hall, A. The cytoskeleton and cancer. Cancer Metastasis Reviews. 28, 5-14 (2009).
- Parsons, J. T., Horwitz, A. R., Schwartz, M. A. Cell adhesion: integrating cytoskeletal dynamics and cellular tension. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11, 633-643 (2010).
- Geiger, B., Spatz, J. P., Bershadsky, A. D. Environmental sensing through focal adhesions. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 21-33 (2009).
- Roussos, E. T., Condeelis, J. S., Patsialou, A. Chemotaxis in cancer. Nature Reviews Cancer. 11, 573-587 (2011).
- Petrie, R. J., Doyle, A. D., Yamada, K. M. Random versus directionally persistent cell migration. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 538-549 (2009).
- Geiger, B., Yamada, K. M. Molecular architecture and function of matrix adhesions. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3, (2011).
- Ngalim, S. H., Magenau, A., Saux, G. L. e, Gooding, J. J., Gaus, K. How do cells make decisions: engineering micro- and nanoenvironments for cell migration. Journal of Oncology. 2010, 363106 (2010).
- Roy, D. C., Wilke-Mounts, S. J., Hocking, D. C. Chimeric fibronectin matrix mimetic as a functional growth- and migration-promoting adhesive substrate. Biomaterials. 32, 2077-2087 (2011).
- Jin, T., Xu, X., Hereld, D. Chemotaxis, chemokine receptors and human disease. Cytokine. 44, 1-8 (2008).
- Xu, X., Jin, T. Imaging G-protein Coupled Receptor (GPCR)-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum. J. Vis. Exp. (55), e3128 (2011).
- Chung, B. G., et al. A Gradient-generating Microfluidic Device for Cell Biology. J. Vis. Exp. (7), e271 (2007).
- Rhoads, D. S., Guan, J. L. Analysis of directional cell migration on defined FN gradients: role of intracellular signaling molecules. Exp. Cell Res. 313, 3859-3867 (2007).
- Park, J., et al. Simple haptotactic gradient generation within a triangular microfluidic channel. Lab on a Chip. 10, 2130-2138 (2010).
- Li Jeon, N., et al. Neutrophil chemotaxis in linear and complex gradients of interleukin-8 formed in a microfabricated device. Nat. Biotech. 20, 826-830 (2002).
- Joanne Wang, C., et al. A microfluidics-based turning assay reveals complex growth cone responses to integrated gradients of substrate-bound ECM molecules and diffusible guidance cues. Lab on a Chip. 8, 227-237 (2008).
- Frequently Asked Questions (FAQ) :: ibidi [Internet]. , ibidi GmbH. Available from: http://www.ibidi.com/service/faq.html (2010).
- Pujic, Z., Mortimer, D., Feldner, J., Goodhill, G. J. Assays for eukaryotic cell chemotaxis. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 12, 580-588 (2009).
- Thery, M., Piel, M. Adhesive micropatterns for cells: a microcontact printing protocol. Cold Spring Harbor protocols. 2009, pdb prot5255 (2009).
- Shen, K., Qi, J., Kam, L. C. Microcontact Printing of Proteins for Cell Biology. J. Vis. Exp. (22), e1065 (2008).
- Shin, Y., et al. Microfluidic assay for simultaneous culture of multiple cell types on surfaces or within hydrogels. Nat. Protocols. 7, 1247-1259 (2012).
- Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro- and nanoscale patterning. Nat. Protocols. 5, 491-502 (2010).
- Huang, Y., Agrawal, B., Sun, D., Kuo, J. S., Williams, J. C. Microfluidics-based devices: New tools for studying cancer and cancer stem cell migration. Biomicrofluidics. 5, 13412 (2011).
- Hillborg, H., et al. Crosslinked polydimethylsiloxane exposed to oxygen plasma studied by neutron reflectometry and other surface specific techniques. Polymer. 41 (00), 6851-6863 (2000).
- Liu, L., Ratner, B. D., Sage, E. H., Jiang, S. Endothelial Cell Migration on Surface-Density Gradients of Fibronectin, VEGF, or Both Proteins. Langmuir. 23, 11168-11173 (2007).
- Friedl, P., Wolf, K. Plasticity of cell migration: a multiscale tuning model. The Journal of Cell Biology. 188, 11-19 (2010).
- Moazzam, F., DeLano, F. A., Zweifach, B. W., Schmid-Schönbein, G. W. The leukocyte response to fluid. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94, 5338-5343 (1997).
- Walker, G. M., et al. Effects of flow and diffusion on chemotaxis studies in a microfabricated gradient generator. Lab on a Chip. 5, 611-618 (2005).
- Perl, A., Reinhoudt, D. N., Huskens, J. Microcontact Printing: Limitations and Achievements. Adv. Mater. 21, 2257-2268 (2009).
- Salaita, K., Wang, Y., Mirkin, C. A. Applications of dip-pen nanolithography. Nat. Nano. 2, 145-155 (2007).
- Wouters, D., Schubert, U. S. Nanolithography and nanochemistry: probe-related patterning techniques and chemical modification for nanometer-sized devices. Angewandte Chemie (International ed. in English). 43, 2480-2495 (2004).
- Xia, N., et al. Directional control of cell motility through focal adhesion positioning and spatial control of Rac activation. FASEB J. 22, 1649-1659 (2008).
- Oakes, P. W., Beckham, Y., Stricker, J., Gardel, M. L. Tension is required but not sufficient for focal adhesion maturation without a stress fiber template. The Journal of Cell Biology. 196, 363-374 (2012).
