Summary
Virusvektorer på målrettet genmanipulation. Vi viser en fremgangsmåde til betinget genekspression eller ablation i muse rygmarv under anvendelse af stereotaktisk injektion af en viral vektor i den dorsale horn, en fremtrædende sted for synaptisk kontakt mellem primære somatosensoriske afferenter og neuroner i centralnervesystemet.
Abstract
Intraparenchymal injektion af en viral vektor muliggør betingede genmanipulation i forskellige populationer af neuroner eller særlige regioner i centralnervesystemet. Vi viser en stereotaktisk injektion teknik, der giver mulighed for målrettet genekspression eller inaktivering i det dorsale horn i muse rygmarven. Den kirurgiske procedure er kort. Det kræver laminectomy af en enkelt ryghvirvel, om hurtig genopretning af dyret og fejlfri motilitet af rygsøjlen. Styret indsprøjtning af et lille vektor suspension volumen ved lav hastighed og anvendelse af en mikrosprøjte med skrå glas kanyle minimere vævet læsion. Det lokale immunrespons til vektoren afhænger af de iboende egenskaber af det anvendte virus, i vores erfaring er det mindre og kortvarige, når en rekombinant adenoassocieret virus anvendes. Et reportergen, såsom forstærket grønt fluorescerende protein letter overvågning rumlige fordeling af vektoren og virkning og cellulære specificity af transfektion.
Introduction
Avancerede teknologier betinget genmanipulation i musen så mangesidede tilgange til udforskning af synaptiske veje og funktionelle forbindelser i centralnervesystemet. Transgener kan reguleres af små molekyler effektorer, såsom doxycyklin, der virker på et tetracyclin-reguleret transaktivator, som kan udformes til at fungere som en repressor eller aktivator af gentranskription eller tamoxifen erkender et muteret ligand-bindende domæne af østrogenreceptoren en . Irreversibel transgen modifikation er almindeligvis opnås ved deoxyribonukleinsyre (DNA) rekombinaser. Cre (årsager rekombination) og Flp (flippase rekombination enzym) katalysere excision, inversion eller translokation af DNA-fragmenter, der er flankeret af loxP (locus af krydsning x over, P1) eller Frt (flippase anerkendelse mål) sites, henholdsvis 1. Applikationerne omfatter genaktivering eller nedregulering og inducerbar ribonukleinsyre (RNA) interferens
4. Høj kapacitet (rygradsløse) adenovirus, adenoassocieret virus, herpes simplex virus og lentivirus er almindeligt anvendt neurotrofiske vektorer. Valg af passende virus til et forsknings-spørgsmål er en afgørende del af det eksperimentelle design. Størrelsen af transgenet, tilførselsvej, specificitet af infektionen til neuroner i modsætning til gliaceller, infektion effektivitet, inflammatoriske og toksiske bivirkninger skal overvejes 4.
Her beskrives stereotaktisk injektion af en viral vektor i det dorsale horn i rygmarven, en teknik, som vi anvender for betinget genregulering i vores forskning på den neurobiologiske smerte. Den dorsale horn modtager afferent input fra primære somatosensoriske neuroner, herunder nociceptive neuroner. Lokale interneuroner behandler oplysningerne før projektions neuroner overbringe det fradet dorsale horn til hjernen 5. Vi viser infektionen af baghornsneuroner på spinal segmental niveau L4 med en neurotropisk rekombinant adenoassocieret virus (rAAV), som udtrykker forbedret grønt fluorescerende protein (EGFP) under en grundlæggende aktiv cytomegaloviruspromotor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Den kirurgiske beskrevne procedure er godkendt af Institutional Animal Care og Use Committee (IACUC) fra Columbia University.
1. Fremstilling af udstyr og virus partikelsuspension
- Rengøre og desinficere udstyret, sterilisere kirurgiske instrumenter og V-notch spikes der vil blive anvendt til at fastsætte ryghvirvel L1.
- Træk og smig glaspipetter. Vi anvender pipetter, der har en spids diameter på 40 um og er affaset i en vinkel på 20 °. Sterilisere glaspipetter.
- Opsæt stereotaktisk ramme, montere mikrosproejten injektor på manipulator og tilslut injektoren til controlleren.
- Fastgør en af de glaspipetter til mikrosproejten hjælp af kompression monteringssæt.
- Fjern stemplet fra mikrosprøjte og fylde sprøjten med mineralsk olie. Oil Red O (1 - (2,5-dimethyl-4-(2,5-dimethylphenylazo) phenylazo)-2-naphthol) kan sættes til mineralolien at øge sin modisibility. Indsætte stemplet og skubbes hele vejen til spidsen. Omhyggeligt undgå at skabe en luftboble.
- Forberede viruspartikel suspension i en biosikkerhed kabinet. Optø den frosne virus på is og, lige før brug, fortyndes med sterilt phosphatbufret saltvand til den ønskede partikel koncentrationen.
- Sæt mikrosprøjte i holderen på injektoren.
- Afpipetteres 5 ul af virussuspensionen på en lille plastplade, f.eks Parafilm. Sænk glaspipette spids ind i drop og træk stemplet for at fylde mikrosprøjten. Lav en lille luftboble på pipettespidsen for at forhindre det i at blive tilstoppet.
2. Laminektomi
- Forbered kirurgi området ved at tørre bænk og varmepude med desinfektionsmiddel.
- Bedøve mus. Vi bruger inhalation anæstesi med isofluran (3% under induktion, 2% -3% under vedligeholdelse).
- Anbring smøremiddel på hvert øje for at beskytte øjnene mod udtørring underoperation.
- Barbere pelsen fra den nederste del af ryggen til halsen af muse og desinficere huden med alternerende klude af et topisk antiseptisk middel, såsom chlorhexidin eller povidon-iod og 70% ethanol. Isoler aseptisk klargjorte sted med kirurgisk afdækningsstykke og infiltrere incisionssted med bupivacain (0,25%, fortyndet 1:10 med fysiologisk saltvand).
- Incise huden på den kaudale ende af brystkassen langs midterlinjen (2-3 cm) og adskil fascia dækker rygraden.
- Fordi rygmarven stopper voksende tidligere under postnatal udvikling end rygsøjlen, spinal segment L4 ligger nedenunder den første lændehvirvel (L1). Ryghvirvel L1 er placeret caudalt til hvirvlen, der holder det sidste par ribber. Identificere og eksponere hvirvel L1 ved at fjerne de små spinal muskler og ledbånd, der er knyttet til dens dorsale overflade.
- Lidt løfte og hold hvirvel L1 med en Adson pincet. Bruge en dedikeret laminektomi pincet til at fjerne den dorsale portion af hvirvlerne (rygsøjlen og lamina), og blotlægge rygmarven. Undgå at beskadige rygmarven.
- Overfør musen på varmepladen i stereotaktisk ramme. Overvåge temperaturen af mus under den efterfølgende drift.
3. Injektion
- Fix ryghvirvel L1 med V hak pigge. Piggene skal stabilisere rygsøjlen, således at hvirvlen bevæger sig ikke under vejrtrækning.
- Bringe mikrosproejten tættere, således at pipettespidsen er over laminektomistedet. Sænk stemplet indtil du ser virussuspension forlader pipetten. Fjerne dråben med en steril vatpind.
- Placere pipettespidsen på den rostrale-mest del af den blotlagte rygmarven. Centrer pipetten over de bageste median sulcus, derefter flytte spidsen 500 um sideværts. Sænk spidsen til overfladen af ledningen og punktere dura mater eller, hvis du arbejder med en unbeveled glaspipette, skal du bruge en skrå stål kanyle til at punktere dura. Sænk spidsen af glaspipette 300 um ind i rygmarven.
- Der indsprøjtes 1 pi virussuspension med en hastighed på 200 nl / min.
- Ved slutningen af injektionen, vente mindst 2 min før langsomt tilbagetrækning af pipetten.
- Gentag trin fra 3,3 til 3,5 ved den caudale-mest del af den blotlagte rygmarven at opnå fuldstændig fordeling af den virale vektor i spinale segment L4. De to injektionssteder er placeret rostralt og caudalt til L4 segment for at undgå vævsbeskadigelse i målområdet.
4. Sårlukning
- Frigivelse ryghvirvel L1 fra V-notch klemmer og fjerne musen fra stereotaktisk ramme.
- Sy fascia med 5,0 Vicryl. Den lukkede fascia giver dækning for laminektomistedet.
- Lukke huden med nylonsuturer eller kirurgiske hæfteklammer.
5. Postoperativ pleje
- Overfør musen til et opsving bur med blød, nonparticular sengetøj. Anbring den på than side for komfortabel vejrtrækning. Overvåg dyret, indtil det er helt vågen, ambulant og begynder at drikke.
- Vi giver postsurgical analgesi i 72 timer med daglige subkutane injektioner af carprofen (5,0 mg / kg).
- Overvåg postsurgical inddrivelse ved daglig inspektion for de første 3 dage, derefter hver anden dag eller 3 dage om ugen, indtil forsøget er afsluttet.
- Fjerne huden suturer eller hæfteklammer 7 til 10 dage efter operationen, når sårheling er fuldført.
- Aflive dyret efter afslutning af forsøget.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vellykket transfektion giver robust genekspression i neuroner i det injicerede dorsale horn (fig. 1), besparende det dorsale horn i den kontralaterale side, den ventrale horn og den dorsale rodganglier.
Figur 1. Transfektion af baghornsneuroner. (A) Ekspression af det fluorescerende reporter EGFP (grøn) i den venstre dorsale horn i L4 rygmarven, to uger efter stereotaktisk injektion af rAAV-EGFP (serotype AAV2 / 8, 10 9 genom kopier / ul). Neuroner blev immunfarvet for neuronal kerner protein (Neun, rød). Pilespidser peger på spredt transficerede glialceller i den dorsale kolonne. Scale bar, 150 um. (B) Ca. 80% af neuroner i den mediale dorsale horn blev inficeret. Scale bar, 20 um. Et monoklonalt antistof mod Neun (EMD Millipore) blev anvendt i en fortynding på 1:2,000 for immunfarvning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Stereotaktisk vektor injektion tillader målretning rygmarvsneuroner til applikationer såsom neurale netværk kortlægning baseret på transsynaptisk virusset spredes 6,7 eller optogenetic dissektion 8, axon vejledning under regenerering fra skade 9,10 eller genterapi til forebyggelse eller behandling af neurodegeneration 11, 12. Virale vektorer er blevet anvendt til genmanipulation i rygmarven for at undersøge somatosensoriske, motoriske og autonom veje 9,10,13-15. Musen er modelorganismen mest anvendte i undersøgelser med stereotaktisk injektion af en viral vektor ind i hjernen eller rygmarven, men teknikken har været beskæftiget i andre arter, herunder ikke-humane primater 16.
Stereotaktisk vektor injektion i mus rygmarven er sikkert den kirurgiske procedure er beskrevet her, kræver en enkelt laminektomi ved injektionsstedet, således at dyret kommer sig uden instability i dens ryg bevægelser. Injektion og langsom fjernelse af kanylen er afsluttet i løbet af 10 minutter, hele proceduren herunder hud forberedelse og sårlukning varer omkring 40 min. Vi giver postsurgical anæstesi i 72 timer med carprofen, et non-steroidt antiinflammatorisk analgetisk lægemiddel.
For at minimere vævstraumer beskæftiger vi trukket glas kanyler med en spids diameter på 40 um. En skarp skrå kanylespids letter indføring i rygmarven, begrunder investeringen i en mikropipette kværn. Anvendelse af en mølle også muligt at opretholde en konsistent skråvinkel i hvert forsøg, reducerer variation af injektionspræparater resultater. Vi foretrækker automatisk styring af injektionen hastighed over manuel dispensation 17 for en jævn fordeling af viruspartiklen suspension i det dorsale horn og at reducere risikoen for en injektion fejl. Lige så kritisk er en langsom ekstraktion af kanylen, der bør initieres 2-5 min efter endt injectipå at undgå at trække virussuspension tilbage op og forårsager en extraspinal spild.
Omfanget og fordelingen af intraspinal transfektion afhænger af den injicerede partikler dosis og iboende egenskaber af den virale vektor, såsom serotype og infektion effektivitet. Den optimale partikelstørrelse fortynding skal bestemmes empirisk for hver virus og serotype og kan variere mellem forskellige batches af den samme virus. Effekten af både infektion og DNA transduktion kan også variere afhængigt af den målrettede population af neuroner 18,19. AAV opnår genoverførsel i neuroner uden patogene og minimale immun bivirkninger 20. Det er vores erfaring, er infektionen af baghornsneuroner komplet inden for 1-2 uger og stabile. Vi har observeret mindre mikrogliaceller reaktioner ved injektionsstedet, men disse løst inden for en uge.
Vi anbefaler sammenligne forskellige serotyper af vektorer, der udtrykker et reportergen, såsom EGFP til evaluate transfektionseffektiviteter satser, bestemme tidsintervaller mellem injektion og stabil transfektion og fastslå, om infektionen er begrænset til neuroner. Specificitet vil afhænge af celle tropisme af vektoren, det transficerede gen og dets promotor. Undersøgere studerer somatosensoriske tilgange bør også undersøges dorsale rodganglie-neuroner for en potentiel ekspression af reportergenet, hvilket kan skyldes infektion af disse neuroner ved deres centrale terminaler i det dorsale horn eller fra kontaminering af cerebrospinalvæsken 19.
I USA er anvendelsen af virale vektorer til genmanipulation reguleret af NIH retningslinjer for forskning med rekombinante DNA-molekyler ( http://oba.od.nih.gov/rdna/nih_guidelines_oba.html ). Disse retningslinjer fastsætter krav til investigator uddannelse, personlig beskyttelse, virusvektor inddæmning, decontamination, bortskaffelse af forurenede materialer såsom brugte sprøjter og kanyler og dyrestalde efter injektionen. Efterforskere bør arbejde med deres lokale IACUC eller tilsvarende organ i den institutionelle tilsyn for at fastlægge de regler og bestemmelser, der gælder for deres forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Vi takker Bakhos A. Tannous, Ph.D., direktør for Vector Udvikling og Produktion i Neuroscience Center i Massachusetts General Hospital, Charlestown, Massachusetts, for at give os med rAAV-EGFP vektor, og John Whang for teknisk assistance. Dette arbejde blev støttet af tilskud R01 NS050408 (til JS) fra National Institute of Neurologiske Lidelser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Spinal base plate | David Kopf Instruments | 912 | |
| Small animal stereotaxic instrument | David Kopf Instruments | 900 | |
| Mouse gas anesthesia head holder | David Kopf Instruments | 923-B | |
| Adjustable base mounts | David Kopf Instruments | 982 | |
| V notch spikes | David Kopf Instruments | 987 | |
| Small animal temperature control system | David Kopf Instruments | TCAT-2LV | |
| Adson forceps | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Laminectomy forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | |
| UltraMicroPump (one) with SYS-Micro4 Controller | World Precision Instruments | UMP3-1 | |
| Microsyringe, 65RN | Hamilton | 7633-01 | |
| RN compression fitting, 1 mm | Hamilton | 55750-01 | |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Microgrinder | Narishige | EG-44 |
References
- Lewandoski, M. Conditional control of gene expression in the mouse. Nature Reviews Genetics. 2, 743-755 (2001).
- Couto, L. B., High, K. A. Viral vector-mediated RNA interference. Curr. Opin. Pharmacol. 10, 534-542 (2010).
- Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. Genetic dissection of neural circuits. Neuron. 57, 634-660 (2008).
- Davidson, B. L., Breakefield, X. O. Viral vectors for gene delivery to the nervous system. Nature Reviews Neuroscience. 4, 353-364 (2003).
- Todd, A. J. Neuronal circuitry for pain processing in the dorsal horn. Nature Reviews Neuroscience. 11, 823-836 (2010).
- Wall, N. R., Wickersham, I. R., Cetin, A., De La Parra, M., Callaway, E. M. Monosynaptic circuit tracing in vivo through Cre-dependent targeting and complementation of modified rabies virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 21848-21853 (2010).
- Lo, L., Anderson, D. J. A Cre-dependent, anterograde transsynaptic viral tracer for mapping output pathways of genetically marked neurons. Neuron. 72, 938-950 (2011).
- Zhao, S., et al. Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nature Methods. 8, 745-752 (2011).
- Tang, X. Q., Heron, P., Mashburn, C., Smith, G. M. Targeting sensory axon regeneration in adult spinal cord. J. Neurosci. 27, 6068-6078 (2007).
- Cameron, A. A., Smith, G. M., Randall, D. C., Brown, D. R., Rabchevsky, A. G. Genetic manipulation of intraspinal plasticity after spinal cord injury alters the severity of autonomic dysreflexia. J. Neurosci. 26, 2923-2932 (2006).
- Passini, M. A., et al. CNS-targeted gene therapy improves survival and motor function in a mouse model of spinal muscular atrophy. The Journal of Clinical Investigation. 120, 1253-1264 (2010).
- Lutz, C. M., et al. Postsymptomatic restoration of SMN rescues the disease phenotype in a mouse model of severe spinal muscular atrophy. The Journal of Clinical Investigation. 121, 3029-3041 (2011).
- Chen, S. L., et al. dsAAV type 2-mediated gene transfer of MORS196A-EGFP into spinal cord as a pain management paradigm. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 20096-20101 (2007).
- South, S. M., et al. A conditional deletion of the NR1 subunit of the NMDA receptor in adult spinal cord dorsal horn reduces NMDA currents and injury-induced pain. J. Neurosci. 23, 5031-5040 (2003).
- Tappe, A., et al. Synaptic scaffolding protein Homer1a protects against chronic inflammatory pain. Nat. Med. 12, 677-681 (2006).
- Colle, M. A., et al. Efficient intracerebral delivery of AAV5 vector encoding human ARSA in non-human primate. Human Molecular Genetics. 19, 147-158 (2010).
- Carbajal, K. S., Weinger, J. G., Whitman, L. M., Schaumburg, C. S., Lane, T. E. Surgical Transplantation of Mouse Neural Stem Cells into the Spinal Cords of Mice Infected with Neurotropic Mouse Hepatitis Virus. J. Vis. Exp. (53), e2834 (2011).
- Snyder, B. R., et al. Comparison of adeno-associated viral vector serotypes for spinal cord and motor neuron gene delivery. Hum. Gene Ther. 22, 1129-1135 (2011).
- Towne, C., Pertin, M., Beggah, A. T., Aebischer, P., Decosterd, I. Recombinant adeno-associated virus serotype 6 (rAAV2/6)-mediated gene transfer to nociceptive neurons through different routes of delivery. Mol. Pain. 5, 52 (2009).
- Kaplitt, M. G., et al. Long-term gene expression and phenotypic correction using adeno-associated virus vectors in the mammalian. 8, 148-154 (1994).
