Summary
Karsinojenez kanser hücrelerinin ve kanser mikro arasındaki etkileşimi içeren bir süreçtir. Moleküler olayları incelemek için, bir kanser gelişimi boyunca farklı aşamalarda farklı hücre popülasyonu izole etmek gerekmektedir. Bazal hücreli karsinom için bir fare modeli kullanarak, kanser sırasında hücre analizleri için bir protokol açıklar.
Abstract
Kanser gelişimi kanser öncüsü hücreler, bağışıklık hücreleri, fibroblastlar ve endotel hücreleri gibi birçok hücre tipleri içeren bir çok adımlı bir işlemdir. Hücrelerin her tür kanser sırasında sinyalizasyon ve fonksiyonel değişikliklere uğrar. Birçok kanser araştırmacılar için geçerli zorluk in vivo çoklu adım süreci sırasında her bir hücre tipi bu değişiklikleri incelemek için. Son birkaç yıldır, yazarlar K14creER/R26-SmoM2 YFP fareler kullanarak deri kanseri gelişimi sırasında farklı hücre popülasyonlarının izole etmek için prosedürlerin bir dizi geliştirdik. Izole) 4, fare deri biyopsisi hazırlamak 3), fare deri 2) uyaran SmoM2 YFP ifade; çalışma için uygun fareler (K14creER + ve R26-SmoM2 YFP + Bu protokolde fareler) üreten) 1: Prosedür 6 bölüme ayrılmıştır deriden epidermis, 5) epidermis gelen tek hücre hazırlamak; 6) akım sitometri analizi için tek hücre popülasyonlarının etiketleme.Doğru genotip ile farelerin yeterli sayıda üretimi iki ay kadar sürebilir bu protokolde sınırlayıcı adımdır. Adım geri kalanı birkaç gün için birkaç saat sürebilir. Bu protokol kapsamında, biz de sorun giderme için bir bölüm içerir. Biz deri kanseri odaklanmak rağmen, bu protokolün insan hastalıklarının diğer hayvan modellerinde için başvuruda değiştirilebilir.
Introduction
Insan kanserinin en yaygın türü olarak, bazal hücreli karsinom (BHK) 1 yıl başına yaklaşık 2 milyon Amerikalı etkiler. Biriken deliller kirpi (Hh) sinyal bu anormal aktivasyonu göstermektedir BCC geliştirme (2,3 yorum) altında yatan itici güçtür. BCC içinde sinyal Hh içinde değişiklikler inaktive PTCH1 4-6 mutasyonlar, SMO 7-9 kazanç fonksiyon-mutasyonlar ve Hh yol transkripsiyon faktörleri GLI1 10 ve GLI2 11 veya negatif regülatörü Su nadir inaktive mutasyonlar (Fu sapkın ifade içerir ) 12. Tüm bu ve diğer çalışmalar sayesinde, Federal İlaç İdaresi (FDA) son zamanlarda BCC 13-15 metastatik ve lokal ileri tedavi etmek için Hh sinyal inhibitörü Vismodegib en kullanımını onayladı.
Tüm bu başarıları 16 rağmen, biz hala Hh sinyalizasyon carc sürücüler hangi moleküler ve hücresel mekanizmaları anlamıyoruminogenesis. Hh sinyal doku-spesifik aktivasyon kullanarak hayvan modelleri kurulması bu çalışmalar için ve ilaç direnci anlayışımız için hala önemlidir. Farelerde, wild-tip farelerden bile, kanserojen UV veya iyonlaştırıcı radyasyon ağır dozda altında, BCC gelişmez. Bunun aksine, Ptch1 + / - farenin BCC gelişimi 17,18 duyarlıdır. Normal şartlar altında muhafaza edilmesi durumunda fareler nadiren anaç BCC geliştirmek - Ptch1 içinde BCC gelişme penetranslı + / - Ptch1 + / rağmen fareler% 50 üzerinde 18,19 olduğunu. Ptch1 embriyonik öldürücülüğü bağlı olarak - / -, PTCH1 doku spesifik nakavt Çalışmada, genel olarak 20 için kullanılır. Buna ek olarak, onkojenik SmoM2 YFP (KRT14-Creer: R26-SmoM2 YFP veya KRT14-CRE: R26-SmoM2 YFP) koşullu cilt özgü ifade için kolay genetik test sağlayan, çok erken yaşta birden fazla mikroskobik BCC oluşumuna yol açar Hh sinyalizasyon yapmakSMO 21 wnstream.
BCC biyoloji bilgimiz üç büyük sorunlar vardır. İlk olarak, BCC ve hücresel kökeni tam olarak belli değil. Bazı çalışmalarda kök hücre sitesi 22-24 olarak saç folikülünün ödün desteği ise, Youssef ve ark. 25 saç kökü olarak, arası foliküler epidermis bölgesinde olduğu deri Hh odaklı tümörlerin kökenli fare hücre değil lokalize , bir ROSA26 odaklı transgenik mutant SMO ifade etkinleştirmek için hücre spesifik Cre kullanarak. BCC gelişimi sırasında İkincisi, hücresel etkileşimleri iyi anlaşılmış değildir. Bu aktif Hh sinyal ile keratinositlerin BCC oluşumuna yol açabilir bilinmektedir, ancak diğer hücresel değişiklikler well-anlaşılamamıştır. Ayrıca, farelerde SMO antagonistlerinin tedavi ilaç direnci 26-28 yol açabilir. BCC için böylece yeni hedefler büyük ölçüde ihtiyaç vardır. Bu üç konu anlamak Carcinog sırasında farelerde hücresel değişikliklerin analizleri gerektirirEnesis. Çeşitli yöntemler keratinosit kültürü, akım sitometri ve cilt kök hücre izolasyonu 29-31 için yayınlanmış olsa da, fare BCC hücre analizi için kapsamlı bir prosedürler bulunamamıştır. BCC fare modeli, epidermis ayrılması, doku ve hücre analizlerden tek hücre üretimi için yöntemleri birleştirerek, BCC gelişimi sırasında hücre sinyal, hücresel ve moleküler etkileşimleri çalışmak için prosedürlerin bir dizi ile okuyucuların sağlayacaktır. Bu protokol okuyucular her bir işlem gerçekleştirilir nasıl görmek için izin inanıyoruz. Ayrıca, sonuçlar nasıl olması gerektiğini göstermek için bazı veriler elde ve okuyucular bu işlemler yerine sırasında zorlukların üstesinden gelmek için yardımcı olmak için sorun giderme.
Protocol
Bu çalışma Tıp Indiana Üniversitesi de IACUC Komitesi tarafından onaylanmıştır.
1. Doğru Genotiplerinin ile Fare oluşturun
- BCC bir fare modeli oluşturulması. R26-SmoM2 YFP fareler (Jackson laboratuvar stok numarası 005.130) (18) ile arkadaşı K14-CreER fareler (Jackson laboratuvar stok numarası 005.107) K14-Creer + ve R26-SmoM2 YFP + fareler üretmek için.
- Genotiplendirme gerçekleştirin. 1 mg / ml proteinaz K ile directPCR kuyruk lizis çözeltisi içinde bırakın kuyruk örnekleri (0.5 cm uzunluğunda), 55 ° C de çalkalanarak gece boyunca karıştırıldı. Sonraki gün, (genotipleme için supernatant tutmak için), bir mikro-santrifüj en yüksek hızda santrifüj ile doku çöküntüsü ortadan kaldırmak. Satıcı tarafından tavsiye edilen primerler ve koşullar her PCR reaksiyonu için süpernatan 1 ul kullanımı. Doğru genotipler (3-6 hafta yaş, 0.05-0.1 de buprenorfin de mg / kg kuyruk kelepir sonra 2-3 gün SQ her 8-12 saat ile uygulanacaktır) fo ile farelerin seçinr adım 2.
2. Cilt Keratinositler içinde SmoM2 ifadesi neden
, Bir beslenme iğnesi (20 çap kavisli), oral gavaj yoluyla 5 gün arka arkaya tamoksifen (her bir besleme bitkisel yağ, 50 ml 5 ug / kg vücut ağırlığı), oral yolla, keratinositlerde SmoM2 indüke.
3. Cilt Örnekler hazırlanması
Genel olarak, fenotipleri K14creER/R26SmoM2 GFP farelerde kulak ve kuyruk daha şiddetli. Hücre analiz için hazırlamak için, öncelikle kurumsal Onaylanan prosedür (CO 2 artı servikal dislokasyon) ile hayvan kurban sonra fare deri hasat.
4. Epidermis izole
- Onaylanmış bir işlem (adım 3) ile kurban fareler sonra, bir düzenleyici kullanarak kürk çıkarın. 37 dispaz çözeltisi (% 10 FBS ile DMEM içinde 5 mg / ml), 1-2 ° saat (en az 8 haftalık ve 2 saat için farenin C'de 1 saat boyunca daldırın deri örneği) 8 haftadan daha eski fareler için.
- Ardından dispase tedavi, forseps ile dermis ayrı epidermis.
5. Tek Hücreler oluşturmak
- Tek bir hücre popülasyonu elde etmek için, bir 50 ml tüp içinde 37 ° C'de 1-2 saat boyunca kollajenaz IV çözeltisi (% 10 FBS ile DMEM içinde, 1 mg / ml) içine daldırın ardından makas ile epidermis ve kıyma. Yavaşça girdap tüpler hücre disassociation yardımcı olmak için her 20 dakika çalışın.
- Mikroskop altında hücre disassociation kontrol edin. Tek hücre kolajenaz ortam içinde tespit edilebilir, hücre verimi artırmak için ek bir 30 dakika boyunca numune inkübe edin. Genel olarak, bir fare, epidermis 7 hücreleri 10 kadar verim olabilir.
- Tezgah üstü santrifüj ile 1500 rpm hücre süzgecinden (gözenek boyutu 70 mikron), spin hücreleri dokuya karışımı aşağı filtre ve PBS ile zaman bir kez yıkayın.
6. Etiket Hücreler ve Sitometrisi Analizleri yapın
- % 10 FBS içinde yeniden süspanse hücreleriPBS içinde 2.5 x 10 6 hücre / spesifik olmayan bağlanmasını bloke etme ml 'de (buz üzerinde 30 dakika süre ile)
- Belirli bir antikor etiketlemesi için 1.5 ml'lik mikrotüp içinde her bir hücre porsiyonunun al. 2 ug / ml 'lik bir son konsantrasyonda her bir tüp için farklı antikor ekleyin. Birkaç saniye boyunca hafif bir tepe noktası ile hücreleri ile antikor karıştırın ve 1 ml PBS ile yıkamak, ardından 30 dakika boyunca buz üzerinde bırakın. , Vimentin-FITC (fibroblast) (ayrıntılar için reaktif bakınız) CD11b-PE artı Gr1-APC (miyeloid hücreleri veya myeloid kökenli baskılayıcı hücreler): BCC örnekler için, aşağıdaki biyolojik için antikorlar kullanılır.
- Hücre içi boyama için, bir kit kullanımı ve (ayrıntılar için Reaktifler bakınız) satıcının el izleyin. Biz hücre yüzey belirteçleri analiz etmek için taze hücreleri kullanır. Yüzey işaretleyici boyama sonra, hücreleri yıkayın ve PBS içinde onları tekrar süspansiyon. 1 ug / ml 'lik bir nihai konsantrasyonda hücre karışımı DAPI ekleyin. DAPI daha analizlerden kapılı çıkacak ölü hücreleri leke olacaktır.
- Specifi verileri analizc yazılım. Biz ilk FSC vs SSC arsa dayalı tek hücreleri seçin, ve daha fazla analiz için DAPI negatif nüfus (canlı hücreler) kullanın.
Representative Results
Bu farenin Hh sinyal aktivasyon haricinde bazal hücreli karsinom, gelişmez bilinmektedir. Şekil 1, düzeltilir onkojenik arasında uyarılan ekspresyonu, aşağıdaki cilt fenotipi SmoM2 YFP. Şekil 2, normal ve Tümör taşıyan farelerde miyeloid hücrelerin analizini gösterir gösterir. CD11b + Gr1 + hücreler miyeloid hücrelerden elde edilir, ve bazıları elde baskılayıcı hücreler miyeloid vardır. Normal durumda, CD11b + Gr1 + hücre popülasyonu pek saptanabilir, ancak iltihap veya tümör gelişimine yanıt olarak artacaktır. Biz CD11b + Gr1 + hücrelerinde bir artışa deri sonuçlarında SmoM2YFP bu uyarılan ekspresyonu gösterdi. Şu anda, BCC bu değişimin altında yatan moleküler mekanizma tam olarak bilinmemektedir.
Şekil 1. Morphologicafare deri SmoM2YFP indüksiyon sonrası L değişir. iyi fare genotip bir şematik görüntüsünü gösterir. Orta panel: tamoksifen ile tedavi K14creER + ve R26,-SmoM2 YFP ve fare H & E bölümünde ağır deride anormallik (sağ) yanı sıra deri tümörleri (sol) göstermiştir. Alt panel: fare SmoM2YFP indüksiyon olmadan normal görünümlü bir cilt (sağda) ve H & E bölümü (solda) herhangi bir anormal morfoloji gösterdi.
Şekil 2. CD11b + Gr1 + hücrelerin Akış analizi. Cilt kanseri gelişimi sırasında CD11b + Gr1 + hücrelerinin değişimi incelemek için, CD11b ve Gr1 için floresan etiketli antikorlar ile tek hücre ve lekeli izole. FlowJo ile analiz sonra, tamoksifen ile tedavi edilen farelerden alınan cilt dokusunda Bu hücre popülasyonunun bir artış olduğunu fark.
Discussion
Biz BCC hücre nüfusu analizi için bir yöntem tanımlanmıştır. Tümör dokusu birçok hücre tipleri tutarlı ve her hücre tipi in vitro koşullarda en iyi altında bile yeniden ele geçirmek için çok zor olan, kanser belirli bir zamanda farklı davranır. Bu protokol kullanarak, bazal hücreli karsinom gelişimi epidermal kök hücrelerin genişlemesi hem de miyeloid hücrelerin işe eşlik gösterdi. Immünohistokimya veya immünofloresan analiz ile karşılaştırıldığında, hücre popülasyonunu analiz hücre tipleri, çeşitli antikorlar mevcut olduğu için spesifik hücre popülasyonunun değişikliklerin daha nicel bir değerlendirme vermek mevcuttur.
Gen indüksiyon gelen fenotipik değişim zaman gerektirir, çünkü bu protokolü için, 10 hafta çalışma tamamlamak için ihtiyaç vardır. Bu vaktinden deneme planı bu nedenle önemlidir. Hücre izolasyonu ve analizler için, iki tam gün gerekli olabilir. Canlı hücrelerin analizi çalışan kullanıldığı içines, vaktinden önce bir FACSCalibur rezerv önemlidir. Bu protokol (bkz. aşağıda) ile çalışırken biz de ortak sorunları listeledik.
Bizim tecrübelerimize göre, aşağıda karşılaştığımız ortak sorunları şunlardır:
- Epidermisin Poor ayrılması: Bu eksik dispase tedavi (diapase tedavi süresini artırmak Lütfen) veya yetersiz dispase çözüm (cilt tamamen dispase çözüm dalmış gereken) neden olabilir. Biz bir fare dispaz çözeltisinin en az 5 ml kullanın. Hacim cilt boyutuna göre değişebilir.
- Kollajenaz IV eksik sindirim nedeniyle bu olabilir: hücre sayısı düşük verim. Ilk onay kollajenaz konsantrasyon veya son kullanma tarihi olun. Bu, aynı zamanda el epidermis yetersiz miktarda neden olabilir. Ayrıca, enzim sindirimi ° C (sindirim gerçekleştirmeden önce sıcaklığını ayarlamak lütfen) sallayarak ile 37 için yapılmalıdır.
- Hücre kümeleri: Bu (cilt hücreleri için pipet hücreleri çok yaygındırbirkaç kez süzgeç (santrifüj önce), veya Mg 2 varlığı geçtikten sonra + ve Ca 2 + çözüm (Mg 2 kullanın hücre yıkama için + ve Ca 2 + ücretsiz PBS).
- Çok fazla ölü hücreleri: Bu (taze dokular kullanın) bozulmuş dokuların bir sonucu olabilir, ya da olabilir aşırı sindirim (dispase ve kollajenaz IV ile uzun kuluçka kaçının).
Bu protokol, kemik iliği transplantasyonu ve hücre kökenli incelemek için doku nakli ile kombine edilebilir. Örneğin, bir organ nakli GFP-ifade ölümcül ışınlanmış farenin Kemik iliği hücreleri bize tümörle ilişkili fibroblastlar ve miyeloid hücreler, kemik iliği hücrelerinin katkısını incelemek için izin verir. Benzer şekilde, deri tümörleri tümör-konak etkileşimleri incelemek için yeni bir fare ev sahibi naklediliyor olabilir.
Karsinogenezis sırasında hücre popülasyonu değişiklikleri incelemek ek olarak, bu protokol aynı zamanda araştırmacılar incelemek sağlayacaktümör ortamında hücrelere ilaç tedavilerinin etkilerini. Bu protokol cilt sırasında hücre popülasyonu analiz için kullanmak için tasarlanmış olsa da kanser, küçük değişiklikler diğer kanser türleri için yapılabilir.
Özet olarak, cilt kanseri fare modellerinde hücre popülasyonu analizler neoplastik dönüşüm hücre biyolojisi daha iyi bir anlayış yol açan kanser sırasında dinamik hücresel değişiklikler ve dönüşüm sürecinde farklı hücresel olayları verebilir.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.
Acknowledgments
Bu çalışma, NCI (R01-94160 ve R01-155086), IU Simon Kanser Merkezi ve Pediatrik Araştırma Wells Merkezi tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| directPCR lysis reagent (tail) | Viagen Biotech | 102-T | store @ 4 °C |
| proteinase K | Sigma | P2308 | store @ -20 °C |
| ApliTag 360 taq polymerase | Applied biosystems | N8080155 | store @ -20 °C |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | store @ 4 °C |
| Feeding needle (20 gauge) | Fisher scientific | 01-290-9B | |
| Dispase | Roche Diagnostic | 04942078001 | store @ 4 °C |
| Collagenase IV | Worthington | LS004189 | store @ -20 °C |
| Cell strainer | Fisher scientific | 08-771-2 | |
| Anti-CD11b-PE | eBioscience | 12-0112-81 | store @ 4 °C |
| Anti-Gr1-APC | eBioscience | 17-5931-81 | store @ 4 °C |
| Anti-vimentin-FITC | eBioscience | 11-9897-80 | store @ 4 °C |
References
- Rogers, H. W., et al. Incidence estimate of nonmelanoma skin cancer in the United States. Arch. Dermatol. 146, 283-287 (2006).
- Epstein, E. H. Basal cell carcinomas: attack of the hedgehog. Nat. Rev. Cancer. 8, 743-754 (2008).
- Yang, L., Xie, G., Fan, Q., Xie, J. Activation of the hedgehog-signaling pathway in human cancer and the clinical implications. Oncogene. 29, 469-481 (2010).
- Johnson, R. L., et al. Human homolog of patched, a candidate gene for the basal cell nevus syndrome. Science. 272, 1668-1671 (1996).
- Hahn, H., et al. A mammalian patched homolog is expressed in target tissues of sonic hedgehog and maps to a region associated with developmental abnormalities. J. Biol. Chem. 271, 12125-12128 (1996).
- Hahn, H., et al. Mutations of the human homolog of Drosophila patched in the nevoid basal cell carcinoma syndrome. Cell. 85, 841-851 (1996).
- Xie, J., et al. Activating Smoothened mutations in sporadic basal-cell carcinoma. Nature. 391, 90-92 (1998).
- Reifenberger, J., et al. Missense mutations in SMOH in sporadic basal cell carcinomas of the skin and primitive neuroectodermal tumors of the central nervous system. Cancer Res. 58, 1798-1803 (1998).
- Lam, C. W., et al. A frequent activated smoothened mutation in sporadic basal cell carcinomas. Oncogene. 18, 833-836 (1999).
- Nilsson, M., et al. Induction of basal cell carcinomas and trichoepitheliomas in mice overexpressing GLI-1. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 3438-3443 (2000).
- Sheng, H., et al. Dissecting the oncogenic potential of Gli2: deletion of an NH(2)-terminal fragment alters skin tumor phenotype. Cancer Res. 62 (2), 5308-5316 (2002).
- Reifenberger, J., et al. Somatic mutations in the PTCH, SMOH, SUFUH and TP53 genes in sporadic basal cell carcinomas. Br. J. Dermatol. 152, 43-51 (2005).
- Guha, M. Hedgehog inhibitor gets landmark skin cancer approval, but questions remain for wider potential. Nat. Rev. Drug Discov. 11, 257-258 (2012).
- Sekulic, A., et al. Efficacy and safety of vismodegib in advanced basal-cell carcinoma. N. Engl. J. Med. 366, 2171-2179 (2012).
- Tang, J. Y., et al. Inhibiting the hedgehog pathway in patients with the basal-cell nevus syndrome. N. Engl. J. Med. 366, 2180-2188 (2012).
- Aszterbaum, M., et al. Ultraviolet and ionizing radiation enhance the growth of BCCs and trichoblastomas in patched heterozygous knockout mice. Nat. Med. 5, 1285-1291 (1999).
- Pazzaglia, S., et al. Modulation of patched-associated susceptibility to radiation induced tumorigenesis by genetic background. Cancer Res. 64, 3798-3806 (2004).
- Athar, M., et al. Inhibition of smoothened signaling prevents ultraviolet B-induced basal cell carcinomas through regulation of Fas expression and apoptosis. Cancer Res. 64, 7545-7552 (2004).
- Mancuso, M., et al. Basal cell carcinoma and its development: insights from radiation-induced tumors in Ptch1-deficient mice. Cancer Res. 64, 934-941 (2004).
- Ellis, T., et al. Patched 1 conditional null allele in mice. Genesis. 36, 158-161 (2003).
- Mao, J., et al. A novel somatic mouse model to survey tumorigenic potential applied to the Hedgehog pathway. Cancer Res. 66, 10171-10178 (2006).
- Wang, G. Y., Wang, J., Mancianti, M. L., Epstein, E. H. Basal cell carcinomas arise from hair follicle stem cells in Ptch1(+/-) mice. Cancer Cell. 19, 114-124 (2011).
- Grachtchouk, M., et al. Basal cell carcinomas in mice arise from hair follicle stem cells and multiple epithelial progenitor populations. J. Clin. Invest. 121, 1768-1781 (2011).
- Kasper, M., et al. Wounding enhances epidermal tumorigenesis by recruiting hair follicle keratinocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 4099-4104 (2011).
- Youssef, K. K., et al. Identification of the cell lineage at the origin of basal cell carcinoma. Nat Cell Biol. 12, 299-305 (2010).
- Yauch, R. L., et al. Smoothened mutation confers resistance to a Hedgehog pathway inhibitor in medulloblastoma. Science. 326, 572-574 (2009).
- Buonamici, S., et al. Interfering with resistance to smoothened antagonists by inhibition of the PI3K pathway in medulloblastoma. Sci. Transl. Med. 2, 51ra70 (2010).
- Dijkgraaf, G. J., et al. Small molecule inhibition of GDC-0449 refractory smoothened mutants and downstream mechanisms of drug resistance. Cancer Res. 71, 435-444 (2011).
- Guo, Z., Draheim, K., Lyle, S. Isolation and culture of adult epithelial stem cells from human skin. J. Vis. Exp. (49), e2561 (2011).
- Li, L., Fukunaga-Kalabis, M., Herlyn, M. The three-dimensional human skin reconstruct model: a tool to study normal skin and melanoma progression. J. Vis. Exp. (54), e2937 (2011).
- Anacker, D., Moody, C. Generation of organotypic raft cultures from primary human keratinocytes. J. Vis. Exp. (60), e3668 (2012).
