Summary
In deze video laten we zien hoe de elektrische activiteit van de geïdentificeerde enkele neuronen in een hele brein voorbereiding, waarin complexe neurale circuits behoudt opnemen. We maken gebruik van transgene vissen waarbij gonadotropin-releasing hormoon (GnRH) neuronen genetisch worden gelabeld met een fluorescerend eiwit voor identificatie in de intacte voorbereiding hersenen.
Abstract
Inzicht in de cel fysiologie van neurale circuits die complexe gedrag reguleren sterk verbeterd door modelsystemen waarop dit kan worden gewerkt in een intact preparaat hersenen waar de neurale circuits van het CZS blijft intact. We maken gebruik van transgene vissen waarbij gonadotropin-releasing hormoon (GnRH) neuronen genetisch zijn gelabeld met groen fluorescerend eiwit voor identificatie in de intacte hersenen. Vissen hebben meerdere populaties van GnRH neuronen en hun functies zijn afhankelijk van de plaats binnen de hersenen en GnRH gen dat ze expressie 1. We hebben onze demonstratie gericht op GnRH3 neuronen in de terminal zenuwen (TN) van het te reukbollen met de intacte hersenen van transgene vis medaka (Figuur 1B en C). Studies suggereren dat medaka TN-GnRH3 neuronen zijn neuromodulatory, als een zender van informatie uit de externe omgeving aan het centrale zenuwstelsel; they niet een directe rol spelen in het reguleren hypofyse-gonadale functies, net als de bekende hypothalamus GnRH1 neuronen 2, 3. De tonic patroon van spontane actiepotentiaal afvuren van TN-GnRH3 neuronen is een intrinsieke eigenschap 4-6, de frequentie waarvan wordt gemoduleerd door visuele signalen van soortgenoten 2 en het neuropeptide kisspeptin 1 5. In deze video, gebruiken we een stabiele lijn van transgene medaka waarin TN-GnRH3 neuronen drukken een transgenbevattende de promotor regio van Gnrh3 gekoppeld aan verbeterde groen fluorescerend eiwit 7 te laten zien hoe je neuronen identificeren en controleren hun elektrische activiteit in de gehele hersenen voorbereiding 6.
Protocol
1. Dissectie van Brains uit Adult Medaka
- Verdoven volwassen mannelijke of vrouwelijke (figuur 1A) door onderdompeling in 5 ml MS-222 (150 mg / L, pH 7,4), en wacht een paar minuten na de kieuwen bewegingen voordat onthoofden hebben opgehouden. Alle procedures werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite van de Universiteit van Californië-Los Angeles.
- Onthoofden de vis in zoutoplossing bij het staarteinde van de operculum met schaar 60 mm petrischaal.
- Transfer vis kop op een 35-mm petrischaal, half gevuld met vis zoutoplossing en bekleed met Sylgard dat een depressie bij deze in stand en zet het hoofd voor de hersenen dissectie heeft. Positie en zet het hoofd dorsale-side up met insecten pinnen.
- Snijd voorzichtig het dorsale gedeelte van de schedel rond de omtrek met fijne schaar en verwijder deze voorzichtig met een pincet, het blootstellen van het dorsale gedeelte van de hersenen volledig met inbegrip van het voorste deel van het ruggenmerg. <li> Til het ruggenmerg voorzichtig met fijn-tip pincet en verbreken de bilaterale verbindende zenuwen met fijne punt schaar: hersenzenuwen, spinale zenuwen, en oogzenuwen aan de buikzijde van de hersenen, en de olfactorische zenuwen op het voorste deel van de hersenen.
- Plaats de volledig ontleed hersenen in een frisse petrischaal gevuld met vis zout en controleer zorgvuldig onder de microscoop om ervoor te zorgen het hele brein intact is (inclusief de hypofyse) zonder enige sneden of lekken. Beschadigde hersenen worden niet gebruikt voor experimenten.
2. Montage van de hersenen in een opname Kamer
- Plaats een kleine druppel cyanoacrylaat of een andere snelwerkende lijm met een naald in het midden van de opname kamer en verspreid de lijm ongeveer 1 cm 2.
- Snel de de hersenen en lijm deze vast in een ventrale-side up positie.
- Voeg 1 ml zoutoplossing vis zodat vult de opname kamer en bedekt de hersenen. Continu perfuserende hersenen met beluchte vis zoutoplossing met een snelheid van ten minste 200 ul / min.
- Met behulp van de fine-tip pincet verwijder voorzichtig de hersenvliezen over het oppervlak van de opname gebied van de hersenen.
3. Elektrofysiologie
- Losse patch opname van actiepotentiaal afvuren
- Glazen micro-elektroden (6-10 MQ) zijn gemaakt van borosilicaatglas pipetten (1B150F-4, World precisie-instrumenten) met behulp van een elektrode trekker (bijv. Sutter P-87), en terug gevuld met de losse-patch opnameoplossing halverwege de electrode.
- Met behulp van een rechtop fluorescentiemicroscoop met een gekoelde charge-coupled device (CCD) camera, vind de GFP-expressie TN-GnRH3 neuronen via 10x (Figuur 1B), dan 40x onderdompeling doelstellingen water (figuur 1C). Ze bevinden zich op of nabij het ventrale oppervlak van de reukkwabben, anterieure het telencefalon.
- Overschakelen naar een video-monitor die is het verstrekkenreal-time beelden van de microscoop naar het TN-GnRH3 neuron cluster (figuur 1C) te lokaliseren.
- Plaats de micro-elektrode in het bad dat de punt van de elektrode boven het doelwit neuron. Toepassen constante lichte positieve druk op de micro-elektrode zodat het verstopt raken en rustiger manier het doelwit neuron met de punt van de elektrode.
- Controleren en bewaken de elektrode weerstand in voltage-clamp modus met behulp AxoGraph software en versterker Axoclamp 200B met Axograph software (Axon Instruments). Als je kunt zien op de video-monitor dat het uiteinde van de elektrode is op het oppervlak van het neuron en van de AxoGraph scherm dat de weerstand verandert iets, laat de positieve druk en oefen lichte negatieve druk indien nodig op een lage weerstand afdichting te maken op het neuron (<100 MQ).
- Schakel over naar de huidige-clamp-modus, en noteer de membraan spanning continu zonder stroom ingang, het aanpassen van de schaalspanning en snelheid van registratie indien nodig. Gegevens worden verzameld en geanalyseerd door Powerlab software (ADInstruments Inc).
- Record basislijn elektrische activiteit in normale zoutoplossing vis ongeveer 5 minuten voor elke behandeling (Figuur 2A). Bath perfusie van geneesmiddelen, hormonen, peptiden, enzovoort. toegevoegd aan vissen zoutoplossing verder met een snelheid van 200 pl / min, gevolgd door een uitwasperiode in normale zoutoplossing vis 5, 6, 11.
- Gehele cel opnemen van membraanpotentiaal
De gehele cel patch clamp elektrofysiologie procedure is dezelfde als die van de extracellulaire losse patch opname hierboven beschreven procedure van stap 3.1.1 - 3.1.4. Dan wijken de procedures dienovereenkomstig:- Controleren en bewaken de elektrode weerstand in voltage-clamp-modus. Als je kunt zien op de video-monitor dat het uiteinde van de elektrode is op het oppervlak van het neuron en van de oscilloscoop die de weerstand verandert iets, los van de positievedruk en met een beetje negatieve druk om een hoge weerstand zegel op het neuron (~ 3 Giga Ω) te maken. Solliciteer zachte zuigkracht via de mond te scheuren de gepatchte membraan, je zal een plotselinge daling van de weerstand tot ongeveer 120-250 MQ zien.
- Schakel over naar de huidige-clamp-modus, en noteer de membraan spanning continu zonder stroom ingang, het aanpassen van de omvang van de spanning en snelheid van opname indien nodig.
- Record basislijn elektrische activiteit in normale zoutoplossing vis ongeveer 5 minuten voor een behandeling, zoals beschreven in 3.1.7 (figuur 2B).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een voorbeeld van bilaterale clusters van GFP-gemerkte TN-GnRH3 neuronen in de hersenen uitgesneden van medaka vissen zijn getoond in figuren 1B en 1C. Elke cluster bevat ongeveer 8-10 GnRH neuronen. De spontane neuronale activiteiten van de doelgroep TN-GnRH3 werden opgenomen in de huidige-clamp-modus (I = 0) met typische werkingsveld van 0.5-6 Hz. Het patroon van de actiepotentiaal afvuren is typisch een tonic of kloppend patroon, met een vrij regelmatige interspike interval. Voorbeeld sporen worden getoond in Figuur 2 (2A: loose-patch, 2B: whole-cell).
Deze experimentele aanpak is succesvol in het opnemen van GFP-gelabeld GnRH neuronen in de voorhersenen van volwassen zebravissen (Figuren 3A en 3B). Neuron elektrische activiteit in het uitgesneden, intacte hersenen werd opgenomen in de vergelijkbare manier zoals hierboven beschreven in medaka door losse-patch (figuur 3C) en whole-cell opname ( 
Figuur 1. Gebruikte diermodel voor de TN-GnRH3 neuron onderzoek in deze video A: Adult medaka GnRH3: GFP transgene vissen, links: mannelijk; rechts:.. Vrouwelijke B: confocale beeld van de ventrale uitzicht op de voorhersenen. OB: reukbol; TN: Terminal zenuw GnRH3 neuronen; TELE: grote hersenen; ON:. Oogzenuw C: Hoge vergroting van TN-GnRH3 neuronen getoond in witte doos van het paneel B. (Schaal bar: A: 5 mm; B: 100 urn, C: 20 pm). 
Figuur 2. Spontaneous actiepotentialen opgenomen met TN-GnRH3 neuronen in de huidige-clamp-modus (I = 0) A: Voorbeeld trace van losse-patch opname; B:. Sample trace van whole-cell opname. 
Figuur 3. Registratie van GnRH3: EMD (Emerald groen fluorescent eiwit) neuronenactiviteit uit intacte bereiding bij volwassen transgene zebravis 9 met dezelfde experimentele benadering als beschreven voor de medaka hersenen preparaat A:. GnRH3: EMD neuronen in ventrale telencephalon (VT) en preoptic . gebied (POA) in de voorhersenen van volwassen zebravissen B: GnRH3: EMD neuronen in de hypothalamus (HYPO). Schaal bars: 100 micrometer C:. Sample spoor van losse-patch opname van GnRH3: EMD neuron inVT D:. Sample spoor van whole-cell patch opname van VT.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
GnRH 3: GFP transgene vissen bieden unieke modellen om de neurofysiologische mechanismen die ten grondslag liggen aan de neuronale integratie-en regelgeving in het centrale controle van gedragingen die direct en indirect betrokken zijn bij de voortplanting 3, 8-10 bestuderen. Een van de belangrijke voordelen van dit modelsysteem is dat veel GnRH3 neuronen die GFP dicht bij het ventrale oppervlak van de hersenen, waardoor relatief gemakkelijke toegang tot de neuronen voor elektrofysiologische opname zonder verstoring neurale circuits 6, 9, 11, 12 (figuren 1B en 1C De figuren 3A en 3B). In deze video, hebben we aangetoond zowel los-patch en whole-cell opnames van TN-GnRH3 neuronen in de intacte volwassen hersenen van medaka vis. TN-GnRH3 neuronen vertonen een tonic of slaan patroon van spontane actiepotentiaal verbranding met een frequentie van 0,5-6Hz.There waren geen detecteerbare sekseverschillen in spontane verbrandingtarief 5, maar er waren dramatische ontwikkelingsstoornissen veranderingen in GnRH3 neuron elektrische activiteiten tijdens de embryogenese 9. Loose-patch en hele-cel elektrofysiologie verschillende methodologische en nadelen. Loose-patch is technisch eenvoudiger dan whole-cell opname, maar toont alleen de neuron vuren patroon en de frequentie. Rustmembraanpotentiaal, vuurpatroon en frequentie, actiepotentiaal analyse membraan capaciteit en weerstand: Anderzijds kan whole-cell opname veel meer informatie. Omdat losse-patch opname niet breekt het celmembraan en verstoren de intracellulaire ion en tweede boodschapper concentraties, is het ideaal voor langdurige registratie van neuronale activiteit. Whole cell opnames scheuren de celmembraan en uiteindelijk leiden tot dialyse van intracellulaire moleculen, daardoor potentieel veranderen neuron eigenschappen met meer langdurige opnames. Vanwege de voordelen en nadelen van zowel elektrofysiologischesche methoden, kan het belangrijk neuron eigenschappen met beide technieken te bestuderen. Omdat zowel pH en osmolariteit zijn zeer belangrijk voor neuron overleving en functie alle oplossingen gebruikt moeten correct ingesteld.
Om de identiteit van de opgenomen neuron bevestigen, wordt een negatieve druk uitgeoefend nadat de opname en fluorescentie bij het uiteinde van de elektrode is bevestigd met microscopische fluorescentie beeldvorming. Kleine moleculaire kleurstoffen of probes (zoals Alexa Fluor 568 kleurstof of biocytine) worden opgenomen in de intracellulaire oplossing voor de gehele-cel opname van de opgenomen neuron voor verdere morfologische analyse markeren.
Om succesvol op van doelneuronen in intacte hersenen, de diepte van de locatie van de neuronen cruciaal - hoe dieper de neuronen, het moeilijker patch (zowel los-patch en hele-cel). Algemeen het haalbare diepte voor succesvolle patching is ongeveer 5-6 cellagen van het oppervlak. Medaka TN-GnRH3 neuronen zijn met name op het ventrale oppervlak van de hersenen, terwijl zebravis hypothalamus GnRH3 neuronen kan tot 6 cellagen van het oppervlak. Positieve druk is zeer nuttig om de registratie-elektrode niet verstoppen tijdens het naderen van de cellen. Dit soort experimentele benadering kan worden gebruikt voor elke neuron dat genetisch gemerkt met fluorescerende eiwit. Om GnRH neuron activiteit in de volwassen hersenen te bestuderen, we routinematig gebruik medaka vis en zebravis van 4-6 maanden oud. De jongere vissen met kleinere hersenen of ouder vissen met meer verkalkte schedels, zal de dissectie meer uitdagend te maken. De TN: GnRH3 neuronen gemakkelijk toegankelijk voor elektrofysiologie van volwassen hersenen medaka, maar dit is niet voor volwassen zebravissen waarin TN: GnRH3 neuronen ingekapseld in een harde mantel bindweefsel. Anderzijds, GnRH3 neuronen in POA, VT, hypothalamus en zijn gemakkelijk toegankelijk voor elektrofysiologie in volwassen hersenen zebravis dan uit medaka. Er zijn geen sexverschillen op de problemen van dissectie en elektrofysiologie registratie van deze species.
Hoewel dit niet een in vivo experimentele benadering, het opnemen van de relatief intacte neuronale circuits met minimale schade is een aantrekkelijke manier om de fysiologische functie en regulatie van het neuronale systeem van belang te verkennen. De intacte voorbereiding hersenen duurt uren, en een goede opname kan duren voor meer dan een uur 6. Dit protocol is geschikt voor onderzoekers die al een basiskennis hebben van en ervaring met elektrofysiologie technieken 13, en zo goed als de gespecialiseerde apparatuur die nodig is om het werk te doen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken Dr Meng-Chin Lin en mevrouw Yuan Dong voor technische ondersteuning. Dit werk werd ondersteund door een subsidie van de National Institutes of Health HD053767 (onderaanneming te NLW), en door fondsen van de afdeling Fysiologie en Bureau van de vice-kanselier voor Research, Universiteit van Californië-Los Angeles (NLW).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope | Olympus | BX50W (Upright) | |
| Amplifier | Axon Instruments | Axoclamp 200B | |
| A-D converter | Computer Interference Corp. | Digidata ITC-18 | |
| Cooled CCD camera | PCO Computer Optics | Sensicam | |
| Xenon lamp | Sutter Instruments Co. | ||
| GFP filter set | Chroma Technologies | ||
| Imaging Software | Intelligent Imaging Innovations | Slidebook software | |
| Electrophysiology Data Acquisition Software | Axon Instruments | Axograph software | |
| Electrophysiology Data Acquisition Software | AD Instruments Inc. | PowerLab | |
| Headstage for electrophysiology | Axon Instruments | CV 203BU | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument Co | MP-285 | |
| Recording Chamber Platform | Warner Instrument Corp. | P1 | |
| Recording Chamber | Warner Instrument Corp. | RC-26G | |
| Electrode Puller | Sutter instruments | P87 | |
| Filament for electrode puller | Sutter Instruments | FB330B | 3.0 mm wide trough filament |
| 1.5 mm glass capillaries | World Precision Instruments | 1B150-4 | Micr–lectrode for recording |
| Syringe | Becton Dickinson | 309586 | 3 ml |
| MS-222 | Sigma | E10521-10G | Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt |
| Fish saline | mM: 134 NaCl; 2.9 KCl; 2.1 CaCl2; 1.2 MgCl2; 10 HEPES | ||
| Electrode solution (loose-patch) | mM: 150 NaCl; 3.5 KCl; 2.5 CaCl2; 1.3 MgCl2; 10 HEPES; 10 glucose | ||
| Electrode solution (whole-cell patch) | mM: 112.5 K-gluconate; NaCl; 17.5 KCl; 0.5 CaCl2; 1 MgCl2; 5 MgATP; 1 EGTA; 10 HEPES; 1 GTP; 0.1 leupeptin;10 phospho-creatine |
References
- Kah, O., Lethimonier, C., Lareyre, J. J. Gonadotrophin-releasing hormone (GnRH) in the animal kingdom. J. Soc. Biol. 198 (1), 53-60 (2004).
- Ramakrishnan, S., Wayne, N. L. Social cues from conspecifics alter electrical activity of gonadotropin-releasing hormone neurons in the terminal nerve via visual signals. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 297 (1), R135-R141 (2009).
- Abe, H., Oka, Y. Mechanisms of neuromodulation by a nonhypophysiotropic GnRH system controlling motivation of reproductive behavior in the teleost. 57 (6), 665-674 (2011).
- Oka, Y. Tetrodotoxin-resistant persistent Na+ current underlying pacemaker potentials of fish gonadotrophin-releasing hormone neurones. J. Physiol. 482 (Pt. 1), 1-6 (1995).
- Zhao, Y., Wayne, N. L. Effects of Kisspeptin1 on Electrical Activity of an Extrahypothalamic Population of Gonadotropin-Releasing Hormone Neurons in Medaka. PLoS One. 7 (5), e37909 (2012).
- Wayne, N. L., et al. Whole-cell electrophysiology of gonadotropin-releasing hormone neurons that express green fluorescent protein in the terminal nerve of transgenic medaka (Oryzias latipes). Biol. Reprod. 73 (6), 1228-1234 (2005).
- Okubo, K., et al. Forebrain gonadotropin-releasing hormone neuronal development: insights from transgenic medaka and the relevance to X-linked Kallmann syndrome. Endocrinology. 147 (3), 1076-1084 (2006).
- Okubo, K., et al. A novel form of gonadotropin-releasing hormone in the medaka, Oryzias latipes. Biochem. Biophys. Res. Commun. 276 (1), 298-303 (2000).
- Ramakrishnan, S., et al. Acquisition of spontaneous electrical activity during embryonic development of gonadotropin-releasing hormone-3 neurons located in the terminal nerve of transgenic zebrafish (Danio rerio). Gen. Comp. Endocrinol. 168 (3), 401-407 (2010).
- Abraham, E., et al. Targeted gonadotropin-releasing hormone-3 neuron ablation in zebrafish: effects on neurogenesis, neuronal migration, and reproduction. Endocrinology. 151 (1), 332-340 (2010).
- Wayne, N. L., Kuwahara, K. Beta-endorphin alters electrical activity of gonadotropin releasing hormone neurons located in the terminal nerve of the teleost medaka (Oryzias latipes. Gen. Comp. Endocrinol. 150 (1), 41-47 (2007).
- Oka, Y. Three types of gonadotrophin-releasing hormone neurones and steroid-sensitive sexually dimorphic kisspeptin neurones in teleosts. J. Neuroendocrinol. 21 (4), 334-338 (2009).
- Molleman, A. Patch Clamping: An Introductory Guide To Patch Clamp Electrophysiology. , Wiley & Sons. England. (2003).
