Summary
הסרטן הוא תהליך כרוך אינטראקציות בין תאים סרטניים וmicroenvironment הסרטן. כדי לנתח את האירועים המולקולריים, צריך לבודד את אוכלוסיות תאים שונות בשלבים שונים במהלך התפתחות הסרטן. שימוש במודל עכבר לקרצינומה של תאי בסיס, אנו מתארים פרוטוקול עבור ניתוחי תא במהלך היווצרות הסרטן.
Abstract
התפתחות הסרטן היא תהליך רב שלבים הכוללים הרבה סוגי תאים, כולל תאים סרטניים, תאים חיסוניים מבשר, fibroblasts ותאי האנדותל. כל סוג של תאים עובר איתות ופונקציונלית שינויים במהלך היווצרות הסרטן. האתגר הנוכחי לחוקרי סרטן רבים הוא לנתח שינויים אלה בכל אחד מסוגי התאים בתהליך מרובה שלבי in vivo. בשנים האחרונות, החוקרים פיתחו מערכת של נהלים לבודד אוכלוסיות תאים שונים במהלך התפתחות סרטן העור באמצעות K14creER/R26-SmoM2 עכברי YFP. ההליך מחולק 6 חלקים: 1) לייצר עכברים מתאימים למחקר (K14creER + YFP + עכברים בפרוטוקול זה) וR26-SmoM2, 2) ביטוי התרמה SmoM2 YFP בעור עכבר; 3) נערכים ביופסיות עור עכבר; 4) בידוד האפידרמיס מעור; 5) הכנת תאים בודדות מהאפידרמיס; 6) תיוג אוכלוסיות תא בודדות לניתוח cytometry זרימה.הדור של מספר המספיק של עכברים עם גנוטיפ הנכון הוא הצעד המגביל בפרוטוקול זה, אשר עשוי להימשך עד חודשים. שאר צעדים לקחת כמה שעות לכמה ימים. בתוך פרוטוקול זה, אנו כוללים גם סעיף לפתרון בעיות. למרות שאנו נתמקד בסרטן העור, פרוטוקול זה יכול להיות שונה כדי להגיש בקשה למודלים של בעלי חיים אחרים של מחלות בבני אדם.
Introduction
כסוג הנפוץ ביותר של סרטן בבני אדם, קרצינומה של תאי בסיס (BCC) משפיעה על כ -2 מיליון אמריקאים בשנה 1. צבירת ראיות מצביעות על כך שההפעלה תקינה של קיפוד איתות (HH) הוא כוח המניע שבבסיס פיתוח BCC (נבדקו ב2,3). שינויים של Hh איתות בBCCs כוללים מוטציות inactivating של PTCH1 4-6, מוטציות רווח של פונקציה של SMO 7-9, וביטוי חריג של hh גורמי שעתוק מסלול GLI1 10 וGLI2 11 או מומתות מוטציות נדירות של סו רגולטור השלילית (פו ') 12. דרך כל מחקרים אלה ואחרים, פדרלי תרופות אמריקניות (FDA) אישר לאחרונה את השימוש בHh איתות מעכב Vismodegib לטיפול גרורתי ומתקדם מקומי BCCs 13-15.
למרות כל ההישגים האלה 16, אנחנו עדיין לא מבינים את מנגנונים המולקולריים ותאיים שבאמצעותו Hh האיתות מניעה קרקinogenesis. הקמת מודלים של בעלי חיים באמצעות הפעלת רקמות ספציפית של Hh איתות עדיין חשובה למחקרים אלה ועל ההבנה של עמידות לתרופות שלנו. בעכברים, wild-type עכברים אינם מפתחים BCCs, גם במינונים גבוהים של קרינת UV או מייננת מסרטנים,. לעומת זאת, Ptch1 + / - עכברים רגישים להתפתחות BCC 17,18. Penetrance של התפתחות BCC בPtch1 + / - עכברים היא מעל 50% 18,19 למרות Ptch1 + / - עכברים לעתים רחוקות לפתח BCCs מגודלים אם כל הזמן בתנאים רגילים. בשל הקטלניות העוברית של Ptch1 - / -, נוקאאוט רקמות ספציפי של PTCH1 משמש בדרך כלל למחקר 20. בנוסף, ביטוי עור ספציפי מותנה שהעור SmoM2 YFP (Krt14-קואל: R26-SmoM2 YFP או Krt14-cre: R26-SmoM2 YFP) מביא להיווצרות של BCCs מיקרוסקופי מרובים בגיל צעיר מאוד, מתן assay גנטי קל לי איתות HH לעשותwnstream של SMO 21.
ישנן שלוש סוגיות מרכזיות בידע של הביולוגיה BCC שלנו. ראשית, המקור התאי של BCCs הוא לא לגמרי ברור. בעוד מחקרים מסוימים תומכים לזוז של זקיק שיער כאתר תא גזע 22-24, יוסף ואח'. מקומי 25 תא העכברי המוצא של גידולי HH-מונעים עורית להיות באזור האפידרמיס בין הזקיקים-, לא בזקיק השיער , על ידי שימוש בתא ספציפי Cre להפעיל ביטוי של מהונדס ROSA26 מונע מוטציה SMO. אינטראקציות שנייה, סלולריות במהלך התפתחות BCC אינן מובנהית היטב. זה ידוע כי קרטינוציטים עם Hh הופעל איתות יכולים להוביל להיווצרות של BCCs, אבל שינויים תאיים אחרים לא הבינו היטב. יתר על כן, טיפול בנוגדי SMO בעכברים יכולים להוביל לעמידות לתרופת 26-28. מטרות כך חדשניות לBCC דרושות עד מאוד. הבנה בשלוש סוגיות אלה מחייב ניתוח של שינויים תאיים בעכברים במהלך carcinogenesis. בעוד כמה שיטות שפורסמו לתרבות keratinocyte, cytometry הזרימה ובידוד תאי גזע עור 29-31, כרגע אין נהלים מקיפים לניתוחים סלולריים בBCCs העכבר. על ידי שילוב של שיטות למודל עכבר של BCCs, הפרדה של האפידרמיס, דור של תאים בודדים מרקמות וניתוחים סלולריים, נספק לקוראים עם סט של נהלים ללמוד איתות סלולרי, סלולרית ואינטראקציות מולקולריות במהלך התפתחות BCC. אנו מאמינים כי פרוטוקול זה יאפשר לקוראים לראות איך כל הליך נעשה. בנוסף, סיפקנו כמה נתונים כדי להמחיש מה התוצאות אמורות להיראות, ופתרון בעיות כדי לעזור לקוראים להתגבר על קשיים במהלך ביצוע הליכים אלה.
Protocol
מחקר זה אושר על ידי ועדת IACUC באוניברסיטת אינדיאנה הספר לרפואה.
1. ליצור עכברים עם גנוטיפים נכון
- לבסס מודל עכבר של BCCs. עכברי K14-Mate קואל (ג'קסון המעבדה מספר מניות 005,107) עם R26-SmoM2 עכברי YFP (ג'קסון המעבדה מספר מניות 005,130) (18) ליצירת K14-קואל + ו-R26 SmoM2 YFP + עכברים.
- בצע genotyping. לטבול את זנב דגימות (עוד 0.5 ס"מ) בפתרון תמוגה זנב directPCR עם 1 מ"ג / מיליליטר proteinase K על 55 מעלות צלזיוס למשך לילה עם רעד. למחרת, להסיר שאריות רקמה על ידי צנטריפוגה במהירות שיא במייקרו צנטריפוגות (כדי לשמור את supernatant לgenotyping). השתמש μl 1 של supernatant לכל תגובת PCR עם פריימרים ותנאים שהומלצו על ידי הספק. בחר את העכברים עם גנוטיפים הנכונים (בגיל 3-6 שבועות, עצירות ב0.05-0.1 מ"ג / ק"ג ייושם באמצעות SQ כל 8-12 שעות במשך 2-3 ימים לאחר חיתוך זנב) for שלב 2.
2. לגרום ביטוי של SmoM2 בקרטינוציטים עור
לגרום SmoM2 ביטוי בקרטינוציטים על ידי מתן פומי של טמוקסיפן (משקל גוף מיקרוגרם / ק"ג 5 ב 50 מיליליטר שמן צמחי בכל האכלה של) במשך 5 ימים רצופים באמצעות gavage האוראלי עם מחט האכלה (מעוקל 20 מד).
3. הכנת דגימות עור
באופן כללי, פנוטיפים חמורים יותר על האוזן ואת הזנב בK14creER/R26SmoM2 עכברי ה-GFP. כדי להתכונן לניתוחים סלולריים, אנחנו קוצרים ראשון עור העכבר לאחר הקרבת חיה עם נוהל שאושר מוסדי (CO 2 בתוספת נקע בצוואר רחם).
4. בידוד אפידרמיס
- לאחר הקרבת עכברים עם נוהל שאושר (ראה שלב 3), להסיר פרווה באמצעות גוזם. דגימות עור לטבול בפתרון dispase (5 מ"ג / מ"ל DMEM עם 10% FBS) על 37 מעלות צלזיוס במשך 1-2 שעות (שעה 1 לעכברים פחות מ 8 שבועות ישנים ושעה 2לעכברים ישנים מ 8 שבועות).
- טיפול בעקבות dispase, האפידרמיס נפרד מהדרמיס על ידי מלקחיים.
5. לייצר תאים בודדים
- כדי להשיג אוכלוסיית תא בודד, בשר טחון האפידרמיס על ידי מספריים ולאחר מכן לטבול בcollagenase IV פתרון (1 מ"ג / מ"ל בDMEM עם 10% FBS) עבור 1-2 שעות על 37 מעלות צלזיוס בצינור 50 מ"ל. נסה בעדינות מערבולת את הצינורות בכל 20 דקות כדי לעזור להתנערות תא.
- בדוק התנערות תא מתחת למיקרוסקופ. כאשר ניתן לאתר תאים בודדים במדיום collagenase, דגירה הדגימה עבור 30 דקות נוספות כדי להגדיל את תשואת התא. באופן כללי, האפידרמיס מעכבר אחד יכול להניב עד 10 7 תאים.
- סנן את תערובת הרקמות באמצעות מסננת תא (גודל נקבובית 70 מיקרומטר), ספין למטה תאים ב 1500 סל"ד באמצעות צנטריפוגה הספסל העליונה, ולשטוף פעם זמן עם PBS.
6. תאי תווית ולבצע אנליזות זרימת cytometry
- Resuspend תאי FBS 10%PBS ב 2.5 x 10 6 תאים / מ"ל לחסום הלא ספציפי מחייב (על קרח למשך 30 דקות)
- קח aliquot של תאים לכל אחד מ1.5 microtubes מ"ל לתיוג נוגדן ספציפי. הוסף נוגדנים שונים לכל צינור בריכוז סופי של 2 מיקרוגרם / מ"ל. מערבבים עם תאים באמצעות נוגדני קודקוד עדין במשך כמה שניות ולהשאיר אותם על קרח למשך 30 דקות, ולאחר מכן לשטוף עם 1 מיליליטר PBS. לדגימות BCC, השתמשנו בנוגדנים לסמנים הבאים: CD11b-PE בתוספת GR1-APC (תאי מיאלואידית או תאי מדכאי מיאלואידית הנגזרות); vimentin-FITC (פיברובלסטים) (ראה ריאגנטים לפרטים נוספים).
- עבור מכתים תאי, אנו משתמשים בערכה ובצעו את הוראות של הספק (ראה ריאגנטים לפרטים נוספים). אנו משתמשים בתאים טריים לנתח סמנים פני תא. לאחר צביעת סמן פני השטח, לשטוף תאים, וresuspend אותם ב-PBS. הוסף DAPI לתערובת התא בריכוז סופי של 1 מיקרוגרם / מ"ל. DAPI יהיה כתם תאים מתים שיהיו מגודר החוצה מניתוח נוסף.
- לנתח את הנתונים ספציפיים עםתוכנת ג. אנחנו ראשון בחרו תאים בודדים המבוססים על FSC לעומת עלילת SSC, ולהשתמש באוכלוסייה שלילית DAPI (תאי חיים) לניתוח נוסף.
Representative Results
זה ידוע כי עכברים אינם מפתחים קרצינומה של תאי הבסיס, אלא בהפעלת איתות Hh. איור 1 מציג את הפנוטיפ העור בעקבות ביטוי מושרה של שהעור החליק, SmoM2 YFP. תרשים 2 מציג ניתוח של תאי מיאלואידית בעכברים נורמלים ונושא גידול. CD11b + + תאי GR1 נגזרים מתאי מיאלואידית, וכמה מהם מיאלואידית תאי מדכאי נגזרים. במצב נורמלי, CD11b + + GR1 אוכלוסיית תא היא כמעט לא מורגש, אך תגדיל בתגובה לדלקת או להתפתחות גידול. אנחנו הראו כי ביטוי מושרה של SmoM2YFP בתוצאות בעור גידול בCD11b + GR1 + תאים. נכון לעכשיו, את המנגנונים המולקולריים שבבסיס שינוי זה בBCCs אינם ברורים.
איור 1. Morphological שינויים לאחר האינדוקציה SmoM2YFP בעור עכבר. העליון מראה תרשים של גנוטיפים עכבר. הפנל התיכון: + K14creER וR26-SmoM2 YFP + העכבר שטופל בטמוקסיפן הראה בעליל חריגות בעור (מימין), כמו גם גידולי עור בחלק H & E (משמאל). הפנל התחתון: העכבר ללא אינדוקציה SmoM2YFP הראה עור רגיל מחפש (מימין) ולא מורפולוגיה חריגה בסעיף H & E (משמאל).
איור 2. ניתוח תזרים של CD11b + GR1 + תאים. כדי לבחון את השינוי של CD11b + GR1 + תאים במהלך התפתחות סרטן העור, אנחנו מבודדים תאים בודדים ומוכתמים בנוגדני הקרינה שכותרתו ולCD11b GR1. לאחר ניתוח עם FlowJo, הבחנו בעלייה של אוכלוסיית תא זו ברקמות עור מעכברים שטופלו בטמוקסיפן.
Discussion
יש לנו תאר שיטה לניתוח אוכלוסיית תא בBCCs. רקמות גידול עקביות של סוגי תאים רבים, וכל אחד מסוגי התאים מתנהגים בצורה שונה בכל זמן נתון של הסרטן, וזה מאוד קשה לשחזר אפילו תחת תנאים הטובים ביותר במבחנה. באמצעות פרוטוקול זה, אנו הראו כי פיתוח של קרצינומה של תאי בסיס מלווה בהתרחבות של תאי גזע אפידרמיס, כמו גם גיוס של תאי מיאלואידית. בהשוואה לאימונוהיסטוכימיה או ניתוחי Immunofluorescent, ניתוחי אוכלוסיית תא לתת הערכה כמותית יותר של שינויי אוכלוסיית תא שכן נוגדנים ספציפיים למגוון רחב של סוגי תאים זמינים כעת.
לפרוטוקול זה, 10 שבועות יש צורך להשלים את המחקר, כי שינוי פנוטיפי מאינדוקצית הגן דורש זמן. זה כן חשוב לתכנן את הניסוי לפני זמן. לבידוד תא וניתוחים, שני ימים שלמים עשויים להיות נחוצים. כי תאי חיים משמשים לanalyses, חשוב להזמין FACSCalibur מבעוד מועד. יש לנו גם רשימת בעיות נפוצות בעת עבודה עם פרוטוקול זה (ראה להלן).
מניסיוננו, להלן הן בעיות נפוצות שבן נתקלו:
- הפרדה לקויה של האפידרמיס: זו עלולה להיגרם על ידי טיפול dispase שלם (בבקשה להאריך את משך הזמן של טיפול diapase) או פתרון dispase מספיק (העור צריך להיות שקוע לגמרי בפתרון dispase). אנו משתמשים בלפחות 5 מ"ל של תמיסת dispase לעכבר אחד. הנפח עשוי להשתנות בהתאם לגודלו של עור.
- תשואה נמוכה של מספר תאים: מאי זה עקב עיכול לא שלם עם collagenase IV. אנא ריכוז collagenase סימון ראשון או תאריך תפוגה. זה יכול להיגרם גם על ידי כמות מספקת של האפידרמיס בשימוש. יתר על כן, יש לבצעו אנזים עיכול בעד 37 ° C עם הרעד (אנא התאם את הטמפרטורה לפני ביצוע עיכול).
- גושי תאים: זה נפוץ מאוד לתאי עור (תאי פיפטהכמה פעמים אחרי שעובר מסננת (לפני צנטריפוגה), או קיומו של Mg 2 + וCa 2 + בתמיסה (אנא השתמש Mg 2 + וCa 2 + ללא PBS עבור תא לשטוף).
- תאים מתים רבים מדי: זו עשויה להיות תוצאה של רקמות מושפלת (אנא השתמש רקמות טריות), או יתר מערכת העיכול (למנוע דגירה ממושכת עם dispase וcollagenase IV).
פרוטוקול זה יכול להיות בשילוב עם השתלת מח עצם או השתלת רקמות כדי לבחון את מקור התא. לדוגמה, השתלה של ה-GFP-לבטא בתאי מח עצם לעכברים מוקרנים קטלני יאפשר לנו לבחון את התרומה של תאים במח עצם לfibroblasts הקשורים גידולים ותאי מיאלואידית. באופן דומה, ניתן להשתיל גידולי עור למארח עכבר חדש לבחון אינטראקציות גידול מארחות.
בנוסף לבחינת שינויים באוכלוסיית תאי הסרטן, פרוטוקול זה גם יאפשר לחוקרים לבחוןהשפעות של טיפולים תרופתיים בתאים בסביבת הגידול. למרות שפרוטוקול זה מיועד לשימוש עבור ניתוחי אוכלוסיית תאים בעור שינויים קלים סרטן, יכולים להתבצע על סוגי סרטן אחרים.
לסיכום, ניתוחי אוכלוסיית תאים במודלי עכבר של סרטן העור יכולים לתת לנו את השינויים הדינמיים סלולריים בעת היווצרות הסרטן, מה שמובילים להבנה טובה יותר של ביולוגיה של תא בהפיכת גידולים ואירועים סלולריים שונים בתהליך השינוי.
Disclosures
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי NCI (R01-R01-94,160 ו155,086), מרכז IU סיימון הסרטן ומרכז למחקר רפואת ילדים וולס.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| directPCR lysis reagent (tail) | Viagen Biotech | 102-T | store @ 4 °C |
| proteinase K | Sigma | P2308 | store @ -20 °C |
| ApliTag 360 taq polymerase | Applied biosystems | N8080155 | store @ -20 °C |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | store @ 4 °C |
| Feeding needle (20 gauge) | Fisher scientific | 01-290-9B | |
| Dispase | Roche Diagnostic | 04942078001 | store @ 4 °C |
| Collagenase IV | Worthington | LS004189 | store @ -20 °C |
| Cell strainer | Fisher scientific | 08-771-2 | |
| Anti-CD11b-PE | eBioscience | 12-0112-81 | store @ 4 °C |
| Anti-Gr1-APC | eBioscience | 17-5931-81 | store @ 4 °C |
| Anti-vimentin-FITC | eBioscience | 11-9897-80 | store @ 4 °C |
References
- Rogers, H. W., et al. Incidence estimate of nonmelanoma skin cancer in the United States. Arch. Dermatol. 146, 283-287 (2006).
- Epstein, E. H. Basal cell carcinomas: attack of the hedgehog. Nat. Rev. Cancer. 8, 743-754 (2008).
- Yang, L., Xie, G., Fan, Q., Xie, J. Activation of the hedgehog-signaling pathway in human cancer and the clinical implications. Oncogene. 29, 469-481 (2010).
- Johnson, R. L., et al. Human homolog of patched, a candidate gene for the basal cell nevus syndrome. Science. 272, 1668-1671 (1996).
- Hahn, H., et al. A mammalian patched homolog is expressed in target tissues of sonic hedgehog and maps to a region associated with developmental abnormalities. J. Biol. Chem. 271, 12125-12128 (1996).
- Hahn, H., et al. Mutations of the human homolog of Drosophila patched in the nevoid basal cell carcinoma syndrome. Cell. 85, 841-851 (1996).
- Xie, J., et al. Activating Smoothened mutations in sporadic basal-cell carcinoma. Nature. 391, 90-92 (1998).
- Reifenberger, J., et al. Missense mutations in SMOH in sporadic basal cell carcinomas of the skin and primitive neuroectodermal tumors of the central nervous system. Cancer Res. 58, 1798-1803 (1998).
- Lam, C. W., et al. A frequent activated smoothened mutation in sporadic basal cell carcinomas. Oncogene. 18, 833-836 (1999).
- Nilsson, M., et al. Induction of basal cell carcinomas and trichoepitheliomas in mice overexpressing GLI-1. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 3438-3443 (2000).
- Sheng, H., et al. Dissecting the oncogenic potential of Gli2: deletion of an NH(2)-terminal fragment alters skin tumor phenotype. Cancer Res. 62 (2), 5308-5316 (2002).
- Reifenberger, J., et al. Somatic mutations in the PTCH, SMOH, SUFUH and TP53 genes in sporadic basal cell carcinomas. Br. J. Dermatol. 152, 43-51 (2005).
- Guha, M. Hedgehog inhibitor gets landmark skin cancer approval, but questions remain for wider potential. Nat. Rev. Drug Discov. 11, 257-258 (2012).
- Sekulic, A., et al. Efficacy and safety of vismodegib in advanced basal-cell carcinoma. N. Engl. J. Med. 366, 2171-2179 (2012).
- Tang, J. Y., et al. Inhibiting the hedgehog pathway in patients with the basal-cell nevus syndrome. N. Engl. J. Med. 366, 2180-2188 (2012).
- Aszterbaum, M., et al. Ultraviolet and ionizing radiation enhance the growth of BCCs and trichoblastomas in patched heterozygous knockout mice. Nat. Med. 5, 1285-1291 (1999).
- Pazzaglia, S., et al. Modulation of patched-associated susceptibility to radiation induced tumorigenesis by genetic background. Cancer Res. 64, 3798-3806 (2004).
- Athar, M., et al. Inhibition of smoothened signaling prevents ultraviolet B-induced basal cell carcinomas through regulation of Fas expression and apoptosis. Cancer Res. 64, 7545-7552 (2004).
- Mancuso, M., et al. Basal cell carcinoma and its development: insights from radiation-induced tumors in Ptch1-deficient mice. Cancer Res. 64, 934-941 (2004).
- Ellis, T., et al. Patched 1 conditional null allele in mice. Genesis. 36, 158-161 (2003).
- Mao, J., et al. A novel somatic mouse model to survey tumorigenic potential applied to the Hedgehog pathway. Cancer Res. 66, 10171-10178 (2006).
- Wang, G. Y., Wang, J., Mancianti, M. L., Epstein, E. H. Basal cell carcinomas arise from hair follicle stem cells in Ptch1(+/-) mice. Cancer Cell. 19, 114-124 (2011).
- Grachtchouk, M., et al. Basal cell carcinomas in mice arise from hair follicle stem cells and multiple epithelial progenitor populations. J. Clin. Invest. 121, 1768-1781 (2011).
- Kasper, M., et al. Wounding enhances epidermal tumorigenesis by recruiting hair follicle keratinocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 4099-4104 (2011).
- Youssef, K. K., et al. Identification of the cell lineage at the origin of basal cell carcinoma. Nat Cell Biol. 12, 299-305 (2010).
- Yauch, R. L., et al. Smoothened mutation confers resistance to a Hedgehog pathway inhibitor in medulloblastoma. Science. 326, 572-574 (2009).
- Buonamici, S., et al. Interfering with resistance to smoothened antagonists by inhibition of the PI3K pathway in medulloblastoma. Sci. Transl. Med. 2, 51ra70 (2010).
- Dijkgraaf, G. J., et al. Small molecule inhibition of GDC-0449 refractory smoothened mutants and downstream mechanisms of drug resistance. Cancer Res. 71, 435-444 (2011).
- Guo, Z., Draheim, K., Lyle, S. Isolation and culture of adult epithelial stem cells from human skin. J. Vis. Exp. (49), e2561 (2011).
- Li, L., Fukunaga-Kalabis, M., Herlyn, M. The three-dimensional human skin reconstruct model: a tool to study normal skin and melanoma progression. J. Vis. Exp. (54), e2937 (2011).
- Anacker, D., Moody, C. Generation of organotypic raft cultures from primary human keratinocytes. J. Vis. Exp. (60), e3668 (2012).
