Summary
Vettori virali per consentire la manipolazione genica mirata. Abbiamo dimostrato un metodo per l'espressione genica condizionale o ablazione nel midollo spinale topo, utilizzando iniezione stereotassica di un vettore virale nel corno dorsale, un luogo di rilievo di contatto sinaptico tra afferenze somatosensoriali primarie e neuroni del sistema nervoso centrale.
Abstract
Iniezione intraparenchimale di un vettore virale consente la manipolazione condizionale gene in distinte popolazioni di neuroni o regioni specifiche del sistema nervoso centrale. Dimostriamo una tecnica stereotassica iniezione che permette l'espressione del gene bersaglio o silenziamento nel corno dorsale del midollo spinale del mouse. La procedura chirurgica è breve. Richiede laminectomia di una singola vertebra, che prevede il recupero rapido dell'animale e motilità perfetta della colonna vertebrale. Iniezione controllata di un piccolo volume di sospensione vettore a bassa velocità e l'uso di una cannula microsiringa con vetro smussato minimizzare la lesione tissutale. La risposta immunitaria locale al vettore dipende dalle proprietà intrinseche del virus impiegati, nella nostra esperienza, è minore e di breve durata, quando un ricombinante adeno-associated virus viene utilizzato. Un gene reporter come migliore proteina fluorescente verde facilita distribuzione spaziale monitoraggio del vettore, e l'efficacia e cellulare specificity della trasfezione.
Introduction
Le tecnologie avanzate di manipolazione genica condizionale nel topo consentono molteplici approcci per l'esplorazione di sinapsi e collegamenti funzionali del sistema nervoso centrale. Transgeni può essere regolata da piccole molecole come effettori doxiciclina agenti su un transattivatore della tetraciclina controllato, che può essere progettato per funzionare come un repressore o un attivatore della trascrizione genica, o tamoxifene riconoscere un mutato ligando dominio di legame del recettore di estrogeno 1 . Modifica irreversibile transgene è comunemente ottenuto da acido desossiribonucleico (DNA) ricombinasi. Cre (ricombinazione cause) e Flp (enzima ricombinazione flippase) catalizzare l', inversione escissione o la traslocazione di frammenti di DNA che vengono affiancati da loxP (luogo di x crossing over, P1) o Frt (target riconoscimento flippase) siti, rispettivamente, 1. Le applicazioni includono l'attivazione del gene o silenziamento inducibile e acido ribonucleico (RNA) ingerenza
4. Alta capacità (gutless) adenovirus, virus adeno-associati, virus dell'herpes simplex e lentivirus sono comunemente utilizzati vettori neurotropici. Selezione del virus appropriato per una domanda di ricerca è una parte cruciale del disegno sperimentale. Dimensione del transgene, percorso di consegna, specificità dell'infezione di neuroni a differenza di cellule gliali, efficacia infezione, effetti collaterali tossici infiammatori e devono essere considerati 4.
Qui descriviamo l'iniezione stereotassica di un vettore virale nel corno dorsale del midollo spinale, una tecnica che usiamo per la regolazione genica condizionale nella nostra ricerca sulla neurobiologia del dolore. Il corno dorsale riceve l'input afferente da primari neuroni somatosensoriali inclusi i neuroni nocicettivi. Interneuroni locali elaborare le informazioni prima di neuroni di proiezione che trasmettono dail corno dorsale al cervello 5. Dimostriamo l'infezione di neuroni del corno dorsale a livello segmentale spinale L4 con neurotropico ricombinante virus adeno-associato (rAAV) che esprime migliorato proteina fluorescente verde (EGFP) sotto un promotore di citomegalovirus costitutivamente attivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
La procedura chirurgica descritta è stato approvato dalla cura degli animali e del Comitato Istituzionale uso (IACUC) della Columbia University.
1. Preparazione delle apparecchiature e delle particelle sospensione di virus
- Pulire e disinfettare le attrezzature, sterilizzare gli strumenti chirurgici e le punte notch V che verranno utilizzati per fissare vertebra L1.
- Tirare e pipette di vetro conici. Usiamo pipette che hanno un diametro di punta di 40 micron e sono smussati con un angolo di 20 °. Sterilizzare le pipette di vetro.
- Impostare il telaio stereotassico, montare l'iniettore microsiringa sulla manipolatore e collegare l'iniettore al controllore.
- Collegare una delle pipette di vetro per la microsiringa utilizzando il kit di raccordo a compressione.
- Rimuovere lo stantuffo dalla microsiringa e riempire la siringa con olio minerale. Oil Red O (1 - (2,5-dimetil-4-(2,5-dimethylphenylazo) fenilazo)-2-naftolo) può essere aggiunto al olio minerale per aumentare la sua visibility. Reinserire lo stantuffo e spingerla per tutta la strada fino alla punta. Accuratamente evitare di creare una bolla d'aria.
- Preparare la sospensione di particelle di virus in un armadio biosicurezza. Scongelare il virus congelato su ghiaccio e, immediatamente prima dell'uso, diluire con sterile PBS alla concentrazione di particelle desiderato.
- Inserire la microsiringa nel supporto dell'iniettore.
- Pipettare 5 microlitri della sospensione di virus su un foglio di plastica, ad esempio Parafilm. Abbassare la punta della pipetta di vetro nella goccia e tirare lo stantuffo per riempire la microsiringa. Creare una piccola bolla d'aria sulla punta della pipetta per evitare che si intasi.
2. Laminectomia
- Preparare l'area di intervento pulendo panchina e piastra elettrica con disinfettante.
- Anestetizzare il mouse. Usiamo l'anestesia per inalazione con isoflurano (3% durante l'induzione, 2% -3% durante la manutenzione).
- Posizionare lubrificante su ciascun occhio per proteggere gli occhi dalla disidratazione durante l'funzionamento.
- Accorciare il pelo della schiena al collo del mouse e disinfettare la pelle con salviette alternata di un antisettico topico come clorexidina o polivinilpirrolidone-iodio e il 70% di etanolo. Isolare il sito in modo asettico preparato con telo chirurgico e infiltrarsi nel sito di incisione con bupivacaina (0,25%, diluito 1:10 con soluzione fisiologica).
- Incidere la pelle all'estremità caudale della gabbia toracica lungo la linea mediana (2-3 cm) e separare la fascia che copre la colonna vertebrale.
- Poiché il midollo spinale smette di crescere in precedenza durante lo sviluppo postnatale rispetto alla colonna vertebrale, segmento spinale L4 si trova sotto la prima vertebra lombare (L1). Vertebra L1 si trova caudalmente alla vertebra che contiene l'ultimo paio di costole. Ed esporre vertebra L1, eliminando i piccoli muscoli della colonna vertebrale e dei legamenti attaccati alla superficie dorsale.
- Sollevare leggermente e tenere premuto L1 vertebra con una pinza Adson. Utilizzare una pinza laminectomia dedicato per rimuovere la dorsale portion della vertebra (colonna vertebrale e lamina) ed esporre il midollo spinale. Evitare di danneggiare il midollo spinale.
- Trasferire il mouse sulla piastra riscaldante nel telaio stereotassico. Monitorare la temperatura del mouse durante la successiva operazione.
3. Iniezione
- Fissare vertebra L1 con punte tacca V. Le punte devono stabilizzare la colonna in modo che la vertebra non si sposta durante la respirazione.
- Portare il microsiringa più vicino in modo che la punta della pipetta è al di sopra del sito di laminectomia. Abbassare lo stantuffo fino a visualizzare la sospensione di virus in uscita la pipetta. Rimuovere la goccia con la punta di cotone sterile.
- Posizionare la punta della pipetta in più a parte rostrale del midollo spinale esposto. Centro la pipetta sopra il solco posteriore mediana, quindi spostare la punta 500 pm lateralmente. Abbassare la punta sulla superficie del cavo e la puntura della dura madre o, se si lavora con una pipetta di vetro unbeveled, utilizzare una cannula smussata in acciaio per forare il dura. Abbassare la punta della pipetta di vetro 300 micron nel midollo spinale.
- Iniettare 1 ml di sospensione di virus a una velocità di 200 nl / min.
- Al termine dell'iniezione, attendere almeno 2 minuti prima lentamente ritraendo la pipetta.
- Ripetere i passaggi 3,3-3,5 al-caudale più porzione del midollo spinale esposta per ottenere una distribuzione completa del vettore virale in L4 segmento spinale. I due siti di iniezione si trovano rostrale e caudale del segmento L4, per evitare danni ai tessuti nella regione di destinazione.
4. Chiusura della ferita
- Rilasciare vertebra L1 dalle fascette tacca le V e togliere il mouse dal telaio stereotassico.
- Suturare la fascia con 5,0 Vicryl. La fascia chiuso prevede la copertura per il sito laminectomia.
- Chiudere la pelle con punti di sutura in nylon o graffette chirurgiche.
5. Cura postoperatoria
- Trasferire il mouse a una gabbia di recupero con morbido, biancheria da letto nonparticular. Mettere sul tegli laterali per la respirazione confortevole. Monitorare l'animale fino a quando non è completamente vigile, ambulatoriale e inizia a bere.
- Forniamo analgesia post-chirurgica per 72 ore al giorno con iniezioni sottocutanee di carprofen (5,0 mg / kg).
- Monitorare il recupero post-chirurgico mediante ispezione giornaliera per i primi 3 giorni, poi a giorni alterni o 3 giorni a settimana fino a quando l'esperimento è completo.
- Rimuovere le suture cutanee o graffe 7 a 10 giorni dopo l'operazione, quando la guarigione della ferita è completa.
- Euthanize l'animale al termine dell'esperimento.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Rendimenti di trasfezione di successo l'espressione genica robusta nei neuroni del corno dorsale iniettato (Figura 1), risparmiando il corno dorsale del lato controlaterale, il corno ventrale e gangli delle radici dorsali.
Figura 1. La trasfezione di neuroni del corno dorsale. (A) Espressione della EGFP reporter fluorescente (verde) nel corno sinistro dorsale del midollo spinale L4, due settimane dopo l'iniezione stereotassica di rAAV-EGFP (sierotipo AAV2 / 8, 10/9 copie genoma microlitri). I neuroni sono stati immunostained di proteine nuclei neuronali (NeuN, rosso). Freccia teste scegliere sparse cellule trasfettate gliali nella colonna dorsale. Scala bar, 150 micron. (B) Circa l'80% dei neuroni del corno dorsale mediale sono stati infettati. Scala bar, 20 micron. Un anticorpo monoclonale contro NeuN (EMD Millipore) è stato utilizzato ad una diluizione di 1:2,000 per la immunocolorazione.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Iniezione stereotassica vettore permette il targeting neuroni del midollo spinale per applicazioni come la mappatura della rete neuronale basata sul virus transsynaptic diffondere 6,7 o dissezione optogenetic 8, la guida durante la rigenerazione assonale da lesioni 9,10, o la terapia genica per la prevenzione o il trattamento di neurodegenerazione 11, 12. Vettori virali sono stati utilizzati per la manipolazione del gene nel midollo spinale di studiare somatosensoriali, motori e autonomo percorsi 9,10,13-15. Il mouse è il organismo modello più utilizzato in studi condotti iniezione stereotassica di un vettore virale nel cervello o al midollo spinale, ma la tecnica è stata impiegata in altre specie compresi primati non umani 16.
Iniezione vettore stereotassico nel midollo spinale del mouse è sicuro, la procedura chirurgica qui descritta richiede una laminectomia unico nel sito di iniezione in modo che l'animale recupera senza instabilitàty nei suoi movimenti della colonna vertebrale. Iniezione e lenta rimozione della cannula si completa entro 10 minuti, l'intera procedura, compresa la preparazione della pelle e la chiusura della ferita dura circa 40 min. Forniamo anestesia post-chirurgica per 72 ore con il carprofen, un farmaco anti-infiammatori farmaco analgesico.
Per ridurre al minimo il trauma dei tessuti, ci avvaliamo di cannule di vetro tirato con un diametro di punta di 40 pm. Una forte punta smussata della cannula facilita l'inserimento nel midollo spinale, che giustifica l'investimento in una smerigliatrice micropipetta. Uso di una smerigliatrice consente inoltre di mantenere un angolo di smussatura consistente in ogni esperimento, riducendo variazione dei risultati di iniezione. Noi preferiamo controllo automatico della velocità di iniezione oltre 17 dispensazione manuale per una distribuzione uniforme della sospensione di particelle di virus nel corno dorsale e per ridurre il rischio di un errore di iniezione. Altrettanto critico è un'estrazione lenta della cannula, che dovrebbe essere iniziato 2-5 min dopo aver completato la Injectiper evitare di disegnare la sospensione di virus backup e provocando una fuoriuscita di extraspinal.
Entità e la distribuzione della trasfezione intraspinale dipenderà dalla dose iniettata particelle e le proprietà intrinseche del vettore virale come sierotipo ed efficacia infezione. La diluizione particella ottimale deve essere determinata empiricamente per ogni virus e sierotipo e può variare tra i lotti diversi del virus stesso. L'efficacia di entrambe le infezioni e la trasduzione del DNA può anche variare a seconda della popolazione destinataria di neuroni 18,19. AAV realizza il trasferimento genico in neuroni patogeni e senza effetti collaterali minimi immunitari 20. Nella nostra esperienza, l'infezione di neuroni del corno dorsale è completa nell'arco di 1-2 settimane e stabili. Abbiamo osservato minori risposte microgliali in siti di iniezione, ma questi risolti entro una settimana.
Si consiglia di confrontare diversi sierotipi di vettori che esprimono un gene reporter EGFP come a evallutare tassi di trasfezione, determinare gli intervalli di tempo tra l'iniezione e la trasfezione stabile e stabilire se l'infezione è limitata ai neuroni. Specificità dipenderà dal tropismo cellulare del vettore, il gene trasfettato e il suo promotore. Ricercatori che studiano percorsi somatosensoriali dovrebbe esaminare dorsali radice gangliari neuroni per un'espressione potenziale del gene reporter, che può derivare da infezioni di questi neuroni ai loro terminali centrali del corno dorsale, contaminazione del fluido cerebrospinale 19.
Negli Stati Uniti, l'uso di vettori virali per la manipolazione genica è regolata dagli orientamenti NIH per la ricerca che coinvolgono molecole di DNA ricombinante ( http://oba.od.nih.gov/rdna/nih_guidelines_oba.html ). Queste linee guida stabiliscono i requisiti per la formazione investigatore, protezione personale, il contenimento vettore virale, decontamination, lo smaltimento dei materiali contaminati, quali siringhe e cannule, e l'alloggio degli animali dopo l'iniezione. Gli investigatori dovrebbero lavorare con i loro IACUC locale o un organismo equivalente di vigilanza istituzionale per determinare le norme e regolamenti che si applicano alla loro ricerca.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere conflitto di interessi finanziari.
Acknowledgments
Ringraziamo Bakhos A. Tannous, Ph.D., Direttore dello Sviluppo e Produzione vettore nel Centro Neuroscienze del Massachusetts General Hospital, Charlestown, Massachusetts, per averci fornito il rAAV-EGFP vettore, e John Whang per l'assistenza tecnica. Questo lavoro è stato sostenuto dalla concessione R01 NS050408 (JS), presso l'Istituto nazionale dei disordini neurologici e colpo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Spinal base plate | David Kopf Instruments | 912 | |
| Small animal stereotaxic instrument | David Kopf Instruments | 900 | |
| Mouse gas anesthesia head holder | David Kopf Instruments | 923-B | |
| Adjustable base mounts | David Kopf Instruments | 982 | |
| V notch spikes | David Kopf Instruments | 987 | |
| Small animal temperature control system | David Kopf Instruments | TCAT-2LV | |
| Adson forceps | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Laminectomy forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | |
| UltraMicroPump (one) with SYS-Micro4 Controller | World Precision Instruments | UMP3-1 | |
| Microsyringe, 65RN | Hamilton | 7633-01 | |
| RN compression fitting, 1 mm | Hamilton | 55750-01 | |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Microgrinder | Narishige | EG-44 |
References
- Lewandoski, M. Conditional control of gene expression in the mouse. Nature Reviews Genetics. 2, 743-755 (2001).
- Couto, L. B., High, K. A. Viral vector-mediated RNA interference. Curr. Opin. Pharmacol. 10, 534-542 (2010).
- Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. Genetic dissection of neural circuits. Neuron. 57, 634-660 (2008).
- Davidson, B. L., Breakefield, X. O. Viral vectors for gene delivery to the nervous system. Nature Reviews Neuroscience. 4, 353-364 (2003).
- Todd, A. J. Neuronal circuitry for pain processing in the dorsal horn. Nature Reviews Neuroscience. 11, 823-836 (2010).
- Wall, N. R., Wickersham, I. R., Cetin, A., De La Parra, M., Callaway, E. M. Monosynaptic circuit tracing in vivo through Cre-dependent targeting and complementation of modified rabies virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 21848-21853 (2010).
- Lo, L., Anderson, D. J. A Cre-dependent, anterograde transsynaptic viral tracer for mapping output pathways of genetically marked neurons. Neuron. 72, 938-950 (2011).
- Zhao, S., et al. Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nature Methods. 8, 745-752 (2011).
- Tang, X. Q., Heron, P., Mashburn, C., Smith, G. M. Targeting sensory axon regeneration in adult spinal cord. J. Neurosci. 27, 6068-6078 (2007).
- Cameron, A. A., Smith, G. M., Randall, D. C., Brown, D. R., Rabchevsky, A. G. Genetic manipulation of intraspinal plasticity after spinal cord injury alters the severity of autonomic dysreflexia. J. Neurosci. 26, 2923-2932 (2006).
- Passini, M. A., et al. CNS-targeted gene therapy improves survival and motor function in a mouse model of spinal muscular atrophy. The Journal of Clinical Investigation. 120, 1253-1264 (2010).
- Lutz, C. M., et al. Postsymptomatic restoration of SMN rescues the disease phenotype in a mouse model of severe spinal muscular atrophy. The Journal of Clinical Investigation. 121, 3029-3041 (2011).
- Chen, S. L., et al. dsAAV type 2-mediated gene transfer of MORS196A-EGFP into spinal cord as a pain management paradigm. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 20096-20101 (2007).
- South, S. M., et al. A conditional deletion of the NR1 subunit of the NMDA receptor in adult spinal cord dorsal horn reduces NMDA currents and injury-induced pain. J. Neurosci. 23, 5031-5040 (2003).
- Tappe, A., et al. Synaptic scaffolding protein Homer1a protects against chronic inflammatory pain. Nat. Med. 12, 677-681 (2006).
- Colle, M. A., et al. Efficient intracerebral delivery of AAV5 vector encoding human ARSA in non-human primate. Human Molecular Genetics. 19, 147-158 (2010).
- Carbajal, K. S., Weinger, J. G., Whitman, L. M., Schaumburg, C. S., Lane, T. E. Surgical Transplantation of Mouse Neural Stem Cells into the Spinal Cords of Mice Infected with Neurotropic Mouse Hepatitis Virus. J. Vis. Exp. (53), e2834 (2011).
- Snyder, B. R., et al. Comparison of adeno-associated viral vector serotypes for spinal cord and motor neuron gene delivery. Hum. Gene Ther. 22, 1129-1135 (2011).
- Towne, C., Pertin, M., Beggah, A. T., Aebischer, P., Decosterd, I. Recombinant adeno-associated virus serotype 6 (rAAV2/6)-mediated gene transfer to nociceptive neurons through different routes of delivery. Mol. Pain. 5, 52 (2009).
- Kaplitt, M. G., et al. Long-term gene expression and phenotypic correction using adeno-associated virus vectors in the mammalian. 8, 148-154 (1994).
