Summary
Vetores virais permitem a manipulação de genes alvo. Nós demonstramos um método para a expressão de genes condicionais ou ablação da medula espinhal de rato, utilizando a injecção estereotáxica de um vector viral no corno dorsal, um local proeminente de contacto sináptico entre os aferentes primários e os neurónios de somatossensorial no sistema nervoso central.
Abstract
Intraparenquimatosa injecção de um vector viral permite a manipulação genética condicional em populações distintas de neurônios ou regiões específicas do sistema nervoso central. Nós demonstramos uma técnica de injecção estereotáxica que permite a expressão do gene alvo ou silenciamento no corno dorsal da medula espinal do rato. O procedimento cirúrgico é breve. Ele requer laminectomia de uma única vértebra, fornecendo para a recuperação rápida do animal e da motilidade perfeita da coluna vertebral. Injecção controlada de um pequeno volume vector suspensão a baixa velocidade e à utilização de uma micro-seringa com cânula de vidro biselado minimizar a lesão dos tecidos. A resposta imunitária local do vector depende das propriedades intrínsecas do vírus empregue, na nossa experiência, é menor e de curta duração quando um vírus adeno-associado recombinante é utilizado. Um gene repórter, tais como a proteína fluorescente verde melhorada facilita a distribuição espacial de controlo do vector, e a eficácia e celular specipecificidade da transfecção.
Introduction
As tecnologias avançadas de manipulação genética condicional no rato permitir abordagens multifacetadas para a exploração de vias sinápticas e ligações funcionais no sistema nervoso central. Os transgenes podem ser regulados por moléculas pequenas efectoras, tais como a doxiciclina que actuam sobre um transactivador controlado por tetraciclina, que pode ser concebido para funcionar como um repressor ou um activador da transcrição de genes, ou tamoxifeno reconhecendo um domínio mutado de ligação ao ligando do receptor de estrogénio 1 . Modificação irreversível transgene geralmente é conseguido por o ácido desoxirribonucléico (DNA) recombinases. Cre (recombinação causas) e FLP (flippase enzima de recombinação) catalisam a excisão, inversão ou translocação de fragmentos de DNA que são ladeadas por loxP (locus de cruzamento x mais, P1) ou Frt (flippase alvo de reconhecimento) sites, respectivamente 1. As aplicações incluem a ativação do gene ou silenciamento e ácido induzível ribonucléico (RNA) interferência
4. De elevada capacidade de adenovírus (gutless), vírus adeno-associados, vírus do herpes simplex e lentivírus são comumente utilizados vectores neurotrópicas. Selecionando o vírus apropriado para uma questão de pesquisa é uma parte crucial do projeto experimental. Tamanho do transgene, via de administração, a especificidade da infecção para os neurónios, em oposição às células da glia, a eficácia da infecção, os efeitos secundários inflamatórios e tóxicos precisam ser considerados 4.
Aqui descrevemos a injecção estereotáxica de um vector viral no corno dorsal da medula espinhal, uma técnica que empregam para a regulação do gene condicional na nossa pesquisa sobre a neurobiologia da dor. O corno dorsal recebe entrada aferente primário neurônios somatossensoriais incluindo neurónios nociceptivos. Interneurônios locais processar as informações antes de neurônios de projeção transmiti-lo a partir decorno dorsal para o cérebro 5. Nós demonstramos que a infecção de neurónios do corno dorsal da coluna vertebral ao nível segmental L4 com um neurotrópica de vírus adeno-associado recombinante (rAAV) que expressa a proteína verde fluorescente melhorada (EGFP) no âmbito de um promotor de citomegalovírus constitucionalmente activo.
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Protocol
O procedimento cirúrgico descrito foi aprovado pelo Animal Care Institucional e Comitê de Uso (IACUC) da Universidade de Columbia.
1. Preparação de Equipamentos e suspensão de partículas de vírus
- Limpar e desinfectar o equipamento, esterilizar os instrumentos cirúrgicos e os picos de entalhe em V que serão utilizados para fixar vértebra L1.
- Puxe e pipetas de vidro bisel. Usamos pipetas que têm um diâmetro da ponta de 40 um e são chanfrados num ângulo de 20 °. Esterilizar as pipetas de vidro.
- Configure o quadro estereotáxico, montar o injetor micro para o manipulador e conectar o injetor para o controlador.
- Prenda uma das pipetas de vidro para o micro usando o kit de conexão de compressão.
- Remover o êmbolo da microsseringa e encher a seringa com óleo mineral. Oil Red O (1 - (2,5-dimetil-4-(2,5-dimethylphenylazo) fenilazo)-2-naftol), podem ser adicionados ao óleo mineral para aumentar a sua visibility. Reinserir o êmbolo e empurre-o para todo o caminho até a ponta. Cuidadosamente evitar a criação de uma bolha de ar.
- Preparar a suspensão de partículas de vírus em um armário de biossegurança. Descongelar o virus congelada em gelo e, imediatamente antes da utilização, diluir com estéril salina tamponada com fosfato com a concentração de partículas desejado.
- Insira o micro para o suporte no injector.
- Pipetar 5 ul da suspensão de vírus para uma folha de plástico, por exemplo Parafilm. Diminuir a ponta da pipeta de vidro para o soltar e puxar o êmbolo para encher a microsseringa. Criar uma pequena bolha de ar na ponta da pipeta para evitar que o entupimento.
2. Laminectomia
- Prepare a área de cirurgia limpando banco e almofada de aquecimento com desinfetante.
- Anestesiar o mouse. Nós usamos anestesia inalatória com isoflurano (3% durante a indução, 2% a 3% durante a manutenção).
- Coloque lubrificante em cada olho, para proteger os olhos de secagem durante o períodooperação.
- Raspar a pele a partir da parte inferior das costas do pescoço do rato e desinfectar a pele com a alternância de toalhetes de um anti-séptico tópico tal como clorhexidina ou povidona-iodo e etanol a 70%. Isolar o local assepticamente preparada com tecido cirúrgico e infiltrar o local da incisão com bupivacaína (0,25%, 1:10 diluídas com solução salina fisiológica).
- Incisão na pele na extremidade caudal da caixa torácica ao longo da linha média (2-3 cm) e separar a fáscia que cobre a lombada.
- Porque a medula espinhal pára de crescer mais cedo durante o desenvolvimento pós-natal do que a coluna vertebral, o segmento vertebral L4 está por baixo da primeira vértebra lombar (L1). Vértebra L1 está localizado à vértebra caudal que mantém o último par de costelas. Identificar e expor vértebra L1, removendo os pequenos músculos e ligamentos da coluna vertebral presos a sua superfície dorsal.
- Ligeiramente levantar e segurar vértebra L1 com uma pinça de Adson. Use uma pinça laminectomia dedicados para remover o portio dorsaln da vértebra (coluna e lâmina) e expor a medula espinhal. Evitar danos na medula espinhal.
- Transferir o rato sobre a placa de aquecimento na armação estereotáxica. Monitorar a temperatura do mouse durante a operação subseqüente.
3. Injeção
- Fix vértebra L1 com picos de entalhe em V. Os picos devem estabilizar a coluna vertebral, de modo que a vértebra não se mover durante a respiração.
- Traga a micro mais perto de modo que a ponta da pipeta é acima do local da laminectomia. Abaixe o êmbolo até que a suspensão de vírus sair da pipeta. Remover a gota, com uma ponta de algodão estéril.
- Posicionar a ponta da pipeta na porção rostral do mais medula espinal exposta. Centro da pipeta acima do sulco posterior mediana, em seguida, passar a ponta 500 mm lateralmente. Diminuir a ponta para a superfície do cabo e punção da dura-máter ou, se estiver a trabalhar com uma pipeta de vidro unbeveled, utilizar uma cânula de aço biselado para perfurar o dura. Baixar a ponta da pipeta de vidro 300 um para a medula espinhal.
- Injectar 1 ul de suspensão de vírus, a uma taxa de 200 nl / min.
- No final da injecção, esperar, pelo menos, 2 minutos antes lentamente retraindo a pipeta.
- Repita os passos 3,3-3,5 na porção mais caudal da medula espinal exposta para obter uma distribuição completa do vector viral em L4 segmento da coluna vertebral. Os dois locais de injecção situam-se rostral e caudal do segmento de L4 para evitar danos no tecido na região-alvo.
4. O fechamento da ferida
- Lançamento vértebra L1 dos grampos de entalhe em V e remover o mouse do quadro estereotáxico.
- Suturar a fascia com 5,0 vicryl. A fáscia fechado oferece cobertura para o site laminectomia.
- Feche a pele com fio de náilon ou grampos cirúrgicos.
5. Cuidados no pós-operatório
- Transferir o mouse para uma gaiola de recuperação, com cama, macio não-particular. Coloque-o em tele laterais para respiração confortável. Monitorar o animal até que ele é totalmente alerta, ambulatório e começa a beber.
- Fornecemos analgesia pós-operatória, durante 72 h, com injecções subcutâneas diárias de carprofeno (5,0 mg / kg).
- Monitorar a recuperação pós-cirúrgica por inspeção diária para os primeiros 3 dias, depois a cada dois dias ou três dias por semana, até que a experiência é completa.
- Remover as suturas ou agrafos 7 a 10 dias após a operação, quando a cicatrização de feridas é completa.
- Eutanásia do animal após a conclusão da experiência.
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Representative Results
Sucesso rendimentos de transfecção expressão gênica robusto em neurônios do corno dorsal injetado (Figura 1), poupando o corno dorsal do lado contralateral, o corno anterior e gânglios da raiz dorsal.
Figura 1. Transfecção dos neurónios do corno dorsal. (A) Expressão do EGFP repórter fluorescente (verde) no corno dorsal esquerda da medula espinhal L4, duas semanas após a injecção estereotáxica de rAAV-EGFP (sorotipo AAV2 / 8, 10/9 cópias do genoma ul). Neurônios histoquímica para proteína núcleos neuronais (NeuN, vermelho). Seta lidera ponto para espalhadas transfectadas células gliais na coluna dorsal. Barra de escala, a 150 m. (B) Cerca de 80% dos neurônios no corno dorsal medial foram infectados. Barra de escala, 20 m. Um anticorpo monoclonal contra NeuN (EMD Millipore) foi usado numa diluição de 1:2,000 para a imunocoloração.
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Discussion
Injecção estereotáxica vector permite a segmentação neurónios da espinal medula de aplicações, tais como mapeamento de rede neuronal com base em vírus transsináptica espalhando 6,7 ou optogenética dissecção 8, durante a regeneração axonal de orientação a partir de 9,10 lesão, ou terapia de gene para a prevenção ou tratamento da neurodegeneração 11, 12. Os vectores virais têm sido utilizados para a manipulação de genes na medula espinhal de estudar vias motoras, autonômicas e somatossensorial 9,10,13-15. O rato é o organismo modelo mais amplamente utilizado em estudos que envolvem a injecção estereotáxica de um vector viral no cérebro ou da medula espinal, mas a técnica tem sido utilizada em outras espécies, incluindo primatas não-humanos 16.
Injecção estereotáxica vector para a medula espinal de rato é seguro, o procedimento cirúrgico descrito aqui requer uma laminectomia único no local de injecção, de modo que o animal se recuperar sem instability em seus movimentos da coluna vertebral. Injecção e remoção lenta da cânula são completa dentro de 10 min, todo o processo, incluindo a preparação da pele e fecho de ferida dura aproximadamente 40 minutos. Fornecemos anestesia durante 72 h pós-operatória com carprofeno, uma droga anti-inflamatória não esteroidal analgésico.
Para minimizar o trauma do tecido, que empregam cânulas de vidro puxados com um diâmetro de ponta de 40 um. A afiada ponta da cânula chanfrada facilita a inserção na medula espinhal, o que justifica o investimento em um moedor de micropipeta. O uso de um moinho também permite a manutenção de um ângulo de chanfro consistente em cada experiência, a redução da variação dos resultados de injecção. Nós preferimos controlo automático da velocidade de injecção de cerca de 17 dispensação manual para uma distribuição uniforme da suspensão de partículas de vírus no corno dorsal e para reduzir o risco de um erro de injecção. Igualmente crítico é uma extração lenta da cânula, o que deve ser iniciado 2-5 min após a conclusão da injectipara evitar o desenho da suspensão de vírus de volta e causando um vazamento de extraspinal.
Extensão e distribuição da transfecção intraspinal dependem da dose injectada de partícula e propriedades intrínsecas do vector viral, tais como sorotipo e eficácia da infecção. A diluição óptima de partícula tem de ser determinado empiricamente para cada vírus e serotipo e pode variar entre lotes diferentes do mesmo vírus. A eficácia de ambos infecção e transdução de ADN também podem ser diferentes dependendo da população de neurónios alvo 18,19. AAV realiza a transferência de genes nos neurônios sem patogénico e um mínimo de efeitos secundários imunológicos 20. Em nossa experiência, a infecção de neurônios do corno dorsal está completa dentro de 1-2 semanas e estáveis. Temos observado menores respostas microgliais em locais de injecção, mas estes resolvido no prazo de uma semana.
Recomendamos comparando diferentes serotipos de vectores que expressam um gene repórter tal como a EGFP evaluate taxas de transfecção, determinar os intervalos de tempo entre a injecção e a transfecção estável e determinar se a infecção é limitada aos neurónios. Especificidade dependerá do tropismo celular do vector, o gene transfectado e do seu promotor. Os investigadores que estudam vias somatossensoriais analisará também os neurónios do gânglio da raiz dorsal de um potencial de expressão do gene repórter, o que pode resultar de infecção destes neurónios nos seus terminais centrais no corno dorsal, ou a partir de contaminação do fluido cerebrospinal 19.
Nos Estados Unidos, a utilização de vectores virais para a manipulação de genes é regulada pelas orientações NIH para Pesquisa Envolvendo moléculas de DNA recombinante ( http://oba.od.nih.gov/rdna/nih_guidelines_oba.html ). Estas orientações estipulam os requisitos para a formação do pesquisador, proteção pessoal, contenção vetor viral, decontamination, descarte de materiais contaminados, como seringas e cânulas e alojamento dos animais após a injeção. Os investigadores devem trabalhar com seu IACUC local ou órgão equivalente de supervisão institucional para determinar as regras e regulamentos que se aplicam a suas pesquisas.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses conflitantes financeiros.
Acknowledgments
Agradecemos Bakhos A. Tannous, Ph.D., Diretor de Desenvolvimento de Vector e Produção no Centro de Neurociências de Massachusetts General Hospital, em Charlestown, Massachusetts, para fornecer-nos com o vetor rAAV-EGFP e João Whang para assistência técnica. Este trabalho foi financiado por subvenções R01 NS050408 (a JS) do Instituto Nacional de Distúrbios Neurológicos e Derrame.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Spinal base plate | David Kopf Instruments | 912 | |
| Small animal stereotaxic instrument | David Kopf Instruments | 900 | |
| Mouse gas anesthesia head holder | David Kopf Instruments | 923-B | |
| Adjustable base mounts | David Kopf Instruments | 982 | |
| V notch spikes | David Kopf Instruments | 987 | |
| Small animal temperature control system | David Kopf Instruments | TCAT-2LV | |
| Adson forceps | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Laminectomy forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | |
| UltraMicroPump (one) with SYS-Micro4 Controller | World Precision Instruments | UMP3-1 | |
| Microsyringe, 65RN | Hamilton | 7633-01 | |
| RN compression fitting, 1 mm | Hamilton | 55750-01 | |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Microgrinder | Narishige | EG-44 |
References
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