Summary
ウイルスベクターは、標的遺伝子操作が可能になります。我々は、脊髄後角へのウイルスベクターの定位注射、一次体性感覚求心性および中枢神経系の神経細胞間のシナプスの接触の著名なサイトを使って、条件付き遺伝子発現やマウス脊髄におけるアブレーションのための方法を示しています。
Abstract
ウイルスベクターの実質内注射は、神経細胞や中枢神経系の特定領域の異なる集団の中の条件遺伝子操作を可能にします。我々は、マウスの脊髄後角における標的遺伝子発現またはサイレンシングを可能に定位注入技術を実証する。手術は短時間です。それは動物と脊椎の健常運動性の迅速なリカバリを提供する、単一の椎骨の椎弓切除術を必要とします。傾斜のガラスカニューレとシリンジの低速および使用に小さなベクター懸濁液量の制御された注射は組織病変を最小限に抑えます。ベクトルの局所免疫応答は、採用ウイルス固有の性質に依存し、我々の経験では、組換えアデノ随伴ウイルスを使用した場合、マイナーと短命です。このような強化された緑色蛍光タンパク質などのレポーター遺伝子は、ベクターの監視空間分布を容易にし、有効性や携帯仕様トランスフェクションのficity。
Introduction
マウスにおける条件遺伝子操作の高度な技術は、中枢神経系におけるシナプス経路と機能の接続の探査への多面的なアプローチを可能にします。導入遺伝子は、エストロゲン受容体1の変異型リガンド結合ドメインを認識するリプレッサーまたは遺伝子の転写活性化因子、またはタモキシフェンとして機能するように設計することができるテトラサイクリン制御トランスに作用するようドキシサイクリンなどの小分子エフェクターによって調節することができる。不可逆的な導入遺伝子の改変は、一般的デオキシリボ核酸（DNA）リコンビナーゼによって達成される。 CRE（原因組換え）とFLP（フリッパーゼ組換え酵素）が切除、反転またはそれぞれ1のloxP（クロスxの軌跡上、P1）またはFRT（フリッパーゼ認識対象）サイトが隣接してDNA断片の転移を触媒する。アプリケーションでは、遺伝子の活性化またはサイレンシングおよび誘導リボ核酸（RNA）干渉を含む
、4利用可能です。大容量（ガット）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、単純ヘルペスウイルスやレンチウイルスは、一般的に神経親和性のベクトルを使用されています。研究課題に適したウイルスを選択すると、実験デザインの重要な部分です。導入遺伝子のサイズ、配送ルート、グリア細胞とは対照的に、神経細胞への感染の特異性、感染症の効能は、炎症性および毒性の副作用が4を考慮する必要があります。
ここでは、脊髄後角へのウイルスベクターを、私たちは痛みの神経生物学上の我々の研究での条件付き遺伝子調節のために採用している手法の定位注射について説明します。後角には侵害受容性ニューロンを含む一次体性感覚ニューロンからの求心性入力を受け取る。投射ニューロンからそれを伝える前に、ローカルの介在ニューロンは情報を処理する脳5〜背角。我々は、構成的に活性サイトメガロウイルスプロモーター下に強化緑色蛍光タンパク質（EGFP）を発現する神経向性組換えアデノ随伴ウイルス（rAAVの）と脊髄分節レベルL4で後角ニューロンの感染を示しています。
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Protocol
記載外科手術はコロンビア大学の施設内動物のケアと使用委員会（IACUC）によって承認されています。
1。機器およびウイルス粒子懸濁液の調製
- 装置を清掃し、消毒、手術器具と椎骨L1を固定するために使用されるVノッチスパイクを滅菌します。
- プルとベベルガラスピペット。我々は、40μmの先端径を持ち、20°の角度で傾斜がついていピペットを使用しています。ガラスピペットを滅菌する。
- 定位フレームを設定し、マニピュレータ上にマイクロシリンジインジェクタを取り付けるとコントローラにインジェクタを接続します。
- コンプレッションフィッティングキットを使用してマイクロシリンジにガラスピペットのいずれかを添付してください。
- マイクロシリンジからプランジャを取り外し、ミネラルオイルを注射器を埋める。オイルレッドO（1 - （2,5 - ジメチル-4 - （2,5 - dimethylphenylazo）フェニルアゾ）-2 - ナフトール）が、そのvを高めるために鉱物油に添加してもよいisibility。プランジャーを挿入し、先端に至るまで押し込みます。慎重に気泡を作成することは避けてください。
- バイオセーフティキャビネット内でウイルス粒子の懸濁液を準備します。氷の上で冷凍ウイルスを解凍し、使用直前に、滅菌した所望の粒子濃度にリン酸緩衝生理食塩水で希釈。
- インジェクタ上のホルダーにマイクロシリンジを挿入します。
- 小さ なプラスチック製のシート上にウイルス懸濁液のピペットを5μl、 例えばパラフィルム。ドロップにガラスピペットの先端を下げ、マイクロシリンジを埋めるためにプランジャーを引く。目詰まりを防ぐためのピペット先端に小さな気泡を作成します。
2。椎弓切除術
- ベンチや消毒剤で加熱パッドを拭くことによって手術領域を準備します。
- マウスを麻酔。我々は、（誘導中に3％、メンテナンス時の2〜3％）とイソフルラン吸入麻酔を使用します。
- 時の乾燥から目を保護するために、それぞれの目の上に置いて潤滑剤操作。
- 腰痛からのマウスの首にファーを剃ると、クロルヘキシジンまたはポビドンヨード、70％エタノールなどの局所消毒のワイプを交互に皮膚の消毒。外科用ドレープで無菌的に調製現場を隔離し、ブピバカイン（0.25％、生理食塩水で1:10に希釈）を用いて切開部位に浸潤する。
- 正中線に沿って肋骨の尾側（2-3 cm）で皮膚を切開し、背骨を覆う筋膜を分離します。
- 脊髄は脊柱より生後発育中に、以前の成長が止まるので、脊髄分節L4は第1腰椎（L1）の下に位置しています。椎骨L1はリブの最後のペアを保持している椎骨尾に位置しています。その背面に付いている小さな脊髄筋肉と靭帯を除去することによって椎骨L1を識別し、公開します。
- 少しアドソン鉗子と椎骨L1を持ち上げたままにします。背portioを削除するには、専用の椎弓切除鉗子を使用n個の椎骨（背骨やラミナ）と脊髄を露出するの。脊髄の損傷を防ぐ。
- 定位フレーム内の加熱プレート上にマウスを移す。その後の動作中にマウスの温度を監視します。
3。注射
- Vノッチスパイクで椎骨L1を固定してください。椎骨は、呼吸中に動かないようにスパイクが脊椎を安定させなければなりません。
- 近いので、ピペットの先端が椎弓切除部位を超えていることをマイクロシリンジを持参してください。あなたはピペットを出るウイルス懸濁液が表示されるまでプランジャーを押し下げます。滅菌綿棒で液滴を削除します。
- 露出した脊髄の吻側、最も部分にピペットチップを置きます。センター後正中溝上記ピペット、その後500μmで横方向に先端を移動。コードの表面にチップと穿刺硬膜を下げるか、あなたはunbeveledガラスピペットを使って作業しているときは、dは穿刺に面取りされたスチール製のカニューレを使用浦。脊髄にガラスピペット300μmの先端を下げます。
- 200 NL / minの速度でウイルス懸濁液の1μlを注入します。
- 注射の終了時に、ゆっくりと後退させるピペット前に少なくとも2分待ってください。
- 脊髄分節L4にウイルスベクターの完全な分配を達成するために露出した脊髄の尾最部でステップ3.3から3.5を繰り返します。 2注射部位は、対象地域の組織の損傷を回避するために吻側およびL4セグメントの尾側に位置しています。
4。創縫合
- Vノッチクランプから椎骨L1を離すと定位フレームからマウスを削除します。
- 5.0ビクリルと筋膜を縫合。閉鎖筋膜は椎弓切除部位のためのカバーを提供しています。
- ナイロン縫合糸または外科用ステープルで皮膚を閉じます。
5。術後処置
- 柔らかい、nonparticularな寝具を使用して回復ケージにマウスを移す。トンの上に置きます快適な呼吸のために彼がサイド。それは通院、完全に警戒され、飲酒を開始するまで、動物を監視します。
- 我々は、カルプロフェンの毎日の皮下注射（5.0 mg / kg）を使って72時間術後の鎮痛を提供します。
- 実験が完了するまで、最初の3日間毎日検査で術後の回復、隔日または週3日を監視します。
- 創傷治癒が完了したときに、7〜10日間運転後の皮膚の縫合糸またはステープルを外します。
- 実験終了後の動物を安楽死させる。
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Representative Results
反対側、腹角および後根神経節の背角を温存注入後角（ 図1）の神経細胞で成功したトランスフェクションの利回り堅牢な遺伝子発現を、。
図1。後角ニューロンのトランスフェクション。L4脊髄の左後角における蛍光レポーターEGFP（緑色）の（）式は、2週間のrAAV-EGFPの定位注入後（血清型AAV2 / 8、10 9ゲノムコピー/ μL）。ニューロンは神経核タンパク質（NeuN、赤）の免疫染色した。矢印は、脊柱に散在トランスフェクトされたグリア細胞にポイントを率いている。スケールバーは、150μmである（B）内側背角ニューロンの約80％が感染していた。スケールバーは20μm。 NeuN（EMDミリポア）に対するモノクローナル抗体は1:2,0の希釈で使用した免疫染色のために00。
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Discussion
定位ベクターの注入は、神経変性11の予防または治療のために傷害9,10、または遺伝子治療から再生中に6,7またはoptogenetic郭清8、軸索ガイダンスを広げる経シナプスウイルスに基づいて、このような神経ネットワークのマッピングなどのアプリケーションに脊髄ニューロンを標的にできます12。ウイルスベクターは、体性感覚、運動と自律神経経路9,10,13-15を研究するために脊髄に遺伝子操作のために使用されている。マウスが最も広く、脳や脊髄へのウイルスベクターの定位注入を含む研究に使用されるモデル生物であるが、技術はヒト以外の霊長類16を含む他の種で採用されてきた。
マウス脊髄に定位ベクターの注入は安全であり、動物はinstabiliせずに回復しているので、ここで説明する外科手術は、注射部位の単椎弓切除術を必要とするその背骨の動きのTY。注射やカニューレの遅い除去は10分以内に完了している、皮膚の準備及び創傷閉鎖を含む全体の手順には約40分持続します。我々は、カルプロフェン、非ステロイド性抗炎症鎮痛薬で72時間術後麻酔を提供します。
組織の外傷を最小限に抑えるために、我々は、40μmの先端径で引っ張らガラスカニューレを採用しています。シャープなベベルカニューレの先端がマイクロピペットグラインダーへの投資を正当化し、脊髄への挿入を容易にします。グラインダーの使用は、注入の結果のばらつきを低減し、各実験で一貫性のあるベベル角度を維持することができます。我々は、脊髄後角におけるウイルス粒子の懸濁液を均等に分配するための手動摂理17以上の射出速度の自動制御を好むと噴射エラーのリスクを軽減する。同様に重要injectiを完了した後、2〜5分間開始すべきカニューレの遅い取り出しであるバックアップウイルス懸濁液を描くとextraspinal流出の原因を避けるために。
脊髄内のトランスフェクションの程度と分布は、注入された粒子用量などの血清型および感染症の効能として、ウイルスベクターの固有の特性に依存します。最適な粒子希釈は各ウイルスと血清型について経験的に決定されなければならないし、同じウイルスの異なるバッチ間で異なる場合があります。感染とDNA伝達の両方の効能もニューロン18,19の目標人口に応じて異なる場合があります。 AAVは、病原と20最小限の免疫副作用なしで神経細胞における遺伝子導入を実現しています。我々の経験では、後角ニューロンの感染は1〜2週間以内に完了し、安定しています。我々は、注射部位にマイナーミクログリアの反応を観察しているが、これらは一週間以内に解決。
我々はこのようなevalのEGFPなどのレポーター遺伝子を発現ベクターの異なる血清型を比較してお勧めします、トランスフェクション率をuate注射と安定なトランスフェクション間の時間間隔を決定し、感染が神経細胞に限定されるかどうかを確立する。特異性がベクトルの場合、トランスフェクトされた遺伝子とそのプロモーターの細胞親和性に依存することになる。体性感覚経路を研究する研究者らはまた、後角において中心的な端末で、または脳脊髄液19の汚 染から、これらのニューロンの感染に起因するかもしれないレポーター遺伝子の潜在的な発現のために後根神経節ニューロンを調べる必要があります。
米国では、遺伝子操作のためのウイルスベクターの使用は、組換えDNA分子（含む研究のためのNIHのガイドラインによって規制されてhttp://oba.od.nih.gov/rdna/nih_guidelines_oba.htmlを ）。本ガイドラインは、治験責任医師の研修、個人用保護具、ウイルスベクターの封じ込め、decontaminatioための要件を規定nは、そのような使用済みの注射器およびカニューレ、注射後の動物の住宅として汚染された物質の廃棄。調べでは、自分の研究に適用される規則および規制を決定するために、制度的な監督の地元の動物実験委員会又は同等の身体でも動作するはずです。
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Disclosures
著者らは、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。
Acknowledgments
我々は、技術的な支援をBakhos A. Tannous、博士のrAAV-EGFPベクターを用いて私たちを提供するためのマサチューセッツ総合病院、チャールスタウン、マサチューセッツ州の神経科学センターのベクター開発·生産担当ディレクター、ジョン·むちで打つことに感謝します。この作品は、神経疾患や脳卒中の国立研究所からの助成金によってR01 NS050408を（JS）にサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Spinal base plate | David Kopf Instruments | 912 | |
| Small animal stereotaxic instrument | David Kopf Instruments | 900 | |
| Mouse gas anesthesia head holder | David Kopf Instruments | 923-B | |
| Adjustable base mounts | David Kopf Instruments | 982 | |
| V notch spikes | David Kopf Instruments | 987 | |
| Small animal temperature control system | David Kopf Instruments | TCAT-2LV | |
| Adson forceps | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Laminectomy forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | |
| UltraMicroPump (one) with SYS-Micro4 Controller | World Precision Instruments | UMP3-1 | |
| Microsyringe, 65RN | Hamilton | 7633-01 | |
| RN compression fitting, 1 mm | Hamilton | 55750-01 | |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Microgrinder | Narishige | EG-44 |
References
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