Summary
Bu video, karmaşık nöral devreleri koruyan bir bütün beyin hazırlık, belirlenen tek nöronlardan elektriksel aktivite kayıt nasıl gösterecektir. Biz gonadotropin salgılatıcı hormon (GnRH) nöronlar genetik sağlam beyin hazırlanmasında tanımlama için bir floresan protein ile etiketlenmiş edildiği transgenik balık kullanabilirsiniz.
Abstract
Karmaşık davranışlar düzenleyen nöral devrelerin hücre fizyolojisi anlayışı bu iş CNS sinir devresi bozulmadan kalır sağlam bir beyin hazırlanmasında yapılabilir hangi model sistemler kullanılarak büyük ölçüde geliştirilmiştir. Biz gonadotropin salgılatıcı hormon (GnRH) nöronlar genetik sağlam beyinde tanımlanması için yeşil flüoresan protein ile etiketlenmiş edildiği transgenik balık kullanabilirsiniz. Balık GnRH nöron birden fazla nüfusa sahip ve işlevleri onların beyindeki yeri ve 1 ifade ettiği GnRH gen bağlıdır. Biz transgenik Medaka balık bozulmamış beyin (Şekil 1B ve C) kullanarak koku ampuller ile ilişkili terminal sinirler (TN) bulunan GnRH3 nöronlar bizim gösteri odaklanmıştır. Çalışmalar Medaka TN-GnRH3 nöronlar merkezi sinir sistemi ile dış çevreden bir bilgi verici olarak hareket eden, nöromodülatör olduğunu göstermektedir; they gibi tanınmış hipotalamik GnRH1 nöronlar 2, 3 yapmak. TN-GnRH3 nöronların spontan aksiyon potansiyeli ateşleme tonik desen içsel bir özellik 4-6, frekans, hipofiz-gonadal fonksiyonları düzenleyen doğrudan bir rol oynamaz hangi conspecifics 2 ve nöropeptid kisspeptin 1 5 ila görsel ipuçları ile modüle edilir. Bu video, TN-GnRH3 nöronların nasıl nöronlar belirlemek ve tüm beyin kendi elektriksel aktivite izlemek için size göstermek için gelişmiş yeşil flüoresan protein 7 bağlantılı Gnrh3 promotor bölgesinde içeren bir transgen ifade edildiği transgenik Medaka istikrarlı bir satırını kullanın Hazırlık 6.
Protocol
1. Yetişkin Medaka gelen Brain diseksiyonu
- Daldırma tarafından (Şekil 1A) kadın ya da erkek yetişkin anestezisi 5 ml MS-222 (150 mg / L, pH 7.4); solungaçları hareketleri decapitating önce durdurdu sonra birkaç dakika bekleyin. Tüm işlemler California-Los Angeles Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmıştır.
- 60 mm çapında Petri kabındaki makas ile operculum'un kuyruk sonunda balık tuzlu su içinde balık başını kesmek.
- 35 mm çapında Petri kabı transfer balık kafası, yarım tuzlu balık dolu ve beyin diseksiyon için baş konumlandırmak ve korumak için bir depresyon vardır Sylgard ile kaplı. Konum ve böcek işaretçilerine ile baş dorsal tarafı yukarı sabitleyin.
- Dikkatlice ince makas ile çevresinde kafatasının dorsal kısmı kesilmiş ve hafifçe tamamen omuriliğin ön kısmı dahil olmak üzere beynin dorsal kısmı açığa forseps ile çıkarın. <li> ince ucu forseps ile yavaşça omurilik kaldırın ve ince uçlu makas ile ikili bağ sinirler sever: beynin ventral tarafta kranial sinirler, spinal sinirler ve optik sinirler ve ön kısmında koku sinirlerinin beyin.
- Balık tuzlu su ile dolu yeni bir Petri kabındaki tamamen disseke beyin yerleştirin ve tüm beyin herhangi bir kesik veya delikler olmadan (hipofiz bezi dahil) sağlam olduğundan emin olmak için mikroskop altında dikkatle kontrol edin. Hasarlı beyinleri deney için kullanılmaz.
2. Bir Kayıt Odası Beyin Montaj
- Siyanoakrilat küçük bir damla ya da kayıt odasının merkezine bir iğne ile diğer bazı hızlı etkili tutkal yerleştirin ve 1 cm yaklaşık 2 tutkal yayıldı.
- Hızlı bir ventral tarafı yukarı konumda beyin ve tutkal aşağı aktarın.
- Bu kayıt gözü doldurur ve beyin kapsar, böylece balık 1 ml tuzlu su ekleyin. Sürekli serpmeken az 200 ul / dak 'lık bir hızda tuzlu su ile gazlı balık beyin.
- Ince ucu kullanılarak dikkatlice beyin kayıt alanının yüzeyi üzerinde zarları forseps çıkarın.
3. Elektrofizyoloji
- Aksiyon potansiyeli ateşleme gevşek yama kayıt
- Cam Mikroelektronlar (M 6-10) bir elektrot çektirmesi (örneğin Sutter P-87) ile borosilikat cam pipetler (1B150F-4, Dünya Hassas Aletler) inşa ve geri yarım yukarı gevşek yama kayıt çözümü ile doldurulur elektrot.
- Bir soğutmalı şarj bağlı cihaz (CCD) kamera ile dik bir floresan mikroskop kullanılarak, GFP-ifade 10x ile TN-GnRH3 nöronlar (Şekil 1B), sonra 40x suya daldırma hedefleri (Şekil 1C) bulabilirsiniz. Onlar telencephalon sadece ön koku ampuller, en ventral yüzeyinde veya yakınında bulunmaktadır.
- Sağlayan bir video monitörü geçinmikroskop gerçek zamanlı görüntü TN-GnRH3 nöron kümesi (Şekil 1C) bulmak için.
- Elektrot ucu nöron hedefin üzerinde olduğunu, banyo içine mikroelektrot yerleştirin. Bu hale tıkanmış ve yavaşça elektrot ucu ile hedef nöron yaklaşım değildir böylece mikroelektrot sürekli hafif pozitif basınç uygulayın.
- AxoGraph yazılım ve Axograph yazılım (Axon Instruments) ile amplifikatör Axoclamp 200B kullanarak gerilim-kelepçe modunda elektrot direnci kontrol edin ve izleyin. Eğer elektrot ucu nöron yüzeyinde ve direnç biraz değiştirir AxoGraph ekrandan olduğunu video monitörden görebilirsiniz zaman, düşük bir direnç mühür yapmak için pozitif basınç serbest ve gerekirse hafif negatif basınç uygulayın nöron (<100 MQ).
- Akım kelepçe moduna geçin ve ölçek ayarlayarak, herhangi bir akım girişi olmadan sürekli membran gerilimi kayıtGerilim ve kayıt gerektiğinde oranının. Veri Powerlab yazılım (ADInstruments A.Ş.) tarafından toplanan ve analiz edilir.
- Herhangi bir tedavi (Şekil 2A) önce yaklaşık 5 dakika için normal bir balık tuzlu su içinde rekor temel elektriksel aktivite. Ilaçlar, hormonlar, peptidler, vb Bath perfüzyon. Balık bir tuza ilave edilmesi, normal tuzlu su balıkları 5, 6, 11, bir yıkanıp temizlenme süresi ile, ardından 200 ul / dk hızında devam eder.
- Membran potansiyeli tüm hücre kayıt
3.1.4 - tüm hücre yama kelepçe elektrofizyolojik işlem adımları 3.1.1, yukarıda tarif edilen hücre-dışı gevşek yama kayıt prosedürü bu kadar aynıdır. Daha sonra, buna göre usul sapma:- Gerilim-kelepçe modunda elektrot direnci kontrol edin ve izleyin. Eğer direnç değişiklikleri biraz, olumlu serbest olduğu elektrot ucu nöron yüzeyinde ve osiloskop ait olduğunu video monitörden görebilirsiniz zamanbasınç ve nöron (~ 3 Giga Ω) bir yüksek direnç mühür yapmak için biraz negatif basınç uygulayın. Rüptürü yamalı membran ağızdan bir negatif basınç uygulayın, siz MQ hakkında 120-250 için direnç ani bir düşüş göreceksiniz.
- Akım kelepçe moduna geçin ve kayıt gerekirse gerilim ve hız ölçeği ayarlama, herhangi bir akım girişi olmadan sürekli membran gerilimi kaydedin.
- Herhangi bir tedaviden önce yaklaşık 5 dakika için normal tuzlu su içinde balık kayıt taban elektriksel aktivite yanı 3.1.7 (Şekil 2B) olarak yukarıda tarif edilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Medaka balık Kesilerek çıkarılan beynin GFP-etiketli TN-GnRH3 nöronların ikili kümelerinin bir örneği Şekiller 1B ve 1C 'de gösterilmiştir. Her küme 8-10 GnRH nöronları içerir. Hedef TN-GnRH3 kendiliğinden nöronal aktiviteleri 0.5-6 Hz tipik ateş oranları ile akım kelepçe modu (I = 0) kaydedildi. Aksiyon potansiyeli ateşleme paterni oldukça düzenli interspike aralığı ile, tipik bir tonik veya dayak kalıptır. Örnek izleri Şekil 2 (:;: tam hücre 2B gevşek yama 2A) 'de gösterilmiştir.
Bu deneysel bir yaklaşım yetişkin Zebra balığı (Şekil 3A ve 3B) ön beyin bulunan GFP etiketli GnRH nöronlardan kayıt da başarılı. Gevşek yama (Şekil 3C) ve tam hücre kayıt (göre Medaka yukarıda tarif edildiği gibi çıkarıldı, sağlam beyin nöron elektriksel aktivite benzer bir şekilde kaydedilmiştir 
Şekil 1. Bu video TN-GnRH3 nöron çalışma için kullanılan hayvan modeli A: Yetişkin Medaka GnRH3: GFP transgenik balık, sol: erkek; sağ:.. Kadın B: ön beyin ve ventral bakış Konfokal görüntü. OB: koku ampul; TN: Terminal sinir GnRH3 nöronlar; TELE: telencephalon; ON:. Optik sinir C: paneli B. beyaz kutu (Ölçek çubuğu gösterilir TN-GnRH3 nöronların yüksek büyütme: A: 5 mm, B: 100 mikron, C: 20 mikron). 
Şekil 2. DPTakım kelepçe modu (I = 0), TN-GnRH3 nöronlardan kaydedilen ntaneous aksiyon potansiyelleri A: gevşek yama kayıt örnek eser, B:. tam hücreli kayıt örnek eser. 
Şekil 3,. GnRH3 kaydı: Merck (Emerald yeşil floresan protein) Medaka beyin hazırlanması için tarif edildiği gibi aynı deneysel yaklaşım kullanılarak yetişkin için transgenik zebrabalıkları 9 arasında sağlam bir beyin nöron aktivitesi hazırlanması A:. GnRH3: ventral telencephalon (VT) ve preoptik bulunan Merck nöronlar . yetişkin zebrafish önbeyin alanı (£) B: GnRH3: Hipotalamus (HYPO) yer EMD nöronlar. Ölçek çubukları: 100 mikron C:. GnRH3 gevşek-yama kayıt örnek eser: EMD nöronVT D:. VT den tam hücreli yama kayıt örnek eser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
GnRH 3: GFP transgenik balıklar nöronal entegrasyon ve doğrudan ve dolaylı olarak üreme 3, 8-10 dahil her ikisi de davranışları merkezi kontrol düzenleme altında yatan nörofizyolojik mekanizmaları incelemek için benzersiz modelleri sağlar. Bu model sisteminin önemli avantajlarından biri, GFP ifade eden birçok GnRH3 nöronların sinir devreleri 6, 9, 11, 12 (Şekil bozmadan elektrofizyolojik kayıt için nöronlara nispeten kolay erişim sağlayan, beyin ventral yüzeyi yakın olmasıdır 1B ve 1C, Şekil 3A ve 3B). Bu video, Medaka balık sağlam yetişkin beyninde TN-GnRH3 nöronlar hem gevşek-yama ve tam hücreli kayıtları göstermiştir. Kendiliğinden ateş hiçbir tespit cinsiyet farklılıkları TN-GnRH3 nöronlar tonik veya 0.5-6Hz.There bir frekans ile ateş spontan aksiyon potansiyeli dayak desen sergiler vardıoranı 5, ama GnRH3 nöron elektrik faaliyetlerinde dramatik gelişimsel değişiklikler embriyogenez 9 sırasında vardı. Gevşek-yama ve tam hücreli elektrofizyoloji farklı metodolojik avantaj ve dezavantajları vardır. Gevşek-yama tam hücreli kayıt daha teknik olarak daha kolaydır, ama sadece nöron ateşleme desen ve frekansı gösterir. Istirahat membran potansiyeli, ateş desen ve frekans, aksiyon potansiyeli analizi, membran kapasitans ve direnç: Öte yandan, tam hücreli kayıt çok daha fazla bilgi sağlayabilir. Gevşek yama kayıt hücre zarı kırmak ve hücre içi iyon ve ikinci haberci konsantrasyonları bozmayan için, nöronal aktivitenin uzun süreli kayıt için idealdir. Tüm hücre kayıtları rüptürü hücre zarı ve sonunda böylece potansiyel daha uzun süreli kayıtları ile nöron özelliklerini değiştirerek, hücre içi moleküllerin diyaliz yol. Çünkü elektrofizyolojik hem de avantaj ve dezavantajlarıological yöntemleri, her iki teknikleri kullanılarak nöron özelliklerini incelemek için önemli olabilir. PH ve osmolaritesi hem nöron hayatta kalma ve fonksiyonu için çok önemli olduğu için, kullanılan tüm çözümleri düzgün ayarlanması gerekir.
Kaydedilen nöronun kimliğini doğrulamak için, negatif basınç kayıt tamamlanmasından sonra uygulanır ve elektrot ucu daha sonra da floresan mikroskop floresan görüntüleme kullanılarak teyit edilir. Küçük molekül boyalar veya sondalar (Alexa Fluor 568 boya veya biocytin gibi) daha fazla morfolojik analiz için kaydedilen nöron işaretlemek için bütün hücre kayıt için hücre içi çözelti dahil edilebilir.
Sağlam beyindeki hedef nöronlar başarıyla kaydetmek için, nöronların yeri derinliği çok önemlidir - derin nöronlar, yama (gevşek-yama ve tam hücreli iki) için zor. Genel olarak, başarılı yama için uygun derinlik yüzeyden yaklaşık 5-6 hücre tabakaları olduğunu. Medzebrabalıkları hipotalamus nöronları GnRH3 kadar yüzeyden 6 hücre katmanları olabilir iken aka TN-GnRH3 nöronlar, beynin ventral yüzeyi tipik olarak. Pozitif basınç hücreleri yaklaşırken tıkanmasını kayıt elektrot önlemek için çok yararlıdır. Deneysel Bu tür bir yaklaşım genetik floresan protein ile etiketlenmiş olan herhangi bir nöron için kullanılabilir. Yetişkin beyin GnRH nöron aktivitesini incelemek için, rutin yaş 4-6 ay Medaka balık ve Zebra balığı kullanın. Küçük beyinleri veya daha fazla kalsifiye kafatası ile eski balık, ile küçük balıklar diseksiyon daha zorlu hale getirecek. TN: GnRH3 nöronlar zor bir bağ kılıf kaplı şunlardır: GnRH3 nöronların yetişkin Medaka beyinden elektrofizyoloji için kolayca erişilebilir, ancak bu yetişkin zebrafish için durum böyle değil hangi TN. Öte yandan, GnRH3 Talep Üzerine, VT nöronları ve hipotalamus daha kolay erişilebilir elektrofizyoloji yetişkin zebrabalıkları beyinde Medaka den daha vardır. Seks yok yokdiseksiyon ve türlerin birinin elektrofizyoloji kayıt zorluklar dayalı farklılıklar.
Bu in vivo deneysel yaklaşımın bir olmasa da, en az zararla nispeten sağlam nöronal devrelerden kayıt fizyolojik fonksiyonu ve ilgi nöronal sistemin düzenlenmesi keşfetmek için çekici bir yoludur. Bozulmamış beyin hazırlanması saat sürer ve iyi bir kayıt bir saat 6 üzerinde sürebilir. Bu protokol zaten temel bilgi ve elektrofizyoloji teknikleri 13 ile deneyim ve hem de iş yapmak için gerekli özel donanıma sahip araştırmacılar için uygundur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Teknik yardım için Dr Meng-Çene Lin ve Bayan Yuan Dong teşekkür ederim. Bu çalışma Sağlık HD053767 Ulusal Enstitüsü (NLW için fason), bir hibe ile ve California-Los Angeles Araştırma, Üniversitesi (NLW) için Rektör Yardımcısı fizyolojisi ve Office Bölümü'nden fonları tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope | Olympus | BX50W (Upright) | |
| Amplifier | Axon Instruments | Axoclamp 200B | |
| A-D converter | Computer Interference Corp. | Digidata ITC-18 | |
| Cooled CCD camera | PCO Computer Optics | Sensicam | |
| Xenon lamp | Sutter Instruments Co. | ||
| GFP filter set | Chroma Technologies | ||
| Imaging Software | Intelligent Imaging Innovations | Slidebook software | |
| Electrophysiology Data Acquisition Software | Axon Instruments | Axograph software | |
| Electrophysiology Data Acquisition Software | AD Instruments Inc. | PowerLab | |
| Headstage for electrophysiology | Axon Instruments | CV 203BU | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument Co | MP-285 | |
| Recording Chamber Platform | Warner Instrument Corp. | P1 | |
| Recording Chamber | Warner Instrument Corp. | RC-26G | |
| Electrode Puller | Sutter instruments | P87 | |
| Filament for electrode puller | Sutter Instruments | FB330B | 3.0 mm wide trough filament |
| 1.5 mm glass capillaries | World Precision Instruments | 1B150-4 | Micr–lectrode for recording |
| Syringe | Becton Dickinson | 309586 | 3 ml |
| MS-222 | Sigma | E10521-10G | Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt |
| Fish saline | mM: 134 NaCl; 2.9 KCl; 2.1 CaCl2; 1.2 MgCl2; 10 HEPES | ||
| Electrode solution (loose-patch) | mM: 150 NaCl; 3.5 KCl; 2.5 CaCl2; 1.3 MgCl2; 10 HEPES; 10 glucose | ||
| Electrode solution (whole-cell patch) | mM: 112.5 K-gluconate; NaCl; 17.5 KCl; 0.5 CaCl2; 1 MgCl2; 5 MgATP; 1 EGTA; 10 HEPES; 1 GTP; 0.1 leupeptin;10 phospho-creatine |
References
- Kah, O., Lethimonier, C., Lareyre, J. J. Gonadotrophin-releasing hormone (GnRH) in the animal kingdom. J. Soc. Biol. 198 (1), 53-60 (2004).
- Ramakrishnan, S., Wayne, N. L. Social cues from conspecifics alter electrical activity of gonadotropin-releasing hormone neurons in the terminal nerve via visual signals. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 297 (1), R135-R141 (2009).
- Abe, H., Oka, Y. Mechanisms of neuromodulation by a nonhypophysiotropic GnRH system controlling motivation of reproductive behavior in the teleost. 57 (6), 665-674 (2011).
- Oka, Y. Tetrodotoxin-resistant persistent Na+ current underlying pacemaker potentials of fish gonadotrophin-releasing hormone neurones. J. Physiol. 482 (Pt. 1), 1-6 (1995).
- Zhao, Y., Wayne, N. L. Effects of Kisspeptin1 on Electrical Activity of an Extrahypothalamic Population of Gonadotropin-Releasing Hormone Neurons in Medaka. PLoS One. 7 (5), e37909 (2012).
- Wayne, N. L., et al. Whole-cell electrophysiology of gonadotropin-releasing hormone neurons that express green fluorescent protein in the terminal nerve of transgenic medaka (Oryzias latipes). Biol. Reprod. 73 (6), 1228-1234 (2005).
- Okubo, K., et al. Forebrain gonadotropin-releasing hormone neuronal development: insights from transgenic medaka and the relevance to X-linked Kallmann syndrome. Endocrinology. 147 (3), 1076-1084 (2006).
- Okubo, K., et al. A novel form of gonadotropin-releasing hormone in the medaka, Oryzias latipes. Biochem. Biophys. Res. Commun. 276 (1), 298-303 (2000).
- Ramakrishnan, S., et al. Acquisition of spontaneous electrical activity during embryonic development of gonadotropin-releasing hormone-3 neurons located in the terminal nerve of transgenic zebrafish (Danio rerio). Gen. Comp. Endocrinol. 168 (3), 401-407 (2010).
- Abraham, E., et al. Targeted gonadotropin-releasing hormone-3 neuron ablation in zebrafish: effects on neurogenesis, neuronal migration, and reproduction. Endocrinology. 151 (1), 332-340 (2010).
- Wayne, N. L., Kuwahara, K. Beta-endorphin alters electrical activity of gonadotropin releasing hormone neurons located in the terminal nerve of the teleost medaka (Oryzias latipes. Gen. Comp. Endocrinol. 150 (1), 41-47 (2007).
- Oka, Y. Three types of gonadotrophin-releasing hormone neurones and steroid-sensitive sexually dimorphic kisspeptin neurones in teleosts. J. Neuroendocrinol. 21 (4), 334-338 (2009).
- Molleman, A. Patch Clamping: An Introductory Guide To Patch Clamp Electrophysiology. , Wiley & Sons. England. (2003).
