Summary
在这段视频中，我们将演示如何记录保留复杂的神经回路在整个大脑的准备，从确定单个神经元的电活动。我们使用转基因鱼中，促性腺激素释放激素（GnRH）的神经元与用于识别完整的大脑制备一种荧光蛋白基因的标签。
Abstract
了解细胞的生理调节复杂的行为的神经回路是通过使用模型的系统，在该系统中，可以进行这项工作，在一个完整的大脑制备的中枢神经系统的神经电路保持不变大大增强。我们使用转基因鱼中，促性腺激素释放激素（GnRH）的神经元与用于识别完整的大脑中的绿色荧光蛋白基因的标签。鱼GnRH神经元有多个种群，它们的功能是依赖于他们的位置在大脑和GnRH基因，他们表达1。我们集中示范GnRH3在终端转基因青鳉鱼（ 图1B和C）使用完整的大脑嗅球神经（田纳西州）的神经元位于。研究表明，青鳉的TN-GnRH3神经元是神经调节，中枢神经系统作为信息发射器从外部环境; T嘿，不要直接发挥作用，调节垂体-性腺功能，做知名GNRH1丘脑神经元2，3。进补动作电位射击TN-GnRH3神经元的自发模式的内在属性4-6，频率是调制的同种2和神经肽kisspeptin 1 5的视觉线索。在这段视频中，我们使用了一个稳定的转基因青鳉这TN-GnRH3的神经元表达了含转基因的启动子区域Gnrh3向您展示如何识别神经元，并监察他们在整个大脑的电活动与增强型绿色荧光蛋白7制备例6。
Protocol
1。成人脑解剖鳉
- 麻醉成年男性或女性（ 图1A）浸泡5毫升的MS-222（150毫克/升，pH值7.4），等待一两分钟后，鳃变动之前已经停止斩首。加州洛杉矶大学的机构动物护理和使用委员会批准的所有程序。
- 杀头在盐水鱼的鱼鳃盖的尾端用剪刀在一个直径为60毫米的培养皿。
- 传输鱼头一个直径为35毫米的培养皿中，一半充满了盐水鱼及内衬SYLGARD有抑郁症，它为大脑解剖定位和固定头部。位置和固定头背的一面朝上，昆虫针。
- 小心切断背侧部围绕其周边的头骨与细剪刀，轻轻取出镊子，露出大脑完全包括前部的脊髓背侧部分。 <LI>轻轻抬起脊髓细尖镊子和断绝双边结缔组织的细尖的剪刀：颅神经，脊神经，视神经，大脑腹侧神经，嗅觉神经的前部大脑。
- 将充分解剖的大脑在一个充满盐水鱼的新鲜的培养皿中，并在显微镜下仔细检查，以确保没有任何切口或穿刺，全脑是否完好（包括脑垂体）。受损的大脑不用于实验。
2。在录音室中安装的大脑
- 瞬干胶或其他一些快熔胶用针进入录音室的中心放置一小滴和传播胶约1厘米2。
- 迅速转移大脑和胶水中腹的一面朝上位置。
- 添加1毫升的盐水鱼，使其充满录音室，并涵盖了大脑。不断灌注的大脑与曝气鱼生理盐水至少为200微升/分钟的速率。
- 使用细尖钳子小心地取出脑膜的大脑的表面上的记录区域。
3。电
- 松散的膜片钳记录动作电位射击
- 玻璃微电极（6-10MΩ）构建的硼硅玻璃吸管（1B150F-4，世界精密仪器）使用电极拉马（ 如萨特的P-87），和背面充满了半路上了松散的膜片录音解决方案电极。
- 使用一个直立的荧光显微镜用冷却的电荷耦合器件（CCD）摄像机，发现GFP-表达TN-GnRH3的神经元通过10倍（ 图1B），然后40倍的水浸泡的目标（ 图1C）。它们存在于嗅球，只是前端脑腹侧表面处或附近。
- 切换到视频显示器提供从显微镜的实时图像定位的TN-GnRH3的神经元集群（ 图1C）。
- 微电极定位入熔池，使尖端的电极上方的神经元靶。适用于恒定的轻微的正压力，以便它不被堵塞，并轻轻地接近目标神经元与电极尖端的微电极。
- 检查和监控电压钳模式的使用AxoGraph软件和的放大器Axoclamp 200B与Axograph软件（Axon仪器）的电极电阻。的时候可以看到，电极尖端从视频监视器的表面上的神经元和从的AxoGraph显示的电阻略有变化，释放的正压力，并如果有必要施加轻微的负压力，使一个低电阻的密封件的神经元（<100MΩ）。
- 切换电流钳模式下，连续记录膜电压没有任何电流输入，调整规模电压和如果有必要的记录率。 PowerLab系统软件（的ADInstruments公司）的数据收集和分析。
- 记录基线电活动的正常鱼的盐水任何治疗（ 图2A）的前5分钟左右。浴灌注药物，激素，肽等 。添加到鱼盐水继续上面的速率为200微升/分钟，然后用洗脱期在正常鱼生理盐水5，6，11。
- 全细胞记录膜电位
膜片钳全细胞电生理过程是相同的如上述外松补丁录制过程中，从步骤3.1.1 - 3.1.4。然后程序相应的偏离：- 检查和监控电压钳模式的电极电阻。的时候可以看到，电极尖端从视频监视器的表面上的神经元，并从示波器的电阻变小，释放的正压力和施加一点点的负面压力，使高电阻印章上的神经元（〜3千兆Ω）。轻轻吸口破裂修补膜，你会看到一个突然下降的阻力约120-250MΩ。
- 切换电流钳模式下，连续记录膜电压没有任何电流输入，调整电压和如果有必要的记录速率的规模。
- 记录基线电活动的正常鱼生理盐水任何治疗前，约5分钟，如上述3.1.7中（ 图2B）。
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Representative Results
GFP标记的TN-GnRH3神经元从切除大脑的青鳉鱼的双边集群的一个例子示于图1B和图1C。每个集群包含大约8-10 GnRH神经元。自发的神经元活动的目标TN-GnRH3的被记录在电流钳模式（I = 0），与典型的发射率0.5-6赫兹。动作电位射击模式是一个典型的补药或跳动模式，一个相当普通的峰峰间隔。样品的痕迹显示在图2（2A：宽松的补丁; 2B：全细胞）。
这种实验的方法也是成功的记录GFP标记GnRH神经元位于在成年斑马鱼（ 图3A和3B）的前脑。切除，完整的大脑中的神经元的电活动记录在上述类似的方法在青鳉松散的膜片（ 图3C）和全细胞记录（ 
图1。动物模型，用于TN-的神经元GnRH3研究在这个视频。答：成人青鳉GnRH3：GFP转基因鱼，左：男，右：女，B：鉴于前脑腹侧共聚焦图像。 OB：嗅球; TN：终端神经GnRH3神经元; TELE：端脑，视神经C：高倍率的TN-GnRH3神经元显示面板B.白盒（比例尺：A：5毫米; B：100微米，C：20微米）。 
图2。斯波ntaneous动作电位在电流钳模式（I = 0）从TN-GnRH3的神经元的记录。 答：样品一丝松散的膜片记录，B：样品从全细胞记录的痕迹。 
图3。记录GnRH3：EMD（翡翠绿色荧光蛋白）成年转基因斑马鱼9完整的大脑准备使用相同的实验方法所描述的青鳉脑制剂的神经元活动。答：GnRH3：EMD神经元位于前脑腹侧（VT）和视前区成年斑马鱼的前脑区（POA），B：GnRH3：EMD神经元位于下丘脑（海波）。标尺：100微米。C：样品一丝松散的膜片录音GnRH3：EMD神经元VT D：样品跟踪从VT全细胞膜片记录。
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Discussion
激素3：提供了独特的绿色荧光蛋白转基因鱼模型来研究的神经生理机制神经集成中央控制和调节的行为，都直接和间接地参与再现3 8-10。这个模型系统的显着优势之一是，许多GnRH3表达GFP神经元的大脑腹面，可以相对容易获得的神经元电生理记录，不破坏神经回路6，9，11，12（ 图图1B和图1C，图3A和3B）。在这段视频中，我们已经表明了松散的膜片和鳉鱼的完整的成人大脑中从TN-GnRH3的神经元的全细胞记录。 TN-GnRH3神经元表现出一种补品或跳动模式的自发动作电位发放频率为0.5-6Hz.There自发放电没有检测到的性别差异率5，但也有戏剧性的发展变化GnRH3神经元的电活动，在胚胎发育过程中9。松散的膜片和全细胞电生理有不同的方法的优点和缺点。松散的膜片在技术上更容易比全细胞记录，但只显示了神经元放电模式和频率。另一方面，全细胞记录，可以提供更多的信息：静息膜电位，放电模式和频率，动作电位的分析，膜电容和电阻。因为松散的膜片录音不破坏细胞膜，破坏细胞内的离子和第二信使的浓度，它是理想的长期记录的神经元的活动。全细胞记录细胞膜破裂，并最终导致细胞内分子的透析，从而有可能改变神经元的性能与更长时间的录音。由于两个electrophysi的优点和缺点ological的方法，也可以是重要的研究神经元的属性，使用这两种技术。由于pH值和同渗容摩神经元的存活和功能是非常重要的，在使用中的所有的解决方案需要适当调整。
所记录的神经元的身份确认，施加负压的记录完成后，然后在电极尖端荧光证实使用显微荧光成像。小分子染料或探针（如染料或生物胞素的Alexa Fluor 568）可以被包括在全细胞记录标记的记录，可进一步的形态学分析神经元的细胞内的解决方案。
要成功记录目标完整的大脑中的神经元，神经元的位置的深度是至关重要的 - 更深层次的神经元，就越难补丁（松散的膜片和全细胞）。一般情况下，成功修补可行的深度是从表面约5-6细胞层。医学又名的TN-GnRH3神经元通常是在大脑的腹面，而斑马鱼的下丘脑GnRH3神经元可以是高达6个细胞层的表面。正压力是非常有帮助的，以防止堵塞而接近细胞记录电极。这种类型的实验方法可用于任何荧光蛋白基因标记的神经元。要在成人大脑研究GnRH神经元的活动，我们经常使用的鳉鱼和斑马鱼的4-6个月的年龄。年轻的鱼，更小的大脑或以上的鱼的头骨钙化，将使解剖更具挑战性。 TN：GnRH3神经元电从成人鳉脑方便，但是这是不是成年斑马鱼的情况下，TN：GnRH3神经元装在一个艰难的结缔组织鞘。在另一方面，GnRH3的小一入学统筹办法，VT，和下丘脑的神经元更容易获得电在成年斑马鱼脑不是从青鳉。有没有性行为差异基础上的困难，无论是物种的解剖及电生理记录。
虽然这不是一个体内实验方法，记录相对完整的神经元电路，以最小的损伤是一个有吸引力的方式来探索的生理功能，调节神经系统的兴趣。完整的大脑准备持续了几个小时，和良好的记录可以持续6小时。此协议是适合于研究谁已经有基本知识和经验的电生理技术13，以及专门的设备，需要做的工作。
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Disclosures
什么都没有透露。
Acknowledgments
我们感谢孟博士林青女士远东的技术援助。这项工作是从美国国立卫生研究院HD053767（转包NLW），由授出从生理和副校长办公室的研究，美国加州洛杉矶大学（NLW）部的资金支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope | Olympus | BX50W (Upright) | |
| Amplifier | Axon Instruments | Axoclamp 200B | |
| A-D converter | Computer Interference Corp. | Digidata ITC-18 | |
| Cooled CCD camera | PCO Computer Optics | Sensicam | |
| Xenon lamp | Sutter Instruments Co. | ||
| GFP filter set | Chroma Technologies | ||
| Imaging Software | Intelligent Imaging Innovations | Slidebook software | |
| Electrophysiology Data Acquisition Software | Axon Instruments | Axograph software | |
| Electrophysiology Data Acquisition Software | AD Instruments Inc. | PowerLab | |
| Headstage for electrophysiology | Axon Instruments | CV 203BU | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument Co | MP-285 | |
| Recording Chamber Platform | Warner Instrument Corp. | P1 | |
| Recording Chamber | Warner Instrument Corp. | RC-26G | |
| Electrode Puller | Sutter instruments | P87 | |
| Filament for electrode puller | Sutter Instruments | FB330B | 3.0 mm wide trough filament |
| 1.5 mm glass capillaries | World Precision Instruments | 1B150-4 | Micr–lectrode for recording |
| Syringe | Becton Dickinson | 309586 | 3 ml |
| MS-222 | Sigma | E10521-10G | Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt |
| Fish saline | mM: 134 NaCl; 2.9 KCl; 2.1 CaCl2; 1.2 MgCl2; 10 HEPES | ||
| Electrode solution (loose-patch) | mM: 150 NaCl; 3.5 KCl; 2.5 CaCl2; 1.3 MgCl2; 10 HEPES; 10 glucose | ||
| Electrode solution (whole-cell patch) | mM: 112.5 K-gluconate; NaCl; 17.5 KCl; 0.5 CaCl2; 1 MgCl2; 5 MgATP; 1 EGTA; 10 HEPES; 1 GTP; 0.1 leupeptin;10 phospho-creatine |
References
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