Summary
Вирусные векторы позволяют целевой манипуляции генов. Мы демонстрируем метод условное выражение гена или абляции в спинном мозге мышей, с использованием стереотаксической инъекции вирусного вектора в заднем роге, известный сайт синаптических контактов между первичной соматосенсорной афферентов и нейронов центральной нервной системы.
Abstract
Интрапаренхимальные инъекции вирусного вектора позволяет условные манипуляции генов в различных популяциях нейронов или отдельных регионов центральной нервной системы. Мы демонстрируем стереотаксической техники инъекции, которые позволяют целевых экспрессии гена или глушителей в дорсальных рогов спинного мозга мыши. Хирургическая процедура является кратким. Это требует ламинэктомия одного позвонка, обеспечивая быстрое восстановление животного и беспрепятственный подвижность позвоночника. Контролируемое введение небольшого объема подвески вектора на низкой скорости и использованию микрошприца со скошенными канюли стекла свести к минимуму ткани поражения. Местный иммунный ответ на вектора зависит от внутренних свойств вируса занятых; по нашему опыту, это незначительный и недолговечным, когда рекомбинантный адено-связанный вирус используется. Ген-репортер, такие как усовершенствованные зеленого флуоресцентного белка облегчает контроль пространственное распределение вектора, а также эффективность и клеточных образцахficity трансфекции.
Introduction
Передовые технологии условного манипуляции генов у мышей позволяют многогранного подхода к изучению синаптических путей и функциональных связей в центральной нервной системе. Трансгенов может регулироваться малые молекулы эффекторы, такие как доксициклин, действующих на тетрациклин-контролируемой трансактиватор, которые могут быть разработаны, чтобы функционировать как репрессор или активатор транскрипции генов, или тамоксифен признании мутировал лиганд-связывающий домен рецептора эстрогена 1 . Необратимое изменение трансгенов обычно достигается путем дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) рекомбиназ. Cre (причины рекомбинации) и ФЛП (flippase рекомбинации фермент) катализирует вырезание, инверсии или транслокации фрагментов ДНК, которые в окружении loxP (локус пересечения х более, P1) или Frt (flippase распознавания целей) сайтов, соответственно 1. Приложения включают активацию гена или глушителей и индуцируемой рибонуклеиновой кислоты (РНК) помех
4. Высокая емкость (слабый), аденовирусы, адено-связанный вирус, вирус простого герпеса и лентивирус обычно используются нейротропных векторов. Выбор соответствующего вируса для исследования вопроса является важной частью эксперимента. Размер трансгена, маршрут доставки, специфика инфекции в нейронах, в отличие от глиальных клеток, инфекция эффективность, воспалительных и токсических побочных эффектов необходимо учитывать 4.
Здесь мы описываем стереотаксической инъекции вирусного вектора в заднем роге спинного мозга, метод, который мы используем для условного регуляции генов в наших исследованиях по нейробиологии боли. Заднего рога получает афферентного входа от первичной соматосенсорной нейронов в том числе ноцицептивных нейронов. Местные интернейроны обрабатывать информацию, прежде чем проекция нейроны передают его иззаднем роге в мозг 5. Мы демонстрируем инфекции нейронов заднего рога спинного сегментарных на уровне L4 с нейротропных рекомбинантный адено-связанный вирус (rAAV), который выражает усиливается зеленого флуоресцентного белка (EGFP) под постоянно активной цитомегаловирусной промоутер.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Хирургическая процедура, описанная был одобрен Институциональные уходу и использованию животных комитета (IACUC) из Колумбийского университета.
1. Подготовка оборудования и подвески Вирус частиц
- Очистка и дезинфекция оборудования, стерилизации хирургических инструментов и выемку V шипы, которые будут использоваться, чтобы исправить позвонка L1.
- Потяните и пипетки конических стекла. Мы используем пипетки, которые имеют наконечник диаметром 40 мкм, а скошены под углом 20 °. Стерилизовать стеклянных пипеток.
- Установить стереотаксической рамы, закрепите микрошприца инжектор на манипуляторе и подключить инжектор контроллер.
- Прикрепите одну из стеклянных пипеток в микрошприца с использованием набора компрессионный фитинг.
- Снимите поршень с микрошприца и заполнить шприц с минеральным маслом. Oil Red O (1 - (2,5-диметил-4-(2,5-dimethylphenylazo) фенилазо)-2-нафтол) могут быть добавлены к минеральным маслом, чтобы увеличить свой объемisibility. Вставьте поршень и подтолкнуть ее к весь путь к вершине. Тщательно избегать создания пузырьков воздуха.
- Подготовка подвески вирусной частицы в шкаф биологической безопасности. Разморозить замороженный вирус на льду и, непосредственно перед употреблением, разбавьте его стерильной фосфатно-солевой буфер в нужную концентрацию частиц.
- Вставьте микрошприца в держатель на инжектор.
- Внесите 5 мкл суспензии вируса на небольшой пластиковый лист, например, Parafilm. Опустите наконечник стеклянной пипетки в каплю и потяните поршень, чтобы заполнить микрошприца. Создать небольшой пузырек воздуха на кончике пипетки, чтобы предотвратить его от засорения.
2. Ламинэктомия
- Подготовка операции область, протирая скамейку и грелку с дезинфицирующим средством.
- Anesthetize мыши. Мы используем ингаляционной анестезии изофлураном (3% во время индукции, 2% -3% во время технического обслуживания).
- Место смазки на каждый глаз для защиты глаз от высыхания в течениеоперации.
- Бритье меха от нижней части спины к шее мыши и дезинфицируют кожу с переменным салфеток местного антисептика, такие как хлоргексидин или повидон-йода и 70% этанола. Изолировать асептически подготовленной площадке с хирургической драпировка и проникнуть в разрез с сайта бупивакаина (0,25%, разбавленный 1:10 с физиологическим раствором).
- Надрезать кожу на хвостовом конце грудную клетку вдоль средней линии (2-3 см) и отделить фасция охватывает позвоночник.
- Поскольку спинной мозг перестает расти раньше во время послеродового развития, чем позвоночника, спинного сегменте L4 лежит под первого поясничного позвонка (L1). Позвонка L1 находится в хвостовой позвонок, который содержит последнюю пару ребер. Выявления и разоблачения позвонка L1 путем удаления небольших мышц спины и связок придает его спинной поверхности.
- Слегка приподнимите и удерживайте L1 позвонка с щипцами Адсон. Используйте специальный пинцет ламинэктомия для удаления спинного Portioп позвонков (позвоночник и пластинки) и подвергать спинного мозга. Избегайте повреждения спинного мозга.
- Передача мыши на нагревательной пластины в стереотаксической рамы. Следите за температурой мыши во время последующей эксплуатации.
3. Впрыск
- Исправить позвонка L1 с шипами V качеством. Шипы должны стабилизировать позвоночник так, что позвонки не двигаться во время дыхания.
- Принесите микрошприца ближе так, чтобы кончик пипетки выше ламинэктомия сайта. Опустите поршень, пока не увидите суспензии вируса выходе из пипетки. Удалите капли стерильным наконечником хлопка.
- Поместите пипетку в ростральной-самая часть подвергается спинного мозга. Центр пипетки над задним срединная борозда, затем переместите наконечник 500 мкм с боков. Опустите наконечник к поверхности мозга и пункция твердой мозговой оболочки, или, если вы работаете с unbeveled пипетки стекла, используют скошенный канюли стали для прокола гура. Опустите кончик стеклянной пипетки 300 мкм в спинной мозг.
- Вводят 1 мкл суспензии вируса в размере 200 Нл / мин.
- В конце инъекции, подождите не менее 2 минут прежде, чем медленно втягивания пипетки.
- Повторите шаги с 3,3 до 3,5 на хвостовом-самая часть подвергается спинного мозга для достижения полного распределения вирусного вектора в спинном L4 сегмента. Двух участках инъекций расположены ростральной и каудальной в сегменте L4, чтобы избежать повреждения тканей в целевом регионе.
4. Ушивание раны
- Выпуск позвонка L1 от зажимов V вырез и удалите мышь от стереотаксической рамы.
- Шовный фасции с 5,0 Викрил. Закрытая фасции обеспечивает прикрытие для ламинэктомия сайта.
- Закрыть кожи с нейлоновыми швами или хирургических скоб.
5. Ведение послеоперационного периода
- Передача мыши восстановления клетку с мягким, nonparticular постельные принадлежности. Поставьте его на тОн стороне для комфортного дыхания. Мониторинг животного, пока оно полностью предупреждение, амбулаторное и начинает пить.
- Мы предоставляем послеоперационного обезболивания в течение 72 часов с ежедневно подкожные инъекции карпрофена (5,0 мг / кг).
- Мониторинг послеоперационного восстановления, ежедневный осмотр в течение первых 3 дней, затем через день или 3 дня в неделю, пока эксперимент завершен.
- Снимите кожу швы или скобы от 7 до 10 дней после операции, когда заживление ран завершена.
- Усыпить животное после завершения эксперимента.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Успешный выход трансфекции надежные экспрессии генов в нейронах заднего рога впрыском (рис. 1), не щадя спинного рога противоположной стороны, вентральный рог и спинной ганглии.
Рисунок 1. Трансфекция нейронов заднего рога. (A) Выражение флуоресцентных EGFP репортер (зеленый) в левом заднем роге из L4 спинного мозга, через две недели после стереотаксической инъекции rAAV-EGFP (серотип AAV2 / 8, 10 9 геномных копий / мкл). Нейроны иммуноокрашиванию для нейронов белки ядер (NeuN, красный). Стрел указывают на разбросанные трансфицированных глиальных клеток в спинной колонки. Шкала бар, 150 мкм. (B) около 80% нейронов в медиальной заднего рога были инфицированы. Шкала бар, 20 мкм. Моноклональные антитела против NeuN (EMD Millipore) была использована в разведении 1:2,000 для иммунной окраски.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Стереотаксическая инъекции вектора ориентации позволяет нейронов спинного мозга для приложений, таких как нейронные отображения сети на основе транссинаптических распространения вирусов или 6,7 optogenetic рассечение 8, аксон руководства во время регенерации после травмы 9,10, или генной терапии для профилактики или лечения нейродегенеративных 11, 12. Вирусные векторы были использованы для генной манипуляции в спинной мозг для изучения соматосенсорной, моторных и вегетативных путей 9,10,13-15. Мышь является модель организма наиболее широко используется в исследованиях с участием стереотаксической инъекции вирусного вектора в мозг или спинной мозг, но техника была использована в других видах, включая приматов 16.
Стереотаксическая инъекции вектора в спинном мозге мышей является безопасным, хирургической процедуры, описанные здесь требуется один ламинэктомия в месте инъекции, так что животное восстанавливается без неустойчивостейти в своих движениях позвоночника. Инъекции и медленно удаления канюли являются завершена в течение 10 мин, вся процедура, включая подготовку кожи и закрытие раны длится около 40 мин. Мы предоставляем послеоперационного обезболивания в течение 72 часов с карпрофен, нестероидные противовоспалительные обезболивающие наркотики.
Чтобы свести к минимуму травму тканей, мы используем вытащил стекло канюли с диаметром кончика 40 мкм. Резкое скошенным кончиком канюля облегчает вставку в спинной мозг, оправдывая инвестиции в мясорубке микропипетки. Использование мясорубки также позволяет поддерживать последовательную угла фаски в каждом эксперименте, уменьшая изменения инъекции результаты. Мы предпочитаем автоматизированного контроля скорости впрыска по сравнению с ручной 17 разрешение для равномерного распределения суспензии частиц вируса в заднем роге и снизить риск инъекции ошибки. Не менее важным является медленный вывод канюлю, которая должна быть инициирована 2-5 мин после завершения injectiна, чтобы не привлекать суспензии вируса резервного копирования и вызывает extraspinal разлива.
Объем и распределение интраспинального трансфекции зависит от введенной дозы частиц и внутренние свойства вирусных векторов, таких как серотип и инфекции эффективность. Оптимальное разведение частиц должен быть определен эмпирически для каждого серотипа вируса и и может варьироваться в зависимости от разных партий одного и того же вируса. Эффективность обоих инфекции и трансдукции ДНК также могут отличаться в зависимости от целевой популяции нейронов 18,19. AAV добивается переноса генов в нейронах без патогенных и минимальные побочные эффекты иммунной 20. По нашему опыту, инфекции нейронов заднего рога завершена в течение 1-2 недель и стабильно. Мы наблюдаем незначительные микроглии ответы на инъекции, но эти решен в течение одной недели.
Мы рекомендуем сравнения различных серотипов векторов, экспрессирующих ген-репортер, таких как EGFP для Evaluate трансфекции ставки, определять интервалы времени между инъекцией и стабильной трансфекции и установить, является ли инфекция ограничена нейронами. Специфика будет зависеть от клеточный тропизм вектора, трансфицированных гена и его промоутер. Следователи изучения соматосенсорных пути следует также изучить ганглии задних корешков нейронов для потенциальных выражение гена-репортера, который может возникнуть в результате инфекции эти нейроны в их центральных терминалов в заднем роге или от загрязнения спинномозговой жидкости 19.
В Соединенных Штатах, использование вирусных векторов для генной манипуляции регулируется Руководство NIH для исследований с участием рекомбинантных молекул ДНК ( http://oba.od.nih.gov/rdna/nih_guidelines_oba.html ). Эти правила предусматривают требования к следователю обучения, средств индивидуальной защиты, вирусный вектор сдерживания, decontaminatioп, утилизации загрязненных материалов, таких как использованные шприцы и канюли, и содержания животных после инъекции. Следователи должны работать со своими местными IACUC или аналогичный орган институционального надзора для определения нормы и правила, которые применяются к их исследованиям.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Мы благодарим Bakhos А. Tannous, доктор философии, директор по развитию векторного и производства в неврологии Центра Massachusetts General Hospital, Charlestown, штат Массачусетс, за предоставление нам rAAV-EGFP вектор, и Джон Whang для оказания технической помощи. Эта работа была поддержана грантом R01 NS050408 (на JS) из Национального института неврологических расстройств и инсульта.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Spinal base plate | David Kopf Instruments | 912 | |
| Small animal stereotaxic instrument | David Kopf Instruments | 900 | |
| Mouse gas anesthesia head holder | David Kopf Instruments | 923-B | |
| Adjustable base mounts | David Kopf Instruments | 982 | |
| V notch spikes | David Kopf Instruments | 987 | |
| Small animal temperature control system | David Kopf Instruments | TCAT-2LV | |
| Adson forceps | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Laminectomy forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | |
| UltraMicroPump (one) with SYS-Micro4 Controller | World Precision Instruments | UMP3-1 | |
| Microsyringe, 65RN | Hamilton | 7633-01 | |
| RN compression fitting, 1 mm | Hamilton | 55750-01 | |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Microgrinder | Narishige | EG-44 |
References
- Lewandoski, M. Conditional control of gene expression in the mouse. Nature Reviews Genetics. 2, 743-755 (2001).
- Couto, L. B., High, K. A. Viral vector-mediated RNA interference. Curr. Opin. Pharmacol. 10, 534-542 (2010).
- Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. Genetic dissection of neural circuits. Neuron. 57, 634-660 (2008).
- Davidson, B. L., Breakefield, X. O. Viral vectors for gene delivery to the nervous system. Nature Reviews Neuroscience. 4, 353-364 (2003).
- Todd, A. J. Neuronal circuitry for pain processing in the dorsal horn. Nature Reviews Neuroscience. 11, 823-836 (2010).
- Wall, N. R., Wickersham, I. R., Cetin, A., De La Parra, M., Callaway, E. M. Monosynaptic circuit tracing in vivo through Cre-dependent targeting and complementation of modified rabies virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 21848-21853 (2010).
- Lo, L., Anderson, D. J. A Cre-dependent, anterograde transsynaptic viral tracer for mapping output pathways of genetically marked neurons. Neuron. 72, 938-950 (2011).
- Zhao, S., et al. Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nature Methods. 8, 745-752 (2011).
- Tang, X. Q., Heron, P., Mashburn, C., Smith, G. M. Targeting sensory axon regeneration in adult spinal cord. J. Neurosci. 27, 6068-6078 (2007).
- Cameron, A. A., Smith, G. M., Randall, D. C., Brown, D. R., Rabchevsky, A. G. Genetic manipulation of intraspinal plasticity after spinal cord injury alters the severity of autonomic dysreflexia. J. Neurosci. 26, 2923-2932 (2006).
- Passini, M. A., et al. CNS-targeted gene therapy improves survival and motor function in a mouse model of spinal muscular atrophy. The Journal of Clinical Investigation. 120, 1253-1264 (2010).
- Lutz, C. M., et al. Postsymptomatic restoration of SMN rescues the disease phenotype in a mouse model of severe spinal muscular atrophy. The Journal of Clinical Investigation. 121, 3029-3041 (2011).
- Chen, S. L., et al. dsAAV type 2-mediated gene transfer of MORS196A-EGFP into spinal cord as a pain management paradigm. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 20096-20101 (2007).
- South, S. M., et al. A conditional deletion of the NR1 subunit of the NMDA receptor in adult spinal cord dorsal horn reduces NMDA currents and injury-induced pain. J. Neurosci. 23, 5031-5040 (2003).
- Tappe, A., et al. Synaptic scaffolding protein Homer1a protects against chronic inflammatory pain. Nat. Med. 12, 677-681 (2006).
- Colle, M. A., et al. Efficient intracerebral delivery of AAV5 vector encoding human ARSA in non-human primate. Human Molecular Genetics. 19, 147-158 (2010).
- Carbajal, K. S., Weinger, J. G., Whitman, L. M., Schaumburg, C. S., Lane, T. E. Surgical Transplantation of Mouse Neural Stem Cells into the Spinal Cords of Mice Infected with Neurotropic Mouse Hepatitis Virus. J. Vis. Exp. (53), e2834 (2011).
- Snyder, B. R., et al. Comparison of adeno-associated viral vector serotypes for spinal cord and motor neuron gene delivery. Hum. Gene Ther. 22, 1129-1135 (2011).
- Towne, C., Pertin, M., Beggah, A. T., Aebischer, P., Decosterd, I. Recombinant adeno-associated virus serotype 6 (rAAV2/6)-mediated gene transfer to nociceptive neurons through different routes of delivery. Mol. Pain. 5, 52 (2009).
- Kaplitt, M. G., et al. Long-term gene expression and phenotypic correction using adeno-associated virus vectors in the mammalian. 8, 148-154 (1994).
