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Neuroscience

माउस स्पाइनल कॉर्ड में सशर्त हेरफेर जीन के लिए एक वायरल वेक्टर की Stereotaxic इंजेक्शन

doi: 10.3791/50313 Published: March 18, 2013

Summary

वायरल वैक्टर लक्षित जीन हेरफेर के लिए अनुमति देते हैं. हम सशर्त जीन की अभिव्यक्ति या माउस रीढ़ की हड्डी में पृथक के लिए एक विधि का प्रदर्शन, पृष्ठीय सींग में एक वायरल वेक्टर stereotaxic इंजेक्शन, प्राथमिक somatosensory afferents और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के न्यूरॉन्स के बीच synaptic संपर्क का एक प्रमुख साइट का उपयोग कर.

Abstract

न्यूरॉन्स या केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के विशेष क्षेत्रों के अलग आबादियों में एक वायरल वेक्टर Intraparenchymal इंजेक्शन सशर्त हेरफेर जीन में सक्षम बनाता है. हम एक stereotaxic इंजेक्शन तकनीक है कि लक्षित जीन या माउस रीढ़ की हड्डी के पृष्ठीय सींग में अभिव्यक्ति मुंह बंद करने की अनुमति देता है को प्रदर्शित करता है. शल्य चिकित्सा की प्रक्रिया संक्षिप्त है. यह एक ही बांस की laminectomy, जानवर और रीढ़ की अछूता गतिशीलता के जल्दी ठीक होने के लिए उपलब्ध कराने की आवश्यकता है. कम और beveled कांच प्रवेशनी के साथ एक microsyringe की गति का उपयोग करने पर एक छोटे वेक्टर निलंबन मात्रा नियंत्रित इंजेक्शन ऊतक घाव को कम. स्थानीय वेक्टर के लिए प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया नियोजित वायरस के आंतरिक गुणों पर निर्भर करता है, हमारे अनुभव में, यह मामूली और अल्पकालिक है जब एक रीकॉम्बीनैंट एडिनो - जुड़े वायरस का प्रयोग किया जाता है. बढ़ाया हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन के रूप में इस तरह के एक पत्रकार जीन वेक्टर के स्थानिक वितरण निगरानी की सुविधा है, और प्रभावकारिता और सेलुलर speciअभिकर्मक के ficity.

Introduction

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माउस में सशर्त जीन में गड़बड़ी की उन्नत प्रौद्योगिकियों synaptic केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में और रास्ते में कार्यात्मक कनेक्शन के अन्वेषण के लिए बहुमुखी दृष्टिकोण सक्षम. Transgenes डॉक्सीसाइक्लिन जैसे छोटे अणु effectors एक टेट्रासाइक्लिन नियंत्रित transactivator, जो एक repressor या जीन प्रतिलेखन के एक उत्प्रेरक, या tamoxifen एक mutated एस्ट्रोजन एक रिसेप्टर ligand बाध्यकारी डोमेन को पहचानने के रूप में कार्य करने के लिए तैयार किया जा सकता है पर अभिनय द्वारा विनियमित किया जा सकता है . अपरिवर्तनीय transgene संशोधन आमतौर पर deoxyribonucleic एसिड (डीएनए) recombinases द्वारा हासिल की है. (कारणों पुनर्संयोजन) Cre और FLP (flippase पुनर्संयोजन एंजाइम) छांटना उलटा, या डीएनए टुकड़े (पार x बिन्दुपथ के, P1) loxP या Frt (flippase मान्यता लक्ष्य) साइटों, 1 क्रमशः द्वारा flanked हैं स्थानान्तरण उत्प्रेरित. आवेदन जीन सक्रियण या मुंह बंद और inducible ribonucleic एसिड (आरएनए) हस्तक्षेप 3 कनेक्टिविटी की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. उत्तर (अमेरिका में बड़े पैमाने पर mutagenesis परियोजनाओं http://www.norcomm.org/index.htm ) और यूरोप ( http://www.knockoutmouse.org/about/eucomm ) माउस भ्रूणीय स्टेम सेल क्लोनों के पुस्तकालयों के साथ उत्पादन कर रहे हैं सशर्त लक्ष्य जीन और जाल है कि अंततः पूरे माउस जीनोम को कवर किया जाएगा. इन क्लोन से उत्पन्न चूहे माउस लाइनों की संख्या एक विस्तार के साथ पार किया जा सकता है कि प्रमोटरों या loci चयनात्मक जीन हेरफेर के लिए न्यूरॉन्स की एक विशेष जनसंख्या (विशिष्ट तहत डीएनए recombinases व्यक्त http://nagy.mshri.on.ca/cre_new/index php. ).

4 उपलब्ध हैं. उच्च क्षमता (gutless) adenovirus, एडिनो - जुड़े वायरस, दाद सिंप्लेक्स वायरस और lentivirus सामान्यतः neurotropic वैक्टर किया जाता है. एक शोध प्रश्न के लिए उपयुक्त वायरस का चयन प्रयोगात्मक डिजाइन का एक महत्वपूर्ण हिस्सा है. Transgene का आकार, प्रसव के मार्ग, संक्रमण के न्यूरॉन्स glial कोशिकाओं, संक्रमण प्रभावकारिता, सूजन और जहरीले साइड इफेक्ट से 4 विचार करने की आवश्यकता के रूप में करने का विरोध करने के लिए विशिष्टता.

यहाँ हम रीढ़ की हड्डी के पृष्ठीय सींग, एक तकनीक है कि हम हमारे शोध में दर्द के तंत्रिका जीव विज्ञान पर सशर्त जीन विनियमन के लिए रोजगार में एक वायरल वेक्टर stereotaxic इंजेक्शन का वर्णन. पृष्ठीय सींग nociceptive न्यूरॉन्स सहित प्राथमिक somatosensory न्यूरॉन्स से अभिवाही इनपुट प्राप्त करता है. स्थानीय interneurons जानकारी प्रक्रिया से पहले प्रक्षेपण न्यूरॉन्स से संप्रेषित करने के लिए5 मस्तिष्क पृष्ठीय सींग. हम एक neurotropic पुनः संयोजक एडिनो - जुड़े वायरस (rAAV) कि एक constitutively सक्रिय cytomegalovirus प्रमोटर के तहत बढ़ाया हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (EGFP) व्यक्त के साथ रीढ़ की हड्डी में कमानी L4 स्तर पर पृष्ठीय सींग न्यूरॉन्स के संक्रमण को प्रदर्शित करता है.

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Protocol

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शल्य वर्णित प्रक्रिया संस्थागत पशु की देखभाल और कोलंबिया विश्वविद्यालय के उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया.

1. उपकरण और वायरस कण निलंबन की तैयारी

  1. साफ और कीटाणुरहित उपकरण, सर्जिकल उपकरणों और वी पायदान spikes है कि पृष्ठवंश L1 को ठीक करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा बाँझ.
  2. खींचो और bevel कांच pipettes. हम pipettes कि 40 सुक्ष्ममापी की एक टिप व्यास है और 20 डिग्री के कोण पर beveled का उपयोग करें. कांच pipettes जीवाणुरहित.
  3. Stereotaxic फ्रेम सेट, मैनिप्युलेटर है पर microsyringe सुई लगानेवाला माउंट और नियंत्रक के लिए सुई लगानेवाला कनेक्ट.
  4. Microsyringe संपीड़न फिटिंग किट का उपयोग करने के लिए एक गिलास pipettes संलग्न.
  5. गोताख़ोर microsyringe से निकालें और खनिज तेल के साथ सिरिंज भरें. लाल तेल हे (1 - (2,5 - डाइमिथाइल-4 (phenylazo 2,5-dimethylphenylazo)) 2 - naphthol) खनिज तेल के लिए जोड़ा जा सकता है इसके वी में वृद्धिisibility. Reinsert सवार और टिप करने के लिए सभी तरह से करने के लिए धक्का. ध्यान से एक हवाई बुलबुले बनाने से बचें.
  6. एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में वायरस कण निलंबन तैयार. बर्फ पर जमे हुए वायरस पिघलना और, बस का उपयोग करने से पहले, यह बाँझ वांछित कण एकाग्रता के लिए खारा फॉस्फेट बफर के साथ पतला.
  7. सुई लगानेवाला पर धारक में microsyringe डालें.
  8. पिपेट एक छोटे प्लास्टिक शीट पर 5 वायरस निलंबन के μl, जैसे Parafilm. निचले बूंद में कांच विंदुक टिप और सवार खींचने के लिए microsyringe भरने. विंदुक नोक पर एक छोटा सा हवाई बुलबुले यह clogging से रोकने बनाएँ.

2. Laminectomy

  1. बेंच और निस्संक्रामक के साथ हीटिंग पैड पोंछते द्वारा सर्जरी के क्षेत्र तैयार.
  2. माउस anesthetize. हम isoflurane साथ अभिश्वसन संज्ञाहरण का उपयोग करें (प्रेरण, रखरखाव के दौरान 2% -3% के दौरान 3%).
  3. प्रत्येक आंख पर चिकनाई प्लेस दौरान सुखाने से आंखों की रक्षाआपरेशन.
  4. पीठ के निचले हिस्से से माउस की गर्दन फर दाढ़ी और chlorhexidine या povidone आयोडीन और 70% इथेनॉल के रूप में इस तरह के एक सामयिक एंटीसेप्टिक पोंछे बारी के साथ त्वचा कीटाणुरहित. सर्जिकल कपड़ा के साथ aseptically तैयार साइट अलग और चीरा साइट bupivacaine (0.25%, शारीरिक नमक के साथ पतला 1:10) के साथ घुसपैठ.
  5. Midline (2-3 सेमी) के साथ रिब पिंजरे के लांगुलिय अंत में त्वचा को काटकर अलग कर देना और रीढ़ की हड्डी को कवर प्रावरणी अलग.
  6. क्योंकि रीढ़ की हड्डी कशेरुका स्तंभ से प्रसव के बाद विकास के दौरान पहले बढ़ रोकता है, रीढ़ की L4 खंड 1 काठ का बांस (L1) के नीचे स्थित है. पृष्ठवंश L1 पृष्ठवंश कि पसलियों की आखिरी जोड़ी धारण लांगुलिय स्थित है. पहचानें और छोटे स्पाइनल मांसपेशियों और अपनी पृष्ठीय सतह जुड़ी स्नायुबंधन को हटाने पृष्ठवंश L1 बेनकाब.
  7. थोड़ा उठा और एक Adson संदंश साथ पृष्ठवंश L1 पकड़. एक समर्पित laminectomy संदंश का प्रयोग हटा पृष्ठीय PortIOn पृष्ठवंश (रीढ़ की हड्डी और लामिना) और रीढ़ की हड्डी बेनकाब की. रीढ़ की हड्डी को नुकसान पहुँचाए से बचें.
  8. Stereotaxic फ्रेम में हीटिंग थाली पर माउस स्थानांतरण. बाद में ऑपरेशन के दौरान माउस के तापमान पर नजर रखने.

3. इंजेक्शन

  1. वी पायदान spikes के साथ पृष्ठवंश L1 फिक्स. spikes रीढ़ को स्थिर इतना है कि पृष्ठवंश सांस लेने के दौरान कदम नहीं करता है चाहिए.
  2. Microsyringe करीब इतना है कि विंदुक टिप laminectomy साइट के ऊपर ले आओ. सवार कम जब तक आप वायरस विंदुक बाहर निकलने निलंबन देखते हैं. एक बाँझ कपास टिप के साथ छोटी बूंद निकालें.
  3. उजागर रीढ़ की हड्डी के भाग व्याख्यान चबूतरे वाला सबसे विंदुक टिप स्थिति. केंद्र पीछे मंझला sulcus ऊपर विंदुक, तो टिप 500 सुक्ष्ममापी laterally कदम. निचले कॉर्ड और ड्यूरा मैटर पंचर की सतह को टिप या, अगर आप एक unbeveled कांच विंदुक के साथ काम कर रहे हैं, पंचर करने के लिए एक beveled स्टील प्रवेशनी का उपयोग घura. रीढ़ की हड्डी में कांच विंदुक 300 सुक्ष्ममापी की नोक से कम.
  4. वायरस के निलंबन की 200 nl / मिनट की दर पर 1 μl इंजेक्षन.
  5. इंजेक्शन के अंत में, धीरे धीरे विंदुक retracting से पहले कम से कम 2 मिनट इंतज़ार करो.
  6. 3.5-3.3 कदम दुम का सबसे उजागर रीढ़ की हड्डी के भाग में रीढ़ की हड्डी में खंड L4 में वायरल वेक्टर का पूरा वितरण को प्राप्त करने के लिए दोहराएँ. दो इंजेक्शन साइटों व्याख्यान चबूतरे वाला और L4 खंड की दुम का लक्ष्य क्षेत्र में ऊतकों को नुकसान से बचने स्थित हैं.

4. घाव बंद

  1. Stereotaxic फ्रेम से वी पायदान clamps से रिलीज पृष्ठवंश L1 और माउस को हटा दें.
  2. 5.0 vicryl साथ प्रावरणी सीवन. बंद प्रावरणी laminectomy साइट के लिए कवर प्रदान करता है.
  3. बंद नायलॉन sutures या शल्य स्टेपल साथ त्वचा.

5. पश्चात देखभाल

  1. एक वसूली पिंजरे को नरम, nonparticular बिस्तर के साथ माउस स्थानांतरण. यह टी पर रखेंवह आराम से साँस लेने के लिए की ओर. पशु मॉनिटर जब तक यह पूरी तरह सतर्क है, चलनक्षम है और पीने के शुरू.
  2. हम दैनिक चमड़े के नीचे इंजेक्शन carprofen (5.0 मिलीग्राम / किग्रा) के साथ 72 घंटे के लिए postsurgical analgesia प्रदान करते हैं.
  3. दैनिक निरीक्षण से पहले 3 दिनों के लिए postsurgical वसूली मॉनिटर, तो हर दूसरे दिन या प्रयोग जब तक प्रति सप्ताह 3 दिन पूरा हो गया है.
  4. ऑपरेशन के बाद 7 से 10 दिनों त्वचा sutures या स्टेपल निकालें, जब घाव भरने पूरा हो गया है.
  5. प्रयोग के पूरा होने के बाद पशु euthanize.

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Representative Results

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(1 चित्रा) इंजेक्शन पृष्ठीय सींग के न्यूरॉन्स contralateral ओर, उदर सींग और पृष्ठीय रूट ganglia के पृष्ठीय सींग बख्शते में सफल अभिकर्मक मजबूत जीन की अभिव्यक्ति की पैदावार.

चित्रा 1
चित्रा 1. पृष्ठीय सींग न्यूरॉन्स की प्रोटोकॉल (ए) L4 रीढ़ की हड्डी, rAAV EGFP की stereotaxic इंजेक्शन के बाद दो सप्ताह (सीरोटाइप AAV2 / 8, 10 9 जीनोम / प्रतियां के बाईं पृष्ठीय सींग में फ्लोरोसेंट संवाददाता EGFP (हरा) की अभिव्यक्ति ) μl. न्यूरॉन्स neuronal नाभिक प्रोटीन (NeuN, लाल) के लिए immunostained थे. तीर पृष्ठीय स्तंभ में बिखरे हुए ट्रांसफ़ेक्ट glial कोशिकाओं को इंगित प्रमुख हैं. स्केल बार, 150 सुक्ष्ममापी (बी) को औसत दर्जे का पृष्ठीय सींग में न्यूरॉन्स का लगभग 80% संक्रमित थे. स्केल बार, 20 सुक्ष्ममापी. NeuN (ईएमडी Millipore) के खिलाफ एक मोनोक्लोनल एंटीबॉडी 1:2,0 की एक कमजोर पड़ने पर इस्तेमाल किया गया था00 immunostaining के लिए.

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Discussion

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9,10 चोट, या जीन थेरेपी से उत्थान के दौरान या 11 neurodegeneration की रोकथाम और उपचार के लिए 6,7 या optogenetic 8 विच्छेदन, अक्षतंतु मार्गदर्शन में फैल transsynaptic वायरस पर आधारित Stereotaxic वेक्टर इंजेक्शन neuronal नेटवर्क मानचित्रण के रूप में इस तरह के अनुप्रयोगों के लिए रीढ़ की हड्डी में न्यूरॉन्स को लक्षित की अनुमति देता है, 12. वायरल वैक्टर रीढ़ की हड्डी में किया गया है जीन हेरफेर करने के लिए इस्तेमाल किया somatosensory मोटर, और autonomic रास्ते 9,10,13-15 अध्ययन. माउस मॉडल जीव सबसे व्यापक रूप से मस्तिष्क या स्पाइनल कॉर्ड में एक वायरल वेक्टर stereotaxic इंजेक्शन से जुड़े अध्ययनों में इस्तेमाल किया है, लेकिन तकनीक nonhuman primates 16 सहित अन्य प्रजातियों में नियोजित किया गया है.

माउस रीढ़ की हड्डी में Stereotaxic वेक्टर इंजेक्शन सुरक्षित है, शल्य प्रक्रिया यहाँ वर्णित इंजेक्शन स्थल पर एक एकल laminectomy की आवश्यकता है इतना है कि पशु instabili बिना ठीकअपनी रीढ़ की हड्डी के आंदोलनों में ty. इंजेक्शन और प्रवेशनी की धीमी गति से हटाने के 10 मिनट के भीतर पूरा कर रहे हैं, त्वचा की तैयारी और घाव बंद सहित पूरी प्रक्रिया में लगभग 40 मिनट तक रहता है. Postsurgical संज्ञाहरण carprofen, एक nonsteroidal विरोधी भड़काऊ एनाल्जेसिक दवा के साथ 72 घंटे के लिए प्रदान करते हैं.

ऊतक आघात को कम से कम करने के लिए, हम 40 सुक्ष्ममापी की एक टिप व्यास के साथ खींच गिलास cannulas रोजगार. एक तेज beveled प्रवेशनी टिप रीढ़ की हड्डी में प्रविष्टि eases, एक micropipette चक्की में निवेश को न्यायोचित ठहरा. एक चक्की का प्रयोग भी प्रयोग में प्रत्येक एक सुसंगत बेवल कोण को बनाए रखने की अनुमति देता है, इंजेक्शन परिणाम की भिन्नता को कम करने. हम पृष्ठीय सींग में एक वायरस कण निलंबन का भी वितरण के लिए मैनुअल दूरंदेशता 17 से अधिक इंजेक्शन गति के स्वचालित नियंत्रण पसंद करते हैं और एक इंजेक्शन त्रुटि के जोखिम को कम करने के लिए. समान रूप से महत्वपूर्ण प्रवेशनी की एक धीमी निकासी, जो injecti पूरा करने के बाद 2-5 मिनट से शुरू हो जाना चाहिएपर वायरस निलंबन वापस ड्राइंग और एक extraspinal फैल के कारण से बचने.

हद तक और intraspinal अभिकर्मक के वितरण इंजेक्शन कण खुराक और सीरोटाइप और संक्रमण प्रभावकारिता जैसे वायरल वेक्टर के आंतरिक गुणों पर निर्भर करते हैं. इष्टतम कण कमजोर पड़ने empirically प्रत्येक वायरस और सीरोटाइप के लिए निर्धारित किया जा सकता है और एक ही वायरस के विभिन्न बैचों के बीच भिन्न हो सकते हैं. दोनों संक्रमण और डीएनए पारगमन की प्रभावकारिता भी 18,19 न्यूरॉन्स की लक्षित जनसंख्या के आधार पर भिन्न हो सकती है. AAV रोगजनक और न्यूनतम प्रतिरक्षा पक्ष प्रभाव 20 बिना न्यूरॉन्स में जीन स्थानांतरण प्राप्त होता है. हमारे अनुभव में, पृष्ठीय सींग न्यूरॉन्स के संक्रमण के 1-2 सप्ताह और स्थिर के भीतर पूरा हो गया है. हम इंजेक्शन स्थलों पर मामूली microglial प्रतिक्रियाओं मनाया है, लेकिन इनमें से एक सप्ताह के भीतर हल.

हम वैक्टर के विभिन्न सीरमप्रकारों कि eval EGFP के रूप में एक रिपोर्टर जीन व्यक्त की तुलना करने की अनुशंसाअभिकर्मक दरों uate, इंजेक्शन और स्थिर अभिकर्मक के बीच समय अंतराल को निर्धारित किया गया है और स्थापित है कि संक्रमण न्यूरॉन्स के लिए सीमित है. विशिष्टता वेक्टर ट्रांसफ़ेक्ट जीन और इसके प्रमोटर की सेल tropism पर निर्भर करेगा. Somatosensory रास्ते का अध्ययन जांचकर्ता भी रिपोर्टर जीन है, जो पृष्ठीय सींग में उनके केंद्रीय टर्मिनलों पर या मस्तिष्कमेरु द्रव 19 के संक्रमण से इन न्यूरॉन्स के संक्रमण से हो सकता है एक संभावित अभिव्यक्ति के लिए पृष्ठीय रूट नाड़ीग्रन्थि न्यूरॉन्स की जांच करनी चाहिए.

संयुक्त राज्य अमेरिका में, जीन हेरफेर के लिए वायरल वैक्टर का उपयोग अनुसंधान के लिए NIH दिशानिर्देश पुनर्संयोजक डीएनए अणु (सहयोग द्वारा विनियमित है http://oba.od.nih.gov/rdna/nih_guidelines_oba.html ). ये दिशानिर्देश अन्वेषक प्रशिक्षण, व्यक्तिगत सुरक्षा, वायरल वेक्टर रोकथाम, decontaminatio के लिए आवश्यकताओं बंधेज करनाn इस्तेमाल सीरिंज और cannulas, और इंजेक्शन के बाद पशु आवास के रूप में इस तरह के दूषित सामग्री के निपटान. जांचकर्ता उनके स्थानीय IACUC या संस्थागत निरीक्षण के बराबर शरीर के लिए नियमों और विनियमों है कि उनके शोध के लिए लागू निर्धारित के साथ काम करना चाहिए.

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Disclosures

लेखक का घोषणा की कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है.

Acknowledgments

हम तकनीकी सहायता के लिए ए Bakhos Tannous, पीएच.डी., वेक्टर और मैसाचुसेट्स जनरल अस्पताल, Charlestown, मैसाचुसेट्स, तंत्रिका विज्ञान केन्द्र में विकास और उत्पादन के हमें वेक्टर rAAV EGFP साथ प्रदान करने के लिए निदेशक, और जॉन मारना धन्यवाद. इस काम के लिए अनुदान द्वारा समर्थित किया गया मस्तिष्क संबंधी विकार और स्ट्रोक के राष्ट्रीय संस्थान से NS050408 R01 (जे एस).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Spinal base plate David Kopf Instruments 912
Small animal stereotaxic instrument David Kopf Instruments 900
Mouse gas anesthesia head holder David Kopf Instruments 923-B
Adjustable base mounts David Kopf Instruments 982
V notch spikes David Kopf Instruments 987
Small animal temperature control system David Kopf Instruments TCAT-2LV
Adson forceps Fine Science Tools 11006-12
Laminectomy forceps Fine Science Tools 11223-20
UltraMicroPump (one) with SYS-Micro4 Controller World Precision Instruments UMP3-1
Microsyringe, 65RN Hamilton 7633-01
RN compression fitting, 1 mm Hamilton 55750-01
Borosilicate glass capillaries World Precision Instruments 1B100F-4
Microgrinder Narishige EG-44

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References

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Inquimbert, P., Moll, M., Kohno, T., Scholz, J. Stereotaxic Injection of a Viral Vector for Conditional Gene Manipulation in the Mouse Spinal Cord. J. Vis. Exp. (73), e50313, doi:10.3791/50313 (2013).More

Inquimbert, P., Moll, M., Kohno, T., Scholz, J. Stereotaxic Injection of a Viral Vector for Conditional Gene Manipulation in the Mouse Spinal Cord. J. Vis. Exp. (73), e50313, doi:10.3791/50313 (2013).

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