Summary
발암 성 암 세포와 암 미세 환경 사이의 상호 작용을 포함하는 프로세스입니다. 분자 이벤트를 해부 한 암을 개발하는 동안 여러 단계에서 서로 다른 세포 집단을 분리해야합니다. 기저 세포 암종에 대한 마우스 모델을 사용하여, 우리는 발암 동안 세포 분석을위한 프로토콜을 설명합니다.
Abstract
암 개발은 암 전구 세포, 면역 세포, 섬유 아세포 및 혈관 내피 세포를 포함한 여러 세포 유형을 포함하는 여러 단계 프로세스입니다. 세포의 각 유형 발암 동안 신호 및 기능 변화를 겪는다. 많은 암 연구에 대한 현재의 과제는 생체 내에서 여러 단계의 과정 동안 각 세포 유형에서 이러한 변경을 해부하는 것입니다. 지난 몇 년 동안, 저자는 K14creER/R26-SmoM2 YFP 마우스를 사용하여 피부암을 개발하는 동안 다른 세포 집단을 분리하는 절차의 세트를 개발했습니다. 분리 4), 마우스 피부 생검을 준비 3) 마우스 피부 2) 유도 SmoM2 YFP 표현, 연구에 적합한 쥐 (K14creER +와 R26-SmoM2 YFP +이 프로토콜의 생쥐를) 생성 : 1) 절차는 6 부분으로 나누어 져 있습니다 피부의 표피, 5) 표피에서 단일 세포를 제조하는 단계; 6) 유동 세포 계측법 분석을위한 단일 세포 인구를 라벨.오른쪽 유전자형과 생쥐의 충분한 수의 생성은 2 개월까지 걸릴 수 있습니다이 프로토콜의 제한 단계입니다. 단계의 나머지는 몇 일 몇 시간이 걸릴. 이 프로토콜 내에서, 우리는 또한 문제 해결을위한 섹션을 포함. 우리는 피부암에 초점을하지만,이 프로토콜은 인간의 질병의 다른 동물 모델에 적용 할 수정할 수 있습니다.
Introduction
인간 암의 가장 흔한 유형으로, 기저 세포 암종 (BCC)는 1 년마다 약 2 백만 미국인에 영향을 미칩니다. 증거를 축적하는 고슴도치 (Hh를) 신호의 비정상적인 활성을 나타내는 것은 BCC 개발 (2,3 년 후기) 기본 원동력이다. BCCs의 신호 Hh를의 변경은 불 활성화 PTCH1 4-6의 돌연변이, SMO 7-9의 기능 획득 돌연변이 및 Hh를 통로 전사 인자 GLI1 10 GLI2 11 또는 네거티브 레귤레이터 스와의 희귀 비활성화 돌연변이 (푸의 탈선 표현을 포함 ) 12. 모든 이들과 다른 연구를 통해, 연방 의약청 (FDA)은 최근 BCCs 13-15 전이성 로컬 고급 치료하는 Hh를 신호 억제제 Vismodegib의 사용을 승인했습니다.
이러한 모든 성과 16에도 불구하고, 우리는 여전히 Hh를 신호가 CARC를 구동하는 분자 및 세포 메커니즘을 이해하지inogenesis. Hh를 신호의 조직 특이 활성화를 사용하여 동물 모델을 확립하는 것은 이러한 연구를 위해 및 약물 내성에 대한 우리의 이해를 위해 여전히 중요합니다. 마우스에서 야생 형 생쥐, 심지어 발암 물질 UV 또는 전리 방사선의 무거운 복용량에 따라, BCCs을 개발하지 않습니다. 반면, Ptch1 + / - 마우스는 BCC 개발 17,18에 감염 될 수 있습니다. 정상적인 조건에서 유지하는 경우 마우스를 거의 자란 BCCs을 개발하지 - Ptch1에서 BCC 개발의 투과도는 + / - Ptch1 + /는 있지만 마우스 50 % 이상 18,19입니다. Ptch1의 배아 치사로 인해 - / -, PTCH1의 조직 특이 녹아웃은 일반적으로 연구 20에 사용됩니다. 또한, 종양 SmoM2 YFP (Krt14-creER : R26-SmoM2 YFP 또는 Krt14-CRE : R26-SmoM2 YFP)의 조건 피부 특정 표현에 대한 쉬운 유전 적 분석을 제공하는 아주 어린 나이에 여러 개의 미세한 BCCs의 형성에 이르게 HH 신호는 할SMO 21 하류 측.
BCC 생물학 지식의 세 가지 주요 문제가 있습니다. 첫째, BCCs의 세포 기원은 완전히 명확하지 않습니다. 일부 연구는 줄기 세포 사이트에 22-24으로 머리 여포의 꿈쩍도을 지원하지만, 유세프 등. 25 머리 여포에 간 소낭 표피 지역에있을 피부 HH-기반 종양의 기원의 쥐 셀 현지화되지 않음 , ROSA26 기반의 유전자 돌연변이 SMO의 발현을 활성화하는 세포 특정 크레을 사용하여. BCC 개발하는 동안 둘째, 세포의 상호 작용이 잘 이해되지 않습니다. 그것은 활성화 Hh를 신호로 각질이 BCCs의 형성으로 이어질 수 있다고 알려져 있지만 다른 세포 변화가 잘 - 이해되지 않습니다. 또한, 마우스의 SMO 길항제의 치료 약제 내성 26-28로 이어질 수 있습니다. BCC에 대한 그러므로 새로운 표적이 크게 필요하다. 이 세 가지 문제를 이해하는 것은 carcinog 동안 생쥐의 세포 변화에 대한 분석이 필요enesis. 여러 가지 방법이 각질 문화, 유동 세포 계측법, 피부 줄기 세포 분리 29-31으로 출판되었지만, 마우스 BCCs의 세포 분석을위한 종합적인 절차는 현재 없습니다. BCCs의 마우스 모델, 표피의 분리, 조직 및 세포 분석에서 단일 세포의 생성을위한 방법을 결합하여, 우리는 BCC 개발 과정에서 세포 신호, 세포 및 분자의 상호 작용을 연구하는 일련의 절차와 독자를 제공합니다. 우리는이 프로토콜은 독자가 각 절차를 수행하는 방법을 볼 수 있다고 생각합니다. 또한, 우리는 결과가 어떠해야하는지 설명하기 위해 일부 데이터를 제공하고, 독자는 이러한 절차를 수행하는 동안 어려움을 극복하는 데 도움이되는 문제 해결.
Protocol
이 연구는 의학의 인디애나 대학 학교에서 IACUC위원회에 의해 승인되었습니다.
1. 올바른 유전자형을 가진 쥐를 생성
- BCCs의 마우스 모델을 설정합니다. R26-SmoM2 YFP 마우스 (잭슨 연구소 주식 번호 005130) (18)와 동료 K14-CreER 마우스 (잭슨 연구소 주식 번호 005107)은 K14-creER +와 R26-SmoM2 YFP + 마우스를 생성합니다.
- 유전자형을 수행합니다. 1 MG / ML 단백질 분해 효소 K와 directPCR 꼬리 용해 용액에 담가 꼬리를 표본 (0.5 cm 길이) 55 ° C 떨고 하룻밤. 다음 날 (유전자형에 대한 상층 액을 유지하기) 마이크로 원심 분리기에서 최고 속도로 원심 분리하여 조직 파편을 제거합니다. 공급 업체에서 권장하는 프라이머 및 조건 각 PCR 반응 상층 액 1 μL를 사용합니다. 오른쪽 유전자형 (3-6 주 나이, 0.05-0.1에서 부 프레 노르 핀의 MG / kg이 꼬리를 싹둑 후에 2-3 일 SQ마다 8-12 시간을 통해 적용됩니다) FO와 마우스를 선택R 2 단계.
2. 피부 각질 형성 세포의 SmoM2의 발현을 유도
먹이 바늘 (20 게이지 곡선)을 경구 투여를 통해 연속 5 일 동안 타목시펜 (각 먹이는 식물성 오일 50 ㎖에 5 ㎍ / kg 체중)의 경구 투여에 의한 각질 형성 세포에서 SmoM2 발현을 유도.
3. 피부 표본을 준비
일반적으로, 표현형은 K14creER/R26SmoM2 GFP 마우스의 귀 꼬리에 더 심각합니다. 세포 분석을 준비하기 위해, 우리는 먼저 제도적 승인 절차 (CO 2 플러스 자궁 경부 전위)와 동물의 희생 후에 마우스 피부를 수확.
4. 표피를 분리
- 승인 절차 (3 단계 참조) 희생 생쥐 후, 트리머를 사용하여 모피를 제거합니다. 37 디스 파제 (dispase) 용액 (10 % FBS와 DMEM 5 MG / ML) ° 1-2 시간 (이하 8 주 오래 된, 2 시간 마우스를위한 1 시간 동안 C에 담가 피부 표본) 8 주 이상 오래 생쥐합니다.
- 다음 디스 파제 (dispase) 처리, 포셉으로 진피 별도의 표피.
5. 단일 세포를 생성
- 단일 세포 인구를 얻으려면, 50 ML 튜브에 37 ° C에서 1-2 시간 동안 콜라게나 제 IV 용액 (10 % FBS와 DMEM 1 ㎎ / ml)에 몰입 한 후 가위로 표피를 말하다. 부드럽게 소용돌이 관에게 세포 분열을하는 데 도움이 매 20 분하려고합니다.
- 현미경으로 세포 분열을 검사합니다. 하나의 세포가 콜라 매체에 감지 할 수있을 때, 세포 수율을 높이기 위해 추가로 30 분 동안 표본을 품어. 일반적으로, 하나의 마우스에서 표피는 10 7 셀을 얻을 수 있습니다.
- 벤치 탑 원심 분리를 통해 1,500 rpm에서 셀 스트레이너 (기공 크기 70 μm의), 스핀 세포를 통해 조직의 혼합물을 필터링하고, PBS와 시간을 한 번 씻는다.
6. 라벨 세포 및 유동 세포 계측법의 분석을 수행
- 10 % FBS에서 세포를 resuspend을PBS 2.5 X 10 6 세포 / 비 특정 바인딩을 차단하는 ML에서 (얼음에 30 분 동안)
- 특정 항체 라벨 1.5 ML 모세관의 각 세포의 나누어지는 가져 가라. 2 μg / ML의 최종 농도에서 각 튜브에 서로 다른 항체를 추가합니다. 몇 초 동안 부드러운 정점을 통해 세포와 항체를 혼합하고 1 ML PBS로 세척 한 후, 30 분 동안 얼음에 그들을 두십시오. , vimentin에-FITC (섬유 아세포) (자세한 내용은 시약 참조) CD11b-PE 플러스 GR1-APC (골수 세포 또는 골수 유래 억제 세포) : BCC 견본을 위해, 우리는 다음과 같은 생체에 대한 항체를 사용 하였다.
- 세포 염색을 위해, 우리는 키트를 사용하여 (자세한 내용은 시약 참조) 공급 업체의 설명서를 따르십시오. 우리는 세포 표면 마커를 분석하는 새로운 세포를 사용합니다. 표면 마커 염색 한 후 세포를 세척하고 PBS에서 그들을 resuspend을. 1 μg / ML의 최종 농도에서 세포 혼합물에 DAPI를 추가합니다. DAPI 더 분석에서 게이트 수있을 것이다 죽은 세포를 얼룩 것입니다.
- specifi를 사용하여 데이터를 분석C 소프트웨어. 우리가 처음 FSC 대 SSC 플롯에 따라 단일 셀을 선택하고, 추가 분석을 위해 DAPI 음 인구 (살아있는 세포)를 사용합니다.
Representative Results
그것은 쥐 Hh를 신호 활성화를 제외하고 기저 세포 암을 개발하지 않는 것으로 알려져있다. 그림 1은 부드럽게 종양의 유도 발현 후 피부 표현형, SmoM2 YFP. 그림 2는 정상 및 종양 베어링 생쥐의 골수 세포의 분석을 보여줍니다 보여줍니다. CD11b + GR1 + 세포는 골수 세포에서 파생 된, 그리고 그들 중 일부는 파생 억제 세포를 골수 있습니다. 정상적인 상황에서, CD11b + GR1 + 세포 인구가 거의 감지 할 수 있지만, 염증이나 종양 발달에 대한 응답으로 증가 할 것이다. 우리는 CD11b + GR1 + 세포의 증가, 피부 결과에 SmoM2YFP의 유도 발현을 보였다. 현재 BCCs의 변화를 기본 분자 메커니즘은 명확하지 않다.
그림 1. Morphologica마우스 피부 SmoM2YFP 유도 후 L로 변경됩니다. 위로 마우스 유전자형의 다이어그램을 보여줍니다. 가운데 패널 : 타목시펜으로 치료 K14creER +와 R26-SmoM2 YFP + 마우스 H & E 섹션에서 크게 피부에 이상 (오른쪽)뿐만 아니라 피부 종양 (왼쪽)했다. 하단 패널 : 마우스 SmoM2YFP 유도없이 정상적인 피부를 찾고 (오른쪽)와 H & E 부분 (왼쪽)에 아무 이상 형태를 보여 주었다.
그림 2. CD11b + GR1 + 세포의 흐름 분석. 피부암을 개발하는 동안 CD11b + GR1 + 세포의 변화를 조사하기 위해, 우리는 CD11b와 GR1에 형광 표지 항체 단일 세포와 스테인드 격리. FlowJo와 분석 후, 우리는 타목시펜 투여 쥐의 피부 조직이 세포 인구의 증가를 발견.
Discussion
우리는 BCCs의 세포 인구 분석을위한 방법을 설명했습니다. 종양 조직은 많은 세포 유형의 일관성, 각 세포 유형은 체외 조건에서 가장 아래도 탈환하는 것은 매우 어려운, 발암 주어진 시간에 다르게 동작합니다. 이 프로토콜을 사용하여, 우리는 기저 세포 암의 개발은 표피 줄기 세포의 확장뿐만 아니라 골수 세포의 채용에 의해 동반되는 것으로 나타났다. 면역 또는 면역 형광 분석에 비해 세포 인구 분석은 세포 유형의 다양한 특정 항체 이후 세포 인구 변화의 정량적 인 평가를주고는 이제 사용할 수 있습니다.
유전자 유도에 의한 표현형의 변화는 시간이 필요하기 때문에이 프로토콜에 대한 10 주이 연구를 완료하는 데 필요합니다. 그것은 미리 실험을 계획하는 따라서 중요합니다. 세포의 분리 및 분석을 위해, 이틀이 필요할 수도 있습니다. 살아있는 세포는 분석가를 위해 사용되기 때문에ES, 그것은 미리 FACSCalibur을 예약하는 것이 중요합니다. 이 프로토콜 (아래 참조)로 작업 할 때 우리는 또한 일반적인 문제를 나열했습니다.
우리의 경험에서, 아래는 우리가 발생하는 일반적인 문제 :
- 표피별로 분리 :이 완료되지 않은 디스 파제 (dispase) 처리 (diapase 치료의 시간을 늘려주세요) 또는 부족 디스 파제 (dispase) 솔루션 (피부가 완전히 디스 파제 (dispase) 용액에 담가해야합니다)가 발생할 수 있습니다. 우리는 하나의 마우스 디스 파제 (dispase) 솔루션의 적어도 5 mL를 사용합니다. 볼륨이 피부의 크기에 따라 달라질 수 있습니다.
- 콜라게나 제 IV를 가진 불완전한 소화로 인해이 5 월 : 세포 수의 낮은 수율. 첫 번째 검사 콜라 농도 또는 만료 날짜를하시기 바랍니다. 이것은 또한 사용 표피의 부족 금액으로 인해 발생할 수 있습니다. 또한, 효소 소화 ° C (소화를 수행하기 전에 온도를 조정하십시오) 흔들어 37에서 수행되어야한다.
- 세포 덩어리 : 이것은 (피부 세포에 대한 피펫 세포 매우 일반적입니다몇 번 여과기 (원심 분리 이전) 또는 마그네슘 2의 존재를 거쳐 +와 칼슘 2 + 용액 (MG 2를 사용하십시오 셀 워시 +와 칼슘 2 + 무료 PBS).
- 너무 많은 죽은 세포 :이 (신선 조직을 사용하십시오) 저하 조직의 결과이거나, 수에 소화 (디스 파제 (dispase)와 콜라게나 제 IV로 확장 배양을 방지).
이 프로토콜은 골수 이식 또는 세포의 기원을 조사하는 조직 이식과 결합 될 수있다. 예를 들어, 이식 GFP - 표현 치명적 조사 생쥐에 골수 세포는 우리가 종양 - 관련 섬유 아 세포와 골수 세포에 골수 세포의 기여를 검사 할 수 있습니다. 마찬가지로, 피부 종양은 종양 호스트 상호 작용을 조사하는 새로운 마우스 호스트에 이식 할 수 있습니다.
발암 동안 세포 인구 변화를 조사 할뿐만 아니라,이 프로토콜은 연구자들이 검토 할 수 있도록종양 환경에서 세포에 약물 치료의 효과. 이 프로토콜은 피부 동안 세포 인구 분석에 사용하도록 설계되어 있지만 발암, 약간의 수정은 다른 암 유형에 대해 만들 수 있습니다.
요약하면, 피부 암의 마우스 모델에서 세포 인구 분석은 우리에게 종양 전이에서 세포 생물학의 더 나은 이해로 이어지는 발암 동안 동적 세포 변화, 그리고 변환 과정에서 서로 다른 세포 이벤트를 제공 할 수 있습니다.
Disclosures
저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.
Acknowledgments
이 연구는 NCI (R01-94160 및 R01-155086), IU 사이먼 암 센터 소아 연구 웰스 센터에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| directPCR lysis reagent (tail) | Viagen Biotech | 102-T | store @ 4 °C |
| proteinase K | Sigma | P2308 | store @ -20 °C |
| ApliTag 360 taq polymerase | Applied biosystems | N8080155 | store @ -20 °C |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | store @ 4 °C |
| Feeding needle (20 gauge) | Fisher scientific | 01-290-9B | |
| Dispase | Roche Diagnostic | 04942078001 | store @ 4 °C |
| Collagenase IV | Worthington | LS004189 | store @ -20 °C |
| Cell strainer | Fisher scientific | 08-771-2 | |
| Anti-CD11b-PE | eBioscience | 12-0112-81 | store @ 4 °C |
| Anti-Gr1-APC | eBioscience | 17-5931-81 | store @ 4 °C |
| Anti-vimentin-FITC | eBioscience | 11-9897-80 | store @ 4 °C |
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