Summary
In diesem Video zeigen wir Ihnen, wie die elektrische Aktivität von einzelnen Neuronen identifiziert in einer ganzen Gehirn Vorbereitung, die komplexe neuronale Schaltkreise bewahrt aufzeichnen. Wir verwenden transgene Fische in der Gonadotropin-Releasing-Hormon (GnRH) Neuronen genetisch mit einem fluoreszierenden Protein zur Identifikation der intakten Zubereitung markiert sind.
Abstract
Das Verständnis der Zellphysiologie von neuronalen Schaltkreise, die komplexe Verhalten regulieren stark verbessert, indem Modellsystemen in denen diese Arbeiten in einer intakten Zubereitung bei der neuronalen Schaltkreise des ZNS intakt durchgeführt werden kann. Wir verwenden transgene Fische in dem Gonadotropin-Releasing-Hormon (GnRH) Neuronen genetisch mit dem grün fluoreszierenden Protein für die Identifizierung im intakten Gehirn sind verschlagwortet. Fische haben mehrere Populationen von GnRH Neuronen und ihre Funktionen sind abhängig von ihrer Lage im Gehirn und dem GnRH-Gen, dass sie 1 auszudrücken. Wir haben unsere Demonstration am GnRH3 Neuronen in den Terminal Nerven (TN) mit den Riechkolben mit dem intakten Gehirn von transgenen Medaka Fisch (Abbildung 1B und C) verbunden befindet konzentriert. Studien zeigen, dass Medaka TN-GnRH3 Neuronen neuromodulatory sind, als ein Sender von der externen Umgebung des zentralen Nervensystems; they spielen keine direkte Rolle bei der Regulierung der Hypophysen-Gonaden-Funktionen, wie auch die bekannte Hypothalamus GNRH1 Neuronen 2, 3. Das Tonikum Muster der spontanen Aktionspotentiale Abfeuern von TN-GnRH3 Neuronen eine intrinsische Eigenschaft 4-6, die Frequenz von denen durch visuelle Hinweise von Artgenossen 2 und dem Neuropeptid kisspeptin 1 5 moduliert. In diesem Video, verwenden wir eine stabile Linie von transgenen Medaka in dem TN-GnRH3 Neuronen exprimieren ein Transgen enthält die Promotor-Region des Gnrh3 verknüpft enhanced green fluorescent protein 7, Ihnen zu zeigen, wie man Neuronen identifizieren und überwachen ihre elektrische Aktivität im gesamten Gehirns Zubereitung 6.
Protocol
1. Präparation der Gehirne von Adult Medaka
- Anesthetize erwachsenen männlichen oder weiblichen (Abbildung 1A) durch Eintauchen in 5 ml MS-222 (150 mg / L, pH 7,4); warten Sie ein paar Minuten nach der Kiemen Bewegungen vor enthaupten aufgehört. Alle Verfahren wurden von der Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss der University of California-Los Angeles genehmigt.
- Enthaupte den Fisch in Fisch Kochsalzlösung am kaudalen Ende des Verschlusses mit einer Schere in einer 60-mm-Petrischale.
- Übertragen Fischkopf zu einer 35-mm-Durchmesser Petrischale, halb Fisch mit Kochsalzlösung gefüllt und innen mit Sylgard, die eine Vertiefung in sie zu positionieren und sichern den Kopf für Gehirnsezierung hat. Position und sichern Sie den Kopf dorsal-Seite mit Insekten Pins.
- Schneiden Sie vorsichtig die dorsale Teil des Schädels um ihren Umfang mit einer feinen Schere und entfernen Sie sie vorsichtig mit einer Pinzette, Aussetzen der dorsale Teil des Gehirns vollständig einschließlich der vordere Teil des Rückenmarks. <li> Heben Sie das Rückenmark vorsichtig mit feinen Spitze Zange durchtrennen und die bilateralen Binde Nerven mit spitzen Schere: Hirnnerven, Spinalnerven und Sehnerven an der Bauchseite des Gehirns, und die olfaktorischen Nerven am vorderen Teil des das Gehirn.
- Setzen Sie den vollständig seziert Gehirn in einer frischen Petrischale mit Fisch Kochsalzlösung gefüllt, und überprüfen Sie sorgfältig unter die Lupe, um sicherzustellen, das ganze Gehirn intakt ist (einschließlich der Hypophyse) ohne Schnitte oder Einstiche. Beschädigte Gehirne sind nicht für Experimente verwendet.
2. Montage des Gehirn in einem Recording Kammer
- Setzen Sie einen kleinen Tropfen Sekundenkleber oder andere schnell wirkende Kleber mit einer Nadel in der Mitte der Aufnahme Kammer und verteilt den Kleber etwa 1 cm 2.
- Schnell das Gehirn übertragen und kleben Sie es in einem ventral-Seite nach oben.
- 1 ml Kochsalzlösung Fisch so dass sie die Aufnahme Kammer füllt und deckt das Gehirn. Kontinuierlich perfundierendas Gehirn mit belüfteten Fisch Kochsalzlösung mit einer Geschwindigkeit von mindestens 200 ml / min.
- Mit der feinen Spitze-Pinzette vorsichtig die Hirnhäute über die Oberfläche der Aufnahme Bereich des Gehirns.
3. Elektrophysiologie
- Lose Patch Aufnahme von Aktionspotential Brennen
- Glas-Mikroelektroden (6-10 MQ) werden aus Borosilikatglas Pipetten (1B150F-4, World Precision Instruments) unter Verwendung einer Elektrode Abzieher (z. B. Sutter P-87) gebaut, und zurück mit dem losen-patch Recording-Lösung auf halber Höhe der gefüllte Elektrode.
- Verwendung eines aufrecht Fluoreszenzmikroskop mit einem gekühlten charge-coupled device (CCD)-Kamera, um den GFP-exprimierenden TN-GnRH3 Neuronen durch 10x (1B), dann 40x Wasserimmersionsobjektiven (Abbildung 1C). Sie werden an oder nahe der ventralen Oberfläche der Riechkolben, knapp vor dem telencephalon entfernt.
- Wechseln Sie zu einem Video-Monitor, bietetEchtzeit-Bilder aus dem Mikroskop, um den TN-GnRH3 Neuron Cluster (Abbildung 1C) zu lokalisieren.
- Positionieren der Mikroelektrode in das Bad, so daß die Spitze der Elektrode über dem Neuron Ziel ist. Bewerben konstanten leichten Überdruck der Mikroelektroden, so dass sie nicht verstopft werden, und sanft nähern sich dem Ziel Neuron mit der Spitze der Elektrode.
- Überprüfen und überwachen die Elektrode Widerstand in Voltage-Clamp-Modus mit AxoGraph Software und Verstärker Axoclamp 200B mit Axograph Software (Axon Instruments). Wenn man von dem Videomonitor, dass die Spitze der Elektrode auf der Oberfläche des Neurons und der AxoGraph Anzeige, dass der Widerstand leicht ändert, lassen Sie die Überdruck und mit leichtem Unterdruck, wenn notwendig, einen niedrigen Widerstand Siegel machen das Neuron (<100 M).
- Wechseln Sie zu Current-Clamp-Modus, und notieren Sie die Membran Spannung kontinuierlich ohne Strom-Eingang, Einstellung der Waageder Spannung und der Geschwindigkeit der Aufnahme, wenn nötig. Die Daten werden gesammelt und durch Powerlab Software (ADInstruments Inc.) analysiert.
- Nimm Baseline elektrische Aktivität in normalen Fisch Kochsalzlösung für ca. 5 min vor jeder Behandlung (Abbildung 2A). Bath Perfusion von Arzneimitteln, Hormonen, Peptiden, etc. zugegeben, um Fisch Kochsalzlösung weiterhin mit einer Rate von 200 ml / min, durch eine Auswaschung in normale Fische Kochsalzlösung 5, 6, 11 gefolgt.
- Whole cell recording des Membranpotentials
Die gesamte Patch-Clamp-Elektrophysiologie Verfahren ist das gleiche wie das der extrazellulären lose Patch Aufnahme oben beschriebenen Verfahren aus den Schritten 3.1.1 - 3.1.4. Dann werden die Verfahren entsprechend abweichen:- Überprüfen und überwachen die Elektrode Widerstand in Voltage-Clamp-Modus. Wenn man von dem Videomonitor, dass die Spitze der Elektrode auf der Oberfläche des Neurons und der auf dem Oszilloskop ist, dass sich der Widerstand leicht freigeben positiveDruck und gelten ein wenig Unterdruck auf einen hohen Widerstand Siegel auf dem Neuron (~ 3 Giga Ω) zu machen. Bewerben sanfte Saugwirkung durch den Mund zu zerreißen die gepatchte Membran, du wirst einen plötzlichen Abfall des Widerstandes auf etwa 120-250 MOhm sehen.
- Wechseln Sie zu Current-Clamp-Modus, und notieren Sie die Membran Spannung kontinuierlich ohne Stromaufnahme, die Anpassung der Skala von Spannung und Geschwindigkeit der Aufnahme, wenn nötig.
- Nimm Baseline elektrische Aktivität in normalen Fisch Kochsalzlösung für ca. 5 min vor jeder Behandlung, wie oben in 3.1.7 (2B) beschrieben.
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Representative Results
Ein Beispiel für bilaterale Cluster von GFP-markierten TN-GnRH3 Neuronen aus dem Gehirn herausgeschnitten Medakafisches sind in den 1B und 1C gezeigt. Jeder Cluster enthält etwa 8-10 GnRH Neuronen. Die spontanen neuronalen Aktivitäten des Ziel-TN-GnRH3 wurden in Current-Clamp-Modus (I = 0) mit typischen Feuerraten von 0,5-6 Hz aufgezeichnet. Das Muster der Aktionspotential Brennen ist typischerweise ein Tonic oder gegen Muster, mit einer ziemlich regelmäßigen Interspike Intervall. Probe Spuren sind in Abbildung 2 (:;: whole-cell 2B loose-Patch 2A) gezeigt.
Dieser experimentelle Ansatz ist auch in der Aufnahme von GFP-markierten GnRH Neuronen im Vorderhirn von erwachsenen Zebrafisch (3A und 3B) befindet erfolgreich. Neuron elektrische Aktivität im ausgeschnitten, intakten wurde in ähnlicher Art und Weise aufgezeichnet, wie oben in Medaka durch Lösen Patch (3C) und whole-cell recording beschrieben ( 
Abbildung 1. Tiermodell für die TN-GnRH3 Neuron Studie in diesem Video verwendet A: Adult medaka GnRH3: GFP transgenen Fischen, links: männlich, rechts:.. Weibliche B: Konfokale Bild des ventralen Ansicht des Vorderhirns. OB: Riechkolben, TN: Klemme Nerv GnRH3 Neuronen; TELE: telencephalon; ON:. Sehnerv C: Hohe Vergrößerung von TN-GnRH3 Neuronen im weißen Kasten Feld B (Skala angezeigt wird: A: 5 mm, B: 100 um; C: 20 um). 
Abbildung 2. Spontaneous Aktionspotentiale von TN-GnRH3 Neuronen im Current-Clamp-Modus (I = 0) aufgezeichnet A: Beispiel Spur von losen-patch-Aufnahme, B:. Probe Spuren von whole-cell-Aufnahme. 
Abbildung 3. Aufzeichnung von GnRH3: EMD (Smaragd grün fluoreszierendes Protein) Neuronen-Aktivität aus intakten Gehirn Vorbereitung der erwachsenen transgenen Zebrafisch 9 mit dem gleichen experimentellen Ansatz wie für die Zubereitung beschrieben medaka Gehirn A:. GnRH3: EMD Neuronen im ventralen Telencephalon (VT) und befindet präoptischen . Umgebung (POA) in Vorderhirn von erwachsenen Zebrafisch B: GnRH3: EMD Neuronen im Hypothalamus (HYPO) gelegen. Maßstab Bars: 100 um C:. Probe Spur von loose-Patch Aufnahme von GnRH3: EMD Neuron inVT D:. Probe Spur von whole-cell Patch Aufnahme von VT.
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Discussion
GnRH 3: GFP transgenen Fische bieten einzigartige Modelle, die neurophysiologischen Mechanismen neuronaler Integration und Regulierung in zentralen Steuerung von Verhaltensweisen, die sowohl direkt als auch indirekt in der Reproduktion 3, 8-10 beteiligt sind studieren. Einer der wesentlichen Vorteile dieses Modells besteht darin, dass viele GnRH3 Neuronen, die GFP in der Nähe der ventralen Oberfläche des Gehirns sind, so dass für relativ einfachen Zugang zu den Neuronen für elektrophysiologische Aufzeichnung ohne Unterbrechung neuronalen Schaltkreisen 6, 9, 11, 12 (Abb. 1B und 1C, 3A und 3B). In diesem Video haben wir beide locker-patch und Ganzzellableitungen von TN-GnRH3 Neuronen im intakten Gehirn von Erwachsenen von Medakafisches gezeigt. TN-GnRH3 Neuronen weisen eine Tonic oder schlagen Muster der spontanen Aktionspotentiale feuern mit einer Frequenz von 0,5-6Hz.There gab keine nachweisbare Geschlechtsunterschiede in spontanen FeuernRate 5, aber es gab dramatische Veränderungen in der Entwicklung GnRH3 Neuron elektrischen Aktivitäten während der Embryogenese 9. Lose-patch und whole-cell Elektrophysiologie haben unterschiedliche methodische Vor-und Nachteile. Lose-patch ist technisch einfacher als whole-cell-Aufnahme, sondern zeigt nur das Neuron Zündmuster und Frequenz. Auf der anderen Seite kann whole-cell recording bieten viel mehr Informationen: Ruhemembranpotenzial, Brennen Muster und Frequenz Aktion Potenzialanalyse, Membran-Kapazität und Widerstand. Weil loose-Patch Aufnahme nicht bricht die Zellmembran und stören die intrazellulären Ionen-und Second-Messenger-Konzentrationen, ist es ideal für die langfristige Aufzeichnung der neuronalen Aktivität. Whole cell Aufnahmen Ruptur der Zellmembran und schließlich zur Dialyse von intrazellulären Molekülen führen, wodurch sich möglicherweise ändern Neuron Eigenschaften mit längeren Aufnahmen. Aufgrund der Vorteile und Nachteile der beiden elektrophysiologischegischen Verfahren kann es wichtig sein, Neuron Eigenschaften mit beiden Techniken zu untersuchen. Da sowohl pH-Wert und Osmolarität sehr wichtig für das Überleben von Neuronen und Funktion benötigen alle Lösungen im Gebrauch richtig eingestellt sein.
Um die Identität des aufgenommenen Neuron zu bestätigen, wird ein Unterdruck nach Beendigung der Aufzeichnung aufgetragen und dann Fluoreszenz an der Spitze der Elektrode bestätigt mit mikroskopischen Fluoreszenz-Imaging. Niedermolekulare Farbstoffe oder Sonden (wie Alexa Fluor 568 Farbstoff oder Biocytin) in der intrazellulären Lösung für die ganzen Zellen, um die Aufzeichnung aufgezeichnet Neuron für weitere morphologische Analyse markieren enthalten sein.
Um erfolgreich aufzeichnen von Zielneuronen in intakten, ist die Tiefe der Lage der Neuronen entscheidend - je tiefer die Neuronen, die schwieriger zu überbrücken (beide lose aufgesetzte und ganze Zellen). Im Allgemeinen ist die Tiefe möglich für eine erfolgreiche Patching 5-6 Zellschichten von der Oberfläche. MedAuch bekannt als TN-GnRH3 Neuronen sind in der Regel an der ventralen Oberfläche des Gehirns, während Zebrafisch Hypothalamus GnRH3 Neuronen bis 6 Zellschichten von der Oberfläche sein können. Positiver Druck ist sehr hilfreich, um die Aufnahme-Elektrode von Verstopfungen beim Anflug auf die Zellen zu verhindern. Diese Art von experimenteller Ansatz kann für jedes Neuron, das genetisch mit fluoreszierenden Protein markiert werden. Um GnRH Neuronen-Aktivität im erwachsenen Gehirn zu untersuchen, verwenden wir routinemäßig Medakafisches und Zebrafisch von 4-6 Monaten. Der jüngere Fische mit kleineren Gehirnen oder älter Fisch mit verkalkten Schädel, wird die Präparation größere Herausforderung. Die TN: GnRH3 Neuronen sind leicht zugänglich für die Elektrophysiologie von Erwachsenen medaka Gehirn, aber dies ist nicht der Fall bei erwachsenen Zebrafisch in der TN: GnRH3 Neuronen sind in einem harten Mantel umhüllt Binde. Auf der anderen Seite, sind GnRH3 Neuronen in POA, VT, und Hypothalamus leichter zugänglich für die Elektrophysiologie in erwachsenen Zebrafisch Gehirn als von Medaka. Es gibt kein SexUnterschiede bezogen auf die Schwierigkeiten bei der Präparation und Elektrophysiologie Aufzeichnung der beiden Spezies.
Obwohl dies nicht in vivo experimentelle Ansatz, Aufzeichnung aus den relativ intakten neuronalen Schaltkreisen mit minimaler Schaden ist ein attraktiver Weg, um die physiologische Funktion und Regulation des neuronalen Systems zu erkunden. Die intakten Gehirn Zubereitung dauert Stunden, und eine gute Aufnahme kann über eine Stunde dauern 6. Dieses Protokoll ist für die Forscher, die bereits über Grundkenntnisse und Erfahrung mit elektrophysiologischen Techniken 13, und ebenso wie die spezielle Ausrüstung erforderlich, um die Arbeit zu tun.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Wir danken Herrn Dr. Meng-Chin Lin und Frau Yuan Dong für die technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium der National Institutes of Health HD053767 (Unterauftrag NLW) und durch Mittel aus dem Institut für Physiologie und Büro des Vizekanzlers für Forschung, University of California-Los Angeles (NLW) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope | Olympus | BX50W (Upright) | |
| Amplifier | Axon Instruments | Axoclamp 200B | |
| A-D converter | Computer Interference Corp. | Digidata ITC-18 | |
| Cooled CCD camera | PCO Computer Optics | Sensicam | |
| Xenon lamp | Sutter Instruments Co. | ||
| GFP filter set | Chroma Technologies | ||
| Imaging Software | Intelligent Imaging Innovations | Slidebook software | |
| Electrophysiology Data Acquisition Software | Axon Instruments | Axograph software | |
| Electrophysiology Data Acquisition Software | AD Instruments Inc. | PowerLab | |
| Headstage for electrophysiology | Axon Instruments | CV 203BU | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument Co | MP-285 | |
| Recording Chamber Platform | Warner Instrument Corp. | P1 | |
| Recording Chamber | Warner Instrument Corp. | RC-26G | |
| Electrode Puller | Sutter instruments | P87 | |
| Filament for electrode puller | Sutter Instruments | FB330B | 3.0 mm wide trough filament |
| 1.5 mm glass capillaries | World Precision Instruments | 1B150-4 | Micr–lectrode for recording |
| Syringe | Becton Dickinson | 309586 | 3 ml |
| MS-222 | Sigma | E10521-10G | Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt |
| Fish saline | mM: 134 NaCl; 2.9 KCl; 2.1 CaCl2; 1.2 MgCl2; 10 HEPES | ||
| Electrode solution (loose-patch) | mM: 150 NaCl; 3.5 KCl; 2.5 CaCl2; 1.3 MgCl2; 10 HEPES; 10 glucose | ||
| Electrode solution (whole-cell patch) | mM: 112.5 K-gluconate; NaCl; 17.5 KCl; 0.5 CaCl2; 1 MgCl2; 5 MgATP; 1 EGTA; 10 HEPES; 1 GTP; 0.1 leupeptin;10 phospho-creatine |
References
- Kah, O., Lethimonier, C., Lareyre, J. J. Gonadotrophin-releasing hormone (GnRH) in the animal kingdom. J. Soc. Biol. 198 (1), 53-60 (2004).
- Ramakrishnan, S., Wayne, N. L. Social cues from conspecifics alter electrical activity of gonadotropin-releasing hormone neurons in the terminal nerve via visual signals. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 297 (1), R135-R141 (2009).
- Abe, H., Oka, Y. Mechanisms of neuromodulation by a nonhypophysiotropic GnRH system controlling motivation of reproductive behavior in the teleost. 57 (6), 665-674 (2011).
- Oka, Y. Tetrodotoxin-resistant persistent Na+ current underlying pacemaker potentials of fish gonadotrophin-releasing hormone neurones. J. Physiol. 482 (Pt. 1), 1-6 (1995).
- Zhao, Y., Wayne, N. L. Effects of Kisspeptin1 on Electrical Activity of an Extrahypothalamic Population of Gonadotropin-Releasing Hormone Neurons in Medaka. PLoS One. 7 (5), e37909 (2012).
- Wayne, N. L., et al. Whole-cell electrophysiology of gonadotropin-releasing hormone neurons that express green fluorescent protein in the terminal nerve of transgenic medaka (Oryzias latipes). Biol. Reprod. 73 (6), 1228-1234 (2005).
- Okubo, K., et al. Forebrain gonadotropin-releasing hormone neuronal development: insights from transgenic medaka and the relevance to X-linked Kallmann syndrome. Endocrinology. 147 (3), 1076-1084 (2006).
- Okubo, K., et al. A novel form of gonadotropin-releasing hormone in the medaka, Oryzias latipes. Biochem. Biophys. Res. Commun. 276 (1), 298-303 (2000).
- Ramakrishnan, S., et al. Acquisition of spontaneous electrical activity during embryonic development of gonadotropin-releasing hormone-3 neurons located in the terminal nerve of transgenic zebrafish (Danio rerio). Gen. Comp. Endocrinol. 168 (3), 401-407 (2010).
- Abraham, E., et al. Targeted gonadotropin-releasing hormone-3 neuron ablation in zebrafish: effects on neurogenesis, neuronal migration, and reproduction. Endocrinology. 151 (1), 332-340 (2010).
- Wayne, N. L., Kuwahara, K. Beta-endorphin alters electrical activity of gonadotropin releasing hormone neurons located in the terminal nerve of the teleost medaka (Oryzias latipes. Gen. Comp. Endocrinol. 150 (1), 41-47 (2007).
- Oka, Y. Three types of gonadotrophin-releasing hormone neurones and steroid-sensitive sexually dimorphic kisspeptin neurones in teleosts. J. Neuroendocrinol. 21 (4), 334-338 (2009).
- Molleman, A. Patch Clamping: An Introductory Guide To Patch Clamp Electrophysiology. , Wiley & Sons. England. (2003).
