Summary
Virale vectoren kunnen gerichte genetische manipulatie. We tonen een werkwijze voor voorwaardelijke genexpressie of ablatie in de muis ruggenmerg, met stereotactische injectie van een virale vector in de dorsale hoorn, een prominente plaats van synaptische contacten tussen primaire somatosensorische afferenten en neuronen van het centrale zenuwstelsel.
Abstract
Intraparenchymale injectie van een virale vector kan afhankelijk genmanipulatie in verschillende populaties van neuronen of bepaalde delen van het centrale zenuwstelsel. We tonen een stereotactische injectie techniek gerichte genexpressie of silencing in de dorsale hoorn van het ruggenmerg kan muis. De chirurgische procedure is kort. Het vereist laminectomie van een enkele wervel, die voorziet in een snel herstel van het dier en ongeschonden beweeglijkheid van de wervelkolom. Gecontroleerde injectie van een kleine vector schorsing volume bij lage snelheid en het gebruik van een micro-met afgeschuinde glazen canule minimaliseren het weefsel laesie. De lokale immuunrespons op de vector hangt af van de intrinsieke eigenschappen van de gebruikte virus, in onze ervaring is klein en kort als een recombinant adeno-geassocieerd virus wordt gebruikt. Een reportergen zoals versterkt groen fluorescent eiwit vergemakkelijkt controle ruimtelijke verdeling van de vector en de werkzaamheid en cellulaire specificity van de transfectie.
Introduction
Geavanceerde technologieën voor voorwaardelijke genmanipulatie in de muis kan veelzijdige benaderingen van de exploratie van synaptische paden en functionele verbindingen in het centrale zenuwstelsel. Transgenen kan worden geregeld door kleine molecule effectoren zoals doxycycline die op een door tetracycline gecontroleerde transactivator, die kunnen worden ontworpen om als een repressor of activator van gentranscriptie, tamoxifen of herkennen van een gemuteerd ligand-bindend domein van de oestrogeen receptor 1 . Onomkeerbare transgene modificatie wordt meestal bereikt door desoxyribonucleïnezuur (DNA) recombinases. Cre (oorzaken recombinatie) en Flp (flippase recombinatie enzym) katalyseren de excisie, inversie of translocatie van DNA-fragmenten die worden geflankeerd door loxP (locus of kruising x over, P1) of Frt (flippase erkenning doel) sites, respectievelijk 1. Toepassingen omvatten genactivering of silencing en induceerbare ribonucleïnezuur (RNA) interferentie
4. Hoge capaciteit (laf) adenovirus, adeno-geassocieerd virus, herpes simplex virus en lentivirus worden gebruikt neurotrope vectoren. Het selecteren van de juiste virus voor een onderzoeks-vraag is een cruciaal onderdeel van de experimentele opzet. Grootte van het transgen levering route, specificiteit van de infectie neuronen in tegenstelling tot gliacellen, infectie efficiëntie, ontstekings-en toxische bijwerkingen moeten worden overwogen 4.
Hier beschrijven we de stereotaxische injectie van een virale vector in de dorsale hoorn van het ruggenmerg, een techniek die we gebruiken voor voorwaardelijke genregulatie in ons onderzoek naar de neurobiologie van pijn. De dorsale hoorn ontvangt afferente input van primaire somatosensorische neuronen inclusief nociceptieve neuronen. Lokale interneuronen verwerken de informatie voordat projectie neuronen het overbrengen vande dorsale hoorn naar de hersenen 5. We demonstreren de infectie van dorsale hoorn neuronen spinale segmentale niveau L4 met een neurotrope recombinant adeno-geassocieerd virus (rAAV) die versterkt groen fluorescent eiwit (EGFP) tot expressie brengt onder een constitutief actieve promoter cytomegalovirus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De beschreven chirurgische procedure is goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) van Columbia University.
1. Voorbereiding van apparatuur en Virus deeltjessuspensie
- Reinig en desinfecteer de apparatuur, steriliseren van de chirurgische instrumenten en de V notch spikes die zullen worden gebruikt om de wervel L1 op te lossen.
- Trek en schuine glazen pipetten. Wij gebruiken pipetten die een tip diameter van 40 urn en afgeschuind onder een hoek van 20 °. Steriliseer de glazen pipetten.
- Stel de stereotactische frame, monteer de micro-injector op de manipulator en sluit de injector naar de controller.
- Bevestig een van de glazen pipetten om de micro met behulp van de compressie montageset.
- Verwijder de zuiger uit de micro en vul de spuit met minerale olie. Oil Red O (1 - (2,5-dimethyl-4-(2,5-dimethylphenylazo) fenylazo)-2-naftol) worden toegevoegd aan de minerale olie de v verhogenisibility. Plaats de zuiger en duw het helemaal naar de top. Zorg ervoor, het creëren van een luchtbel.
- Bereid het virusdeeltje suspensie in een bioveiligheid kast. Ontdooi de bevroren virus op ijs en vlak voor gebruik te verdunnen met steriele fosfaat gebufferde zoutoplossing om de gewenste deeltjesconcentratie.
- Plaats de micro in de houder op de injector.
- Pipetteer 5 ul van de virus suspensie op een plastic plaat, bijv. Parafilm. Laat de glazen pipet tip in de drop en trek de zuiger naar de micro te vullen. Maak een kleine luchtbel in de pipetpunt om te voorkomen dat verstopping.
2. Laminectomie
- Bereid de operatie gebied schoon door bank en verwarming pad met een desinfecterend middel.
- Verdoof de muis. We maken gebruik van inhalatie-anesthesie met isofluraan (3% tijdens de inductie, 2% -3% tijdens onderhoudswerkzaamheden).
- Plaats glijmiddel op elk oog om de ogen te beschermen tegen uitdrogen tijdens dewerking.
- Scheren de vacht van de lagere naar de hals van de muis en ontsmet de huid met afwisselende doekjes van een topisch antisepticum zoals chloorhexidine of povidon-jood en 70% ethanol. Isoleer de aseptisch bereide site met chirurgische doek en infiltreren de incisie site met bupivacaïne (0,25%, 1:10 verdund met een fysiologische zoutoplossing).
- Insnijden van de huid aan het caudale einde van de ribbenkast langs de middellijn (2-3 cm) en scheid de fascia die de wervelkolom.
- Omdat het ruggenmerg stopt met groeien eerder tijdens de postnatale ontwikkeling dan wervelkolom, spinale segment L4 ligt onder de eerste lendenwervel (L1). Wervel L1 ligt caudaal van de wervel dat de laatste paar ribben heeft. Identificeer en bloot wervel L1 door het verwijderen van de kleine spinale spieren en ligamenten gehecht aan zijn dorsale oppervlak.
- Iets optillen en wervel L1 vast te houden met een Adson tang. Gebruik een speciale laminectomie een tang om de dorsale portio verwijderenn van de wervel (wervelkolom en lamina) en bloot het ruggenmerg. Voorkom beschadiging van het ruggenmerg.
- Breng de muis op de verwarmingsplaat in de stereotactische frame. De temperatuur van de muis tijdens de volgende bewerking.
3. Injectie
- Fix wervel L1 met V inkeping spikes. De spikes moeten stabiliseren de wervelkolom, zodat de wervels niet beweegt tijdens de ademhaling.
- Breng de micro-dichter, zodat de pipet tip is boven de laminectomie site. Laat de zuiger totdat u de virussuspensie het verlaten van de pipet. Verwijder de druppel met een steriele wattenstaafje.
- Plaats de pipetpunt in de rostrale meest deel van de blootgestelde ruggenmerg. Centreer de pipet boven de achterste mediaan sulcus, verplaats dan de tip 500 um lateraal. Laat de tip naar het oppervlak van het snoer en prik de dura mater, of, als u werkt met een unbeveled glazen pipet, een afgeschuinde stalen canule gebruiken om het doorprikken van de dura. Laat de uiteinde van de glazen pipet 300 pm in het ruggenmerg.
- Injecteer 1 pl virussuspensie met een snelheid van 200 nl / min.
- Aan het einde van de injectie, wacht tenminste 2 min voordat langzaam terugtrekken van de pipet.
- Herhaal stap 3,3 tot 3,5 bij de caudale grootste deel van de blootgestelde ruggenmerg volledige verdeling van de virale vector in spinale segment L4 bereiken. De twee injectieplaatsen liggen rostrale en caudale van het segment L4 tot weefselschade in het doelgebied voorkomen.
4. Wondsluiting
- Op de markt wervel L1 van de V notch klemmen en verwijder de muis van de stereotactische frame.
- Hecht het fascia met 5,0 Vicryl. De gesloten fascia biedt dekking voor de laminectomie site.
- Sluit de huid met nylon hechtingen of chirurgische nietjes.
5. Postoperatieve zorg
- Breng de muis om een herstel kooi met zachte, nonparticular beddengoed. Plaats het op thij kant voor comfortabele ademhaling. Bewaak het dier totdat het volledig alert, ambulante en begint te drinken.
- Wij postoperatieve analgesie gedurende 72 uur met dagelijkse subcutane injecties van carprofen (5,0 mg / kg).
- Monitor postoperatieve herstel door dagelijkse inspectie voor de eerste 3 dagen, daarna om de dag of 3 dagen per week tot het experiment is voltooid.
- Verwijder de huid hechtingen of nieten 7 tot 10 dagen na de operatie, bij wondgenezing is voltooid.
- Euthanaseren het dier na afloop van het experiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Succesvolle transfectie levert robuuste genexpressie in neuronen van de geïnjecteerde dorsale hoorn (Figuur 1), sparen de dorsale hoorn van de contralaterale zijde, de ventrale hoorn en de dorsale wortel ganglia.
Figuur 1. Transfectie van dorsale hoorn neuronen. (A) Expressie van het fluorescerende reporter EGFP (groen) in de linker dorsale hoorn van het ruggenmerg L4, twee weken na stereotactische injectie van de rAAV-EGFP (serotype AAV2 / 8, 10 9 genoom kopieën / pi). Neuronen werden immunologisch voor neuronale kernen eiwit (Neun, rood). Pijlpunten wijzen op verstrooid getransfecteerde gliale cellen in de dorsale kolom. Schaal bar, 150 um. (B) ongeveer 80% van neuronen in de dorsale hoorn mediale geïnfecteerd. Schaal bar, 20 urn. Een monoklonaal antilichaam tegen neun (EMD Millipore) werd gebruikt bij een verdunning van 1:2,000 voor de immunokleuring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Stereotactische injectie vector kan gericht ruggenmerg neuronen voor toepassingen zoals neuronale netwerk mapping op basis transsynaptic virusverspreiding 6,7 of optogenetic dissectie 8, axon begeleiding tijdens regeneratie van letsel 9,10 of gentherapie voor de preventie of behandeling van neurodegeneratie 11, 12. Virale vectoren zijn gebruikt voor genetische manipulatie in het ruggenmerg te bestuderen somatosensorische, motorische en autonome wegen 9,10,13-15. De muis is een modelorganisme meest gebruikte in studies met stereotactische injectie van een virale vector in de hersenen of het ruggenmerg, maar de techniek is toegepast in andere soorten, inclusief niet-menselijke primaten 16.
Stereotactische injectie in de vector muis ruggenmerg veilig, de chirurgische procedure beschreven is een laminectomie op de injectieplaats zodat het dier herstelt zonder instability in zijn rug bewegingen. Injectie en langzame verwijdering van de canule volledig zijn binnen 10 minuten, de hele procedure inclusief voorbereiding van de huid en van wonden duurt ongeveer 40 minuten. Wij bieden postoperatieve anesthesie gedurende 72 uur met carprofen, een niet-steroïde anti-inflammatoire pijnstiller.
Om weefseltrauma te minimaliseren, gebruiken we getrokken glazen buisjes, met een tip diameter van 40 micrometer. Een scherpe schuine canule tip vergemakkelijkt het inbrengen in het ruggenmerg, rechtvaardigen de investering in een micropipet molen. Gebruik van een molen laat ook een consistent schuine hoek in elk experiment, waardoor variatie van de injectie resultaten. We voorkeur automatisch besturen van de injectiesnelheid boven handmatige dispensatie 17 voor een gelijkmatige verdeling van het virus deeltjessuspensie in de dorsale hoorn en het risico van een injectie fouten te verminderen. Even belangrijk is een langzame extractie van de canule, die moet 2-5 minuten worden gestart na het voltooien van de injectiop om te voorkomen dat het tekenen van de virussuspensie back-up en het veroorzaken van een extraspinal morsen.
Omvang en verspreiding van de intraspinale transfectie afhankelijk van de geïnjecteerde deeltjes dosis en intrinsieke eigenschappen van de virale vector, zoals serotype en infectie werkzaamheid. De optimale deeltjesgrootte verdunning moet empirisch worden bepaald voor elk virus en serotype en kan variëren tussen verschillende batches van hetzelfde virus. Effectiviteit van zowel infectie en transductie DNA kan ook verschillen afhankelijk van de doelgroep van neuronen 18,19. AAV bereikt genoverdracht in neuronen zonder pathogene en minimale immuunsysteem bijwerkingen 20. In onze ervaring, de infectie van dorsale hoorn neuronen is voltooid binnen 1-2 weken en stabiel. We hebben gezien kleine microglia responsen op de injectieplaatsen, maar deze verdwenen binnen een week.
We raden vergelijken van verschillende serotypes van vectoren die een reportergen zoals EGFP uiten evaluate transfectie rates Bepaal de tijdsintervallen tussen injectie en stabiele transfectie en vaststellen of de infectie beperkt tot neuronen. Specificiteit zal afhangen van de celtropisme van de vector, de getransfecteerde gen en de promoter. Onderzoekers bestuderen somatosensorische wegen dient tevens ganglion neuronen voor een mogelijke expressie van het reporter-gen, die kunnen voortvloeien uit infectie van deze neuronen de centrale aansluitingen in de dorsale hoorn of vervuiling van de cerebrospinale vloeistof 19.
In de Verenigde Staten is het gebruik van virale vectoren voor genmanipulatie gereguleerd door de NIH richtlijnen voor onderzoek met recombinant DNA moleculen ( http://oba.od.nih.gov/rdna/nih_guidelines_oba.html ). Deze richtsnoeren bepalen voor onderzoeker opleiding, persoonlijke bescherming, virale vector insluiting, decontamination, de verwijdering van verontreinigde materialen, zoals gebruikte spuiten en canules, en stallen na de injectie. Onderzoekers moeten werken met hun lokale IACUC of een gelijkwaardig orgaan van institutionele toezicht op de regels en voorschriften die van toepassing zijn op hun onderzoek vast te stellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
Acknowledgments
Wij danken Bakhos A. Tannous, Ph.D., directeur van Vector Ontwikkeling en Productie in de Neuroscience Center van het Massachusetts General Hospital, Charlestown, Massachusetts, voor het verstrekken van ons met de rAAV-EGFP vector, en John Whang voor technische ondersteuning. Dit werk werd ondersteund door subsidies R01 NS050408 (naar JS) van het Nationaal Instituut voor Neurologische Aandoeningen en Stroke.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Spinal base plate | David Kopf Instruments | 912 | |
| Small animal stereotaxic instrument | David Kopf Instruments | 900 | |
| Mouse gas anesthesia head holder | David Kopf Instruments | 923-B | |
| Adjustable base mounts | David Kopf Instruments | 982 | |
| V notch spikes | David Kopf Instruments | 987 | |
| Small animal temperature control system | David Kopf Instruments | TCAT-2LV | |
| Adson forceps | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Laminectomy forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | |
| UltraMicroPump (one) with SYS-Micro4 Controller | World Precision Instruments | UMP3-1 | |
| Microsyringe, 65RN | Hamilton | 7633-01 | |
| RN compression fitting, 1 mm | Hamilton | 55750-01 | |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Microgrinder | Narishige | EG-44 |
References
- Lewandoski, M. Conditional control of gene expression in the mouse. Nature Reviews Genetics. 2, 743-755 (2001).
- Couto, L. B., High, K. A. Viral vector-mediated RNA interference. Curr. Opin. Pharmacol. 10, 534-542 (2010).
- Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. Genetic dissection of neural circuits. Neuron. 57, 634-660 (2008).
- Davidson, B. L., Breakefield, X. O. Viral vectors for gene delivery to the nervous system. Nature Reviews Neuroscience. 4, 353-364 (2003).
- Todd, A. J. Neuronal circuitry for pain processing in the dorsal horn. Nature Reviews Neuroscience. 11, 823-836 (2010).
- Wall, N. R., Wickersham, I. R., Cetin, A., De La Parra, M., Callaway, E. M. Monosynaptic circuit tracing in vivo through Cre-dependent targeting and complementation of modified rabies virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 21848-21853 (2010).
- Lo, L., Anderson, D. J. A Cre-dependent, anterograde transsynaptic viral tracer for mapping output pathways of genetically marked neurons. Neuron. 72, 938-950 (2011).
- Zhao, S., et al. Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nature Methods. 8, 745-752 (2011).
- Tang, X. Q., Heron, P., Mashburn, C., Smith, G. M. Targeting sensory axon regeneration in adult spinal cord. J. Neurosci. 27, 6068-6078 (2007).
- Cameron, A. A., Smith, G. M., Randall, D. C., Brown, D. R., Rabchevsky, A. G. Genetic manipulation of intraspinal plasticity after spinal cord injury alters the severity of autonomic dysreflexia. J. Neurosci. 26, 2923-2932 (2006).
- Passini, M. A., et al. CNS-targeted gene therapy improves survival and motor function in a mouse model of spinal muscular atrophy. The Journal of Clinical Investigation. 120, 1253-1264 (2010).
- Lutz, C. M., et al. Postsymptomatic restoration of SMN rescues the disease phenotype in a mouse model of severe spinal muscular atrophy. The Journal of Clinical Investigation. 121, 3029-3041 (2011).
- Chen, S. L., et al. dsAAV type 2-mediated gene transfer of MORS196A-EGFP into spinal cord as a pain management paradigm. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 20096-20101 (2007).
- South, S. M., et al. A conditional deletion of the NR1 subunit of the NMDA receptor in adult spinal cord dorsal horn reduces NMDA currents and injury-induced pain. J. Neurosci. 23, 5031-5040 (2003).
- Tappe, A., et al. Synaptic scaffolding protein Homer1a protects against chronic inflammatory pain. Nat. Med. 12, 677-681 (2006).
- Colle, M. A., et al. Efficient intracerebral delivery of AAV5 vector encoding human ARSA in non-human primate. Human Molecular Genetics. 19, 147-158 (2010).
- Carbajal, K. S., Weinger, J. G., Whitman, L. M., Schaumburg, C. S., Lane, T. E. Surgical Transplantation of Mouse Neural Stem Cells into the Spinal Cords of Mice Infected with Neurotropic Mouse Hepatitis Virus. J. Vis. Exp. (53), e2834 (2011).
- Snyder, B. R., et al. Comparison of adeno-associated viral vector serotypes for spinal cord and motor neuron gene delivery. Hum. Gene Ther. 22, 1129-1135 (2011).
- Towne, C., Pertin, M., Beggah, A. T., Aebischer, P., Decosterd, I. Recombinant adeno-associated virus serotype 6 (rAAV2/6)-mediated gene transfer to nociceptive neurons through different routes of delivery. Mol. Pain. 5, 52 (2009).
- Kaplitt, M. G., et al. Long-term gene expression and phenotypic correction using adeno-associated virus vectors in the mammalian. 8, 148-154 (1994).
