Summary
En este video, vamos a demostrar cómo registrar la actividad eléctrica de las neuronas individuales identificadas en una preparación de todo el cerebro, que preserva los circuitos neuronales complejas. Utilizamos los peces transgénicos en los que las neuronas de hormona liberadora de gonadotropina (GnRH) etiquetados genéticamente con una proteína fluorescente para la identificación en la preparación cerebro intacto.
Abstract
La comprensión de la fisiología de la célula de los circuitos neuronales que regulan comportamientos complejos es mejorada en gran medida mediante el uso de sistemas modelo en el que este trabajo se puede realizar en una preparación de cerebro intacto, donde los circuitos neuronales del sistema nervioso central se mantiene intacta. Utilizamos los peces transgénicos en los que las neuronas de hormona liberadora de gonadotropina (GnRH) etiquetados genéticamente con la proteína verde fluorescente para la identificación en el cerebro intacto. Los peces tienen múltiples poblaciones de neuronas de GnRH, y sus funciones son dependientes de su ubicación en el cerebro y el gen de la GnRH que expresan 1. Nos hemos centrado nuestra demostración en GnRH3 neuronas localizadas en los nervios terminales (TN) asociados con los bulbos olfativos utilizando el cerebro intacto de medaka peces transgénicos (Figura 1B y C). Los estudios sugieren que las neuronas medaka TN-GnRH3 son neuromodulador, que actúa como un transmisor de la información desde el entorno externo al sistema nervioso central; tbueno no jugar un papel directo en la regulación de las funciones de la hipófisis-gonadal, al igual que el conocido hipotalámico neuronas GnRH1 2, 3. El patrón tónico del potencial de acción espontánea descarga de las neuronas TN-GnRH3 es una propiedad intrínseca 4-6, la frecuencia de la cual es modulada por señales visuales de sus congéneres 2 y el neuropéptido kisspectina 1 5. En este vídeo, se utiliza una línea estable de medaka transgénico en el que las neuronas TN-GnRH3 expresan un transgén que contiene la región promotora del Gnrh3 vinculada a una mayor proteína verde fluorescente 7 de mostrarle la forma de identificar las neuronas y controlar su actividad eléctrica en todo el cerebro preparación 6.
Protocol
1. La disección de los cerebros de Medaka Adulto
- Anestesie adulto hombre o mujer (Figura 1A) por inmersión en 5 ml MS-222 (150 mg / L, pH 7,4), esperar un par de minutos después de los movimientos branquias han dejado antes de decapitar. Todos los procedimientos fueron aprobados por el Cuidado de Animales institucional y el empleo Comisión de la Universidad de California-Los Angeles.
- Decapitar a los peces en solución salina peces en el extremo caudal del opérculo con unas tijeras en la placa de Petri de un diámetro de 60 mm.
- Transferencia de cabeza de pescado con un diámetro placa de Petri de 35 mm, la mitad llenos de peces de solución salina y forrado con Sylgard que tiene una depresión en él para posicionar y sujetar la cabeza para la disección del cerebro. Coloque y asegure la cabeza dorsal hacia arriba con alfileres de insectos.
- Corte con cuidado la parte dorsal del cráneo alrededor de su perímetro con unas tijeras finas y retírela con una pinza, dejando al descubierto la parte dorsal del cerebro, incluyendo completamente la parte anterior de la médula espinal. <li> Levante la médula espinal suavemente con unas pinzas de punta fina y cortar los nervios conectivos bilaterales con tijeras de punta fina: nervios craneales, nervios espinales y nervios ópticos en la parte ventral del cerebro y los nervios olfatorios en la parte anterior del el cerebro.
- Coloque el cerebro totalmente disecado en una placa de Petri fresca llena de solución salina peces y comprobar cuidadosamente bajo el microscopio para asegurar todo el cerebro está intacto (incluyendo la glándula pituitaria) sin ningún tipo de cortes o pinchazos. Cerebros dañados no son utilizados para la experimentación.
2. Montaje del cerebro en una cámara de registro
- Coloque una pequeña gota de cianoacrilato o algún otro pegamento de acción rápida con una aguja en el centro de la cámara de registro y difundir el pegamento alrededor de 1 cm 2.
- Transferir rápidamente el cerebro y la cola hacia abajo en una posición hacia arriba ventral-lateral.
- Añadir 1 ml de solución salina peces para que llene la cámara de grabación y cubre el cerebro. Continuamente perfundirel cerebro con solución salina aireada pescado a una velocidad de al menos 200 l / min.
- Uso del fórceps de punta fina quitar cuidadosamente las meninges sobre la superficie del área de grabación del cerebro.
3. Electrofisiología
- Grabación de patch Loose del potencial de acción disparando
- Microelectrodos de vidrio (6-10 mW) se construyen a partir de pipetas de vidrio de borosilicato (1B150F-4, World Precision Instruments) con un extractor de electrodos (por ejemplo, Sutter P-87), y la espalda llena de la solución de grabación loose-patch media altura del electrodo.
- El uso de un microscopio de fluorescencia en posición vertical con un dispositivo de acoplamiento de carga enfriado (CCD), encontrar la expresión de GFP-TN-GnRH3 las neuronas a través de 10 veces (Figura 1B), a continuación, objetivos de inmersión en agua 40x (Figura 1C). Ellos se encuentran en o cerca de la superficie ventral de los bulbos olfativos, justo anterior a la telencéfalo.
- Cambie a un monitor de video que proporcionaimágenes en tiempo real desde el microscopio para localizar la neurona grupo TN-GnRH3 (Figura 1C).
- Coloque el microelectrodo en el baño de modo que la punta del electrodo está por encima de la neurona diana. Aplique ligera presión positiva constante a la microelectrodos para que no se obstruya, y acercarse suavemente la neurona diana con la punta del electrodo.
- Controlar y vigilar la resistencia del electrodo en el modo de fijación de voltaje con el software AxoGraph y el amplificador Axoclamp 200B con software AxoGraph (Axon Instruments). Cuando se puede ver en el monitor de vídeo que la punta del electrodo está en la superficie de la neurona y de la pantalla AxoGraph que la resistencia cambia ligeramente, liberar la presión positiva y aplicar una ligera presión negativa si es necesario para hacer un sello de baja resistencia en la neurona (<100 M).
- Cambie al modo de corriente-clamp, y registrar el voltaje de la membrana continua sin ninguna entrada de corriente, el ajuste de la escalade la tensión y la velocidad de grabación si es necesario. Los datos son recogidos y analizados por el software Powerlab (ADInstruments Inc.).
- Línea de base registrar la actividad eléctrica en solución salina normal pescado durante aproximadamente 5 minutos antes de cualquier tratamiento (Figura 2A). Bath perfusión de fármacos, hormonas, péptidos, etc. añadido a la solución salina peces continúa a una velocidad de 200 l / min, seguido por un período de lavado en solución salina normal peces 5, 6, 11.
- Grabación de células enteras de potencial de membrana
El conjunto de patch clamp procedimiento electrofisiológico celular es la misma que la del procedimiento de grabación sueltas parche extracelular se ha descrito anteriormente, de los pasos 3.1.1 - 3.1.4. A continuación, los procedimientos se desvían en consecuencia:- Controlar y vigilar la resistencia del electrodo en el modo de fijación de voltaje. Cuando se puede ver en el monitor de vídeo que la punta del electrodo está en la superficie de la neurona y desde el osciloscopio que los cambios en la resistencia ligeramente, liberan el positivopresión y aplicar un poco de presión negativa para hacer un sello de alta resistencia de la neurona (~ 3 Giga Ω). Aplicar una suave succión por la boca a la ruptura de la membrana parcheado, podrás ver una caída brusca de la resistencia a alrededor de 120 a 250 mW.
- Cambie al modo de corriente-clamp, y registrar el voltaje de la membrana continua sin ninguna entrada de corriente, el ajuste de la escala de voltaje y velocidad de grabación si es necesario.
- Línea de base registrar la actividad eléctrica en solución salina normal pescado durante aproximadamente 5 minutos antes de cualquier tratamiento, como se describió anteriormente en 3.1.7 (Figura 2B).
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Representative Results
Un ejemplo de grupos bilaterales de GFP-etiquetados TN-GnRH3 neuronas del cerebro extirpado de medaka peces se muestran en las Figuras 1B y 1C. Cada grupo contiene aproximadamente 8-10 neuronas GnRH. Las actividades neuronales espontáneas de la meta TN-GnRH3 se registraron en el modo de abrazadera de corriente (I = 0) con tasas de disparo típicas de 0,5-6 Hz. El modelo de potencial de acción disparando es típicamente un patrón tónico o golpear, con un intervalo bastante regular interspike. Rastros de ejemplo se muestra en la Figura 2 (2A: loose-patch, 2B: conjunto de células).
Este enfoque experimental también es exitoso en la grabación de GFP-etiquetados neuronas GnRH situados en el cerebro anterior del adulto pez cebra (Figuras 3A y 3B). Neurona actividad eléctrica en el extirpado, cerebro intacto se registró en la forma similar a la descrita anteriormente en el medaka por sueltas parche (Figura 3C) y el registro de células enteras ( 
Figura 1. Modelo animal utilizado para el estudio de TN-GnRH3 neurona en este video A: Adultos medaka GnRH3: GFP peces transgénicos, a la izquierda: masculino; derecha:.. Femenino B: imagen confocal de la vista ventral del prosencéfalo. OB: bulbo olfatorio, TN: nervio Terminal GnRH3 neuronas; TELE: telencéfalo, ON:. Nervio óptico C: gran aumento de TN-GnRH3 neuronas se muestran en la caja blanca del panel B. (barra de escala: A: 5 mm; B: 100 m; C: 20 micras). 
La Figura 2. Spopotenciales de acción ntaneous grabados de TN-GnRH3 neuronas en el modo de corriente-clamp (I = 0) A: Muestra del rastro loose-patch grabación; B:. Muestra rastro de la grabación de células enteras. 
La Figura 3. De grabación de GnRH3: EMD (proteína fluorescente verde esmeralda) actividad de las neuronas de la preparación cerebro intacto de adultos de pez cebra transgénico 9 utilizando el mismo enfoque experimental como se describe para la preparación del cerebro medaka A:. GnRH3: EMD neuronas ubicadas en telencéfalo ventral (VT) y preóptica . área (POA) en el cerebro anterior de adultos de pez cebra B: GnRH3: EMD neuronas localizadas en el hipotálamo (hipo). Las barras de escala: 100 micras C:. Muestra trazas de grabación loose-patch de GnRH3: EMD neuronas enVT D:. Muestra rastro de grabación parche de células enteras de VT.
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Discussion
GnRH 3: GFP peces transgénicos proporcionan modelos únicos para estudiar los mecanismos neurofisiológicos que subyacen a la integración y la regulación en el control central de los comportamientos que están directa e indirectamente involucrados en la reproducción 3, 8-10 neuronal. Una de las ventajas significativas de este sistema de modelo es que muchos GnRH3 neuronas que expresan GFP se encuentran cerca de la superficie ventral del cerebro, lo que permite un acceso relativamente fácil a las neuronas para registro electrofisiológico sin interrumpir circuitos neuronales 6, 9, 11, 12 (Figuras 1B y 1C; las Figuras 3A y 3B). En este video, hemos mostrado las dos grabaciones loose-patch y de células enteras de TN-GnRH3 neuronas en el cerebro adulto intacto de medaka peces. TN-GnRH3 neuronas exhiben un tónico o superando patrón del potencial de acción espontánea de disparo con una frecuencia de 0,5-6Hz.There hubo diferencias detectables en sexo activación espontáneatasa de 5, pero no hubo cambios en el desarrollo dramático en GnRH3 actividad eléctrica de neuronas durante la embriogénesis 9. Loose-patch y electrofisiología de células enteras tienen diferentes ventajas y desventajas metodológicas. Loose-parche es técnicamente más fácil que la grabación de células enteras, pero sólo muestra el patrón de descarga de neuronas y la frecuencia. Por otro lado, la grabación de células enteras puede proporcionar mucha más información: potencial de membrana en reposo, patrón de activación y la frecuencia, análisis de la acción potencial, capacitancia de la membrana y la resistencia. Debido a la grabación sueltas parche no se rompe la membrana celular y alteran el ion intracelular y concentraciones de segundos mensajeros, es ideal para la grabación de largo plazo de la actividad neuronal. Grabaciones de células enteras ruptura de la membrana celular y, finalmente, conduce a la diálisis de moléculas intracelulares, con lo que potencialmente alterar las propiedades de neuronas con grabaciones más prolongados. Debido a las ventajas y desventajas de ambos electrophysimétodos metodológicos, que pueden ser importantes para estudiar las propiedades de neuronas que utilizan ambas técnicas. Debido a que tanto el pH y la osmolaridad son muy importantes para la supervivencia y función de las neuronas, todas las soluciones en uso deben ajustarse adecuadamente.
Para confirmar la identidad de la neurona registrada, se aplica presión negativa después de la finalización de la grabación, y luego de fluorescencia en la punta del electrodo se confirmó por el uso de imágenes de fluorescencia microscópica. Colorantes o sondas (tales como Alexa Fluor 568 tinte o biocitina) moleculares pequeños pueden ser incluidos en la solución intracelular para la grabación de células enteras para marcar la neurona registrada para su posterior análisis morfológico.
Para grabar con éxito de neuronas diana en el cerebro intacto, la profundidad de la ubicación de las neuronas es crucial - la más profunda de las neuronas, la más difícil de parche (tanto sueltas parche y de células enteras). Generalmente, la profundidad factible para parches éxito es aproximadamente 5-6 capas de células de la superficie. Medaka TN-GnRH3 neuronas son típicamente en la superficie ventral del cerebro, mientras que las neuronas hipotalámicas pez cebra GnRH3 pueden ser de hasta 6 capas de células de la superficie. La presión positiva es muy útil para evitar que el electrodo de registro se obstruya mientras se aproximaba a las células. Este tipo de enfoque experimental se puede utilizar para cualquier neurona que está marcado genéticamente con proteína fluorescente. Para estudiar la actividad de las neuronas GnRH en el cerebro adulto, nosotros usamos peces medaka y pez cebra de 4-6 meses de edad. Los peces más jóvenes con cerebros más pequeños o peces mayores con cráneos más calcificadas, hará que la disección más difícil. El TN: GnRH3 neuronas son fácilmente accesibles para electrofisiología de adultos medaka cerebro, pero esto no es el caso de adultos de pez cebra en el que TN: GnRH3 neuronas están encerradas en una envoltura conectivo resistente. Por otro lado, GnRH3 neuronas en POA, VT, y el hipotálamo son más fácilmente accesibles para la electrofisiología en el cerebro de adultos de pez cebra que de medaka. No hay sexodiferencias basadas en las dificultades de la disección y el registro electrofisiológico de cualquiera de las especies.
Aunque esto no es un enfoque experimental en vivo, grabación de los circuitos neuronales relativamente intactas con el mínimo daño es una forma atractiva para explorar la función y regulación del sistema neuronal de interés fisiológico. La preparación cerebro intacto tiene una duración de hora y una buena grabación puede durar más de una hora 6. Este protocolo es adecuado para los investigadores que ya tienen conocimientos básicos y experiencia en las técnicas de electrofisiología 13, y así como el equipo especializado necesario para hacer el trabajo.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos al Dr. Meng-Chin Lin y la Sra. Yuan Dong de asistencia técnica. Este trabajo fue apoyado por una beca de los Institutos Nacionales de Salud HD053767 (subcontrato a NLW) y por fondos del Departamento de Fisiología y la Oficina del vicerrector de Investigación de la Universidad de California-Los Ángeles (NLW).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope | Olympus | BX50W (Upright) | |
| Amplifier | Axon Instruments | Axoclamp 200B | |
| A-D converter | Computer Interference Corp. | Digidata ITC-18 | |
| Cooled CCD camera | PCO Computer Optics | Sensicam | |
| Xenon lamp | Sutter Instruments Co. | ||
| GFP filter set | Chroma Technologies | ||
| Imaging Software | Intelligent Imaging Innovations | Slidebook software | |
| Electrophysiology Data Acquisition Software | Axon Instruments | Axograph software | |
| Electrophysiology Data Acquisition Software | AD Instruments Inc. | PowerLab | |
| Headstage for electrophysiology | Axon Instruments | CV 203BU | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument Co | MP-285 | |
| Recording Chamber Platform | Warner Instrument Corp. | P1 | |
| Recording Chamber | Warner Instrument Corp. | RC-26G | |
| Electrode Puller | Sutter instruments | P87 | |
| Filament for electrode puller | Sutter Instruments | FB330B | 3.0 mm wide trough filament |
| 1.5 mm glass capillaries | World Precision Instruments | 1B150-4 | Micr–lectrode for recording |
| Syringe | Becton Dickinson | 309586 | 3 ml |
| MS-222 | Sigma | E10521-10G | Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt |
| Fish saline | mM: 134 NaCl; 2.9 KCl; 2.1 CaCl2; 1.2 MgCl2; 10 HEPES | ||
| Electrode solution (loose-patch) | mM: 150 NaCl; 3.5 KCl; 2.5 CaCl2; 1.3 MgCl2; 10 HEPES; 10 glucose | ||
| Electrode solution (whole-cell patch) | mM: 112.5 K-gluconate; NaCl; 17.5 KCl; 0.5 CaCl2; 1 MgCl2; 5 MgATP; 1 EGTA; 10 HEPES; 1 GTP; 0.1 leupeptin;10 phospho-creatine |
References
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