Summary
Канцерогенеза представляет собой процесс, включающий взаимодействие между раковыми клетками и рак микросреды. Препарировать молекулярных событий, нужно изолировать различные клеточные популяции на разных этапах развития рака. Используя модель мыши для базально-клеточная карцинома, мы опишем протокол для сотовых анализы во время канцерогенеза.
Abstract
Рак развитие представляет собой многоступенчатый процесс с участием многих типах клеток, включая рак клеток-предшественников, иммунные клетки, фибробласты и эндотелиальные клетки. Каждый тип клеток подвергается сигнализации и функциональные изменения во время канцерогенеза. Актуальной задачей для многих исследователей рака, чтобы анализировать эти изменения в каждом типе клеток в течение нескольких этапов в естественных условиях. В последние несколько лет, авторы разработали набор процедур для изоляции различных популяций клеток кожи при развитии рака мышей K14creER/R26-SmoM2 YFP. Процедура разделена на шесть частей: 1) формирование соответствующей мышей исследования (K14creER + и R26-SmoM2 YFP + мышей в этом протоколе), 2) индуцирующий SmoM2 YFP выражение в кожу мыши, 3) подготовка биопсии кожи мыши; 4) выделение эпидермис от кожи; 5) подготовка отдельных клеток из эпидермиса, 6) маркировки одной популяции клеток для анализа потока цитометрии.Генерация достаточное количество мышей с генотипом право является предельным шагом в этом протоколе, который может занять до двух месяцев. Остальные шаги занять несколько часов до нескольких дней. В этом протоколе, мы также включить раздел для устранения неполадок. Хотя мы ориентируемся на рак кожи, этот протокол может быть изменен, чтобы подать заявку на других животных моделях заболеваний человека.
Introduction
Как наиболее распространенный тип рака у человека, базально-клеточная карцинома (BCC) страдают около 2 миллионов американцев в год 1. Накопленные данные показывают, что ненормальной активации Hedgehog (Hh) сигнализации является движущей силой развития, лежащих в основе BCC (обзор в 2,3). Изменения Hh сигнализации в BCCs включают мутации инактивируют PTCH1 4-6, избыточной функции мутации SMO 7-9, и аберрантная экспрессия Hh пути транскрипционных факторов GLI1 10 и 11 GLI2 или редкие мутации инактивированной отрицательной Су регулятора (Fu ) 12. В течение всех этих и других исследований, Федеральное лекарствами (FDA) недавно одобрила использование Hh сигнализации Vismodegib ингибитора для лечения метастатического и местно-распространенного BCCs 13-15.
Несмотря на все эти достижения 16, мы до сих пор не понимаю, молекулярные и клеточные механизмы, посредством которых Hh сигнализации приводит Carcinogenesis. Создание моделей с использованием животных тканеспецифические активации Hh сигнализации по-прежнему важна для этих исследований и для нашего понимания лекарственной устойчивостью. У мышей с мышами дикого типа не развиваются BCCs, даже при большой дозы канцерогенов, УФ или ионизирующего излучения. В противоположность этому, PTCH1 + / - мышей восприимчивы к развитию BCC 17,18. Пенетрантность BCC развития в PTCH1 + / - мышей составляет более 50%, хотя PTCH1 18,19 + / - мышей редко развиваются матерого BCCs если хранить в нормальных условиях. В связи с эмбриональной летальности PTCH1 - / -, тканеспецифические нокаут PTCH1 обычно используется для изучения 20. Кроме того, условные кожи конкретным выражением онкогенных SmoM2 YFP (Krt14-Creer: R26-SmoM2 YFP или Krt14-CRE: R26-SmoM2 YFP) приводит к образованию нескольких микроскопических BCCs в очень раннем возрасте, обеспечивая простой генетический анализ для Hh сигнализации делатьwnstream СМО 21.
Существуют три основных вопроса в наших знаниях о BCC биологии. Во-первых, сотовая BCCs происхождение не совсем ясно. Хотя некоторые исследования подтверждают сдвинуться с места из волосяного фолликула в качестве места стволовых клеток 22-24, Юсеф и др.. Локализовано 25 мышиные клетки кожного происхождения HH-управляемые опухолей, чтобы быть на межбанковском фолликулярной эпидермиса регионе, а не в волосяной фолликул , при использовании соты Cre активировать экспрессию Rosa26 управляемой трансгенных мутант SMO. Во-вторых, во время клеточных взаимодействий BCC развития не до конца понятны. Известно, что кератиноциты с активированным Hh сигнализации может привести к формированию BCCs, но и другие клеточные изменения не очень хорошо понял. Кроме того, лечение антагонистами Smo у мышей может привести к лекарственной устойчивости 26-28. Таким образом, для новых целей BCC крайне необходимы. Понимание этих трех вопросов требует анализа клеточных изменений у мышей во время carcinogenesis. Хотя некоторые методы были опубликованы на культуру кератиноцитов, проточной цитометрии и кожи стволовых клеток изоляции 29-31, там в настоящее время нет всеобъемлющих процедур для сотовых анализы в BCCs мыши. Комбинируя методы мышиной модели ВСС, отделение эпидермиса, генерация одиночных клеток из тканевых и клеточных анализах, мы будем обеспечить читателей набор процедур для изучения клеточной сигнализации, клеточные и молекулярные взаимодействия в течение BCC развития. Мы считаем, что этот протокол позволит читателям увидеть, как каждая процедура осуществляется. Кроме того, мы представили некоторые данные, чтобы проиллюстрировать то, что результаты должны выглядеть и устранения неполадок, чтобы помочь читателям в преодолении трудностей при выполнении этих процедур.
Protocol
Это исследование было одобрено Комитетом IACUC в Университете Индианы в Школе медицины.
1. Создание Мыши с правильными генотипы
- Создание модели мыши BCCs. K14-Mate Creer мышей (Jackson Laboratory инвентарный номер 005107) с R26-SmoM2 мышей YFP (Jackson Laboratory инвентарный номер 005130) (18), чтобы создать K14-Creer + и R26-SmoM2 YFP + мышей.
- Выполните генотипирования. Погрузите хвост образцов (0,5 см) в directPCR решение лизис хвост с 1 мг / мл протеиназы К при 55 ° С в течение ночи при встряхивании. На следующий день, снимите ткань мусора путем центрифугирования при максимальной скорости в микро-центрифуге (чтобы держать супернатант для генотипирования). Использование 1 мкл супернатанта для каждой реакции ПЦР с помощью праймеров и условий, рекомендуемых производителем. Выберите мышей с правом генотипов (в возрасте 3-6 недель, бупренорфин 0,05-0,1 мг / кг будет применяться через SQ каждые 8-12 часов в течение 2-3 дней после того, как хвост СНиП) FOR шаге 2.
2. Индуцируют экспрессию SmoM2 в кератиноциты кожи
Вызвать SmoM2 выражение в кератиноциты путем перорального введения тамоксифена (5 мкг / кг массы тела в 50 мл растительного масла в каждое кормление) в течение 5 дней подряд через желудочный зонд с иглой кормления (изогнутые 20 калибра).
3. Подготовка образцов кожи
В общем, фенотипы являются более серьезными, на ухо и хвост в K14creER/R26SmoM2 мышей GFP. Для подготовки к клетке анализа мы первый урожай кожи мышей после жертвоприношения животных с институциональными утвержденной процедуры (CO 2 плюс смещения шейных позвонков).
4. Изоляция Эпидермис
- После умерщвления мышей с утвержденной процедурой (см. шаг 3), снимите меха помощью триммера. Погрузить образцы кожи в диспаза раствор (5 мг / мл в DMEM с 10% FBS) при 37 ° С в течение 1-2 часов (1 час для мышей менее 8 недель и 2 часадля старых мышей, чем 8 недель).
- После диспазы лечения, отдельный эпидермис от дермы щипцов.
5. Создание отдельных клеток
- Для получения одной популяцией клеток, фарш эпидермиса ножницы и затем погружают в раствор коллагеназы IV (1 мг / мл в DMEM с 10% FBS) в течение 1-2 ч при 37 ° С в 50 мл пробирку. Попробуйте нежно вихревой трубы каждые 20 минут, чтобы помочь ячейке диссоциации.
- Осмотрите клетку диссоциации под микроскопом. Когда отдельные клетки могут быть обнаружены в коллагеназы среда, инкубировать образец в течение дополнительных 30 мин увеличить выход клеток. В общем, эпидермис от одной мыши может дать до 10 7 клеток.
- Фильтр ткани смесь через ячейки фильтра (размер пор 70 мкм), спин клетки вниз на 1500 оборотов в минуту с помощью настольного центрифугирования, и мыть один раз время с PBS.
6. Этикетка клетки и осуществляют анализ проточной цитометрии
- Ресуспендируют клеток в 10% FBSв PBS при 2,5 × 10 6 клеток / мл для блокирования неспецифического связывания (на льду в течение 30 мин)
- Возьмите аликвоту клеток к каждому из 1,5 мл пробирок для конкретных маркировки антителами. Добавить различные антитела в каждую пробирку при конечной концентрации 2 мкг / мл. Смешайте антител с клетками посредством нежных вершины в течение нескольких секунд и оставить их на льду в течение 30 мин, затем промыть 1 мл PBS. Для BCC образцов мы использовали антитела для следующих биомаркеров: CD11b-PE плюс Gr1-APC (миелоидных клеток миелоидного или полученные супрессоров); виментин-FITC (фибробластов) (см. реагентов для подробностей).
- Для внутриклеточного окрашивания, мы используем комплекта и следовать инструкциям поставщика (см. Реагенты для подробностей). Мы используем свежие клетки для анализа маркеров клеточной поверхности. После окрашивания поверхности маркером, мыть клетки, и ресуспендируйте их в PBS. Добавить DAPI в камеру смеси при конечной концентрации 1 мкг / мл. DAPI окрасит мертвые клетки, которые будут закрытого из дальнейшего анализа.
- Анализ данных с спецификацииС программным обеспечением. Мы сначала выбрать одну элементов на основе ФСБ против SSC сюжет, и использовать DAPI отрицательные населения (живые клетки) для дальнейшего анализа.
Representative Results
Известно, что у мышей, не развивается базально-клеточного рака за исключением Hh сигнализации активации. На рисунке 1 показана кожа фенотипа после индуцированной экспрессии онкогенного сглажена, SmoM2 YFP. 2 показан анализ миелоидных клеток в нормальных и мышей, имеющих опухоль. CD11b + Gr1 + клетки получают из миелоидных клеток, а некоторые из них миелоидный полученные супрессорных клеток. В нормальной ситуации, CD11b + + Gr1 клеточной популяции трудно обнаружить, но увеличится в ответ на воспаление или развития опухоли. Мы показали, что индуцированной экспрессии SmoM2YFP в коже приводит к увеличению в CD11b + Gr1 + клеток. В настоящее время, молекулярные механизмы, лежащие в основе этого изменения в BCCs не ясны.
Рисунок 1. Morphologicaл изменений после SmoM2YFP индукции в кожу мыши. Верхний показана схема мышь генотипов. Средняя панель: + K14creER и R26-SmoM2 YFP + мышь лечение тамоксифеном показал грубо аномалии в коже (справа), а также опухоли кожи в разделе H & E (слева). Нижняя панель: мышь без индукции SmoM2YFP показали нормальные вида кожи (справа) и не аномальную морфологию в H & E разделе (слева).
Рисунок 2. Анализа потоков CD11b + Gr1 + клеток. Для изучения изменения CD11b + Gr1 + клеток во время развития рака кожи, мы выделили отдельные клетки и окрашивали флуоресценции меченых антител к CD11b и Gr1. После анализа с FlowJo, мы заметили увеличение этой популяцией клеток в кожных тканях от тамоксифен мышей.
Discussion
Мы описали метод анализа клеточных популяций в ВСС. Опухолевые ткани соответствуют многих типов клеток, и каждый тип клеток ведет себя по-разному в данный момент времени канцерогенеза, который очень трудно вернуть даже при самых условиях в пробирке. Используя этот протокол, мы показали, что развитие базально-клеточного рака сопровождается расширением эпидермальных стволовых клеток, а также вербовку миелоидных клеток. По сравнению с иммуногистохимии или иммунофлуоресцентного анализа, анализа клеточной популяции дать более количественной оценки изменений клеточной популяции с специфических антител к различным типам клеток теперь доступны.
Для этого протокола, 10 недель, необходимых для завершения исследования, поскольку фенотипическое изменение гена от индукции требует времени. Таким образом, важно планировать эксперимент раньше времени. Для выделения ячейки и анализов, целых два дня могут быть необходимы. Поскольку живые клетки используются для AnalysES, важно, чтобы зарезервировать FACSCalibur загодя. Мы также перечислены проблемы, возникающие при работе с этим протоколом (см. ниже).
По нашему опыту, ниже приведены общие проблемы, с которыми мы столкнулись:
- Плохо разделения эпидермиса: Это может быть вызвано неполным лечения диспазы (увеличьте время лечения diapase) или недостаточное решение диспазы (кожа должна быть полностью погружена в раствор диспазы). Мы используем по крайней мере, 5 мл диспаза решение для одной мыши. Объем может варьироваться в зависимости от размера кожи.
- Низкий выход сотового телефона: Это может быть вызвано неполным расщеплением коллагеназы IV. Пожалуйста первой концентрации коллагеназы чек или срока годности. Это также может быть вызвано недостаточным количеством эпидермиса использованы. Кроме того, фермент пищеварения следует выполнять до 37 ° С с перемешиванием (пожалуйста отрегулируйте температуру перед выполнять пищеварения).
- Скопления клеток: Это очень распространенная для клеток кожи (пипеткой клеткинесколько раз, пройдя через фильтр (до центрифугирования), или существование Mg 2 + и Ca 2 + в растворе (пожалуйста, используйте Mg 2 + и Ca 2 +-Free для мобильного PBS стирка).
- Слишком много мертвых клеток: Это может быть результатом деградированных тканей (пожалуйста, используйте свежий тканей), или по-пищеварения (расширенная избежать инкубации с диспазы и коллагеназы IV).
Этот протокол может быть объединен с пересадкой костного мозга или трансплантации тканей для изучения клетки происхождения. Например, трансплантация GFP-экспрессирующих клеток костного мозга в летально облученных мышей позволит нам рассмотреть вклад клеток костного мозга к опухолеассоциированным фибробластов и миелоидных клеток. Кроме того, опухоли кожи можно пересадить в новый хозяин мыши, чтобы изучить опухоли хозяин взаимодействий.
Помимо изучения изменений клеточной популяции при канцерогенезе, этот протокол также позволит исследователям изучитьэффектов лекарственной терапии в клетки в опухоли среды. Хотя этот протокол предназначен для использования для анализа клеточной популяции во время канцерогенеза кожи, незначительные изменения могут быть сделаны для других типов рака.
Таким образом, популяция клеток анализы на мышиных моделях рака кожи может дать нам динамический клеточных изменений при канцерогенезе, что приводит к лучшему пониманию биологии клетки в опухолевую трансформацию и различных клеточных событий в процессе трансформации.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано NCI (R01-R01 и 94160-155086), IU Саймон онкологический центр и Wells Центр исследований в педиатрии.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| directPCR lysis reagent (tail) | Viagen Biotech | 102-T | store @ 4 °C |
| proteinase K | Sigma | P2308 | store @ -20 °C |
| ApliTag 360 taq polymerase | Applied biosystems | N8080155 | store @ -20 °C |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | store @ 4 °C |
| Feeding needle (20 gauge) | Fisher scientific | 01-290-9B | |
| Dispase | Roche Diagnostic | 04942078001 | store @ 4 °C |
| Collagenase IV | Worthington | LS004189 | store @ -20 °C |
| Cell strainer | Fisher scientific | 08-771-2 | |
| Anti-CD11b-PE | eBioscience | 12-0112-81 | store @ 4 °C |
| Anti-Gr1-APC | eBioscience | 17-5931-81 | store @ 4 °C |
| Anti-vimentin-FITC | eBioscience | 11-9897-80 | store @ 4 °C |
References
- Rogers, H. W., et al. Incidence estimate of nonmelanoma skin cancer in the United States. Arch. Dermatol. 146, 283-287 (2006).
- Epstein, E. H. Basal cell carcinomas: attack of the hedgehog. Nat. Rev. Cancer. 8, 743-754 (2008).
- Yang, L., Xie, G., Fan, Q., Xie, J. Activation of the hedgehog-signaling pathway in human cancer and the clinical implications. Oncogene. 29, 469-481 (2010).
- Johnson, R. L., et al. Human homolog of patched, a candidate gene for the basal cell nevus syndrome. Science. 272, 1668-1671 (1996).
- Hahn, H., et al. A mammalian patched homolog is expressed in target tissues of sonic hedgehog and maps to a region associated with developmental abnormalities. J. Biol. Chem. 271, 12125-12128 (1996).
- Hahn, H., et al. Mutations of the human homolog of Drosophila patched in the nevoid basal cell carcinoma syndrome. Cell. 85, 841-851 (1996).
- Xie, J., et al. Activating Smoothened mutations in sporadic basal-cell carcinoma. Nature. 391, 90-92 (1998).
- Reifenberger, J., et al. Missense mutations in SMOH in sporadic basal cell carcinomas of the skin and primitive neuroectodermal tumors of the central nervous system. Cancer Res. 58, 1798-1803 (1998).
- Lam, C. W., et al. A frequent activated smoothened mutation in sporadic basal cell carcinomas. Oncogene. 18, 833-836 (1999).
- Nilsson, M., et al. Induction of basal cell carcinomas and trichoepitheliomas in mice overexpressing GLI-1. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 3438-3443 (2000).
- Sheng, H., et al. Dissecting the oncogenic potential of Gli2: deletion of an NH(2)-terminal fragment alters skin tumor phenotype. Cancer Res. 62 (2), 5308-5316 (2002).
- Reifenberger, J., et al. Somatic mutations in the PTCH, SMOH, SUFUH and TP53 genes in sporadic basal cell carcinomas. Br. J. Dermatol. 152, 43-51 (2005).
- Guha, M. Hedgehog inhibitor gets landmark skin cancer approval, but questions remain for wider potential. Nat. Rev. Drug Discov. 11, 257-258 (2012).
- Sekulic, A., et al. Efficacy and safety of vismodegib in advanced basal-cell carcinoma. N. Engl. J. Med. 366, 2171-2179 (2012).
- Tang, J. Y., et al. Inhibiting the hedgehog pathway in patients with the basal-cell nevus syndrome. N. Engl. J. Med. 366, 2180-2188 (2012).
- Aszterbaum, M., et al. Ultraviolet and ionizing radiation enhance the growth of BCCs and trichoblastomas in patched heterozygous knockout mice. Nat. Med. 5, 1285-1291 (1999).
- Pazzaglia, S., et al. Modulation of patched-associated susceptibility to radiation induced tumorigenesis by genetic background. Cancer Res. 64, 3798-3806 (2004).
- Athar, M., et al. Inhibition of smoothened signaling prevents ultraviolet B-induced basal cell carcinomas through regulation of Fas expression and apoptosis. Cancer Res. 64, 7545-7552 (2004).
- Mancuso, M., et al. Basal cell carcinoma and its development: insights from radiation-induced tumors in Ptch1-deficient mice. Cancer Res. 64, 934-941 (2004).
- Ellis, T., et al. Patched 1 conditional null allele in mice. Genesis. 36, 158-161 (2003).
- Mao, J., et al. A novel somatic mouse model to survey tumorigenic potential applied to the Hedgehog pathway. Cancer Res. 66, 10171-10178 (2006).
- Wang, G. Y., Wang, J., Mancianti, M. L., Epstein, E. H. Basal cell carcinomas arise from hair follicle stem cells in Ptch1(+/-) mice. Cancer Cell. 19, 114-124 (2011).
- Grachtchouk, M., et al. Basal cell carcinomas in mice arise from hair follicle stem cells and multiple epithelial progenitor populations. J. Clin. Invest. 121, 1768-1781 (2011).
- Kasper, M., et al. Wounding enhances epidermal tumorigenesis by recruiting hair follicle keratinocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 4099-4104 (2011).
- Youssef, K. K., et al. Identification of the cell lineage at the origin of basal cell carcinoma. Nat Cell Biol. 12, 299-305 (2010).
- Yauch, R. L., et al. Smoothened mutation confers resistance to a Hedgehog pathway inhibitor in medulloblastoma. Science. 326, 572-574 (2009).
- Buonamici, S., et al. Interfering with resistance to smoothened antagonists by inhibition of the PI3K pathway in medulloblastoma. Sci. Transl. Med. 2, 51ra70 (2010).
- Dijkgraaf, G. J., et al. Small molecule inhibition of GDC-0449 refractory smoothened mutants and downstream mechanisms of drug resistance. Cancer Res. 71, 435-444 (2011).
- Guo, Z., Draheim, K., Lyle, S. Isolation and culture of adult epithelial stem cells from human skin. J. Vis. Exp. (49), e2561 (2011).
- Li, L., Fukunaga-Kalabis, M., Herlyn, M. The three-dimensional human skin reconstruct model: a tool to study normal skin and melanoma progression. J. Vis. Exp. (54), e2937 (2011).
- Anacker, D., Moody, C. Generation of organotypic raft cultures from primary human keratinocytes. J. Vis. Exp. (60), e3668 (2012).
