Summary
Los vectores virales permiten la manipulación dirigida de genes. Se demuestra un método para la expresión génica condicional o ablación en la médula espinal de ratón, usando inyección estereotáxica de un vector viral en el asta dorsal, un sitio prominente de contacto sináptico entre las vías aferentes somatosensoriales y las neuronas del sistema nervioso central.
Abstract
Inyección intraparenquimatosa de un vector viral permite la manipulación génica condicional en distintas poblaciones de neuronas o regiones particulares del sistema nervioso central. Se demuestra una técnica de inyección estereotáxica que permite la expresión del gen objetivo o el silenciamiento en el cuerno dorsal de la médula espinal de ratón. El procedimiento quirúrgico es breve. Se requiere laminectomía de una sola vértebra, proporcionando para la recuperación rápida del animal y de la motilidad irreprochable de la columna vertebral. Inyección controlada de un volumen pequeño vector suspensión a baja velocidad y el uso de una microjeringa con cánula de cristal biselado minimizar la lesión del tejido. La respuesta inmune local al vector depende de las propiedades intrínsecas del virus empleados, en nuestra experiencia, es menor y de corta duración cuando un recombinante de virus adeno-asociado se utiliza. Un gen informador tal como la proteína verde fluorescente mejorada facilita la distribución de seguimiento espacial del vector, y la eficacia y la especificidad celularficidad de la transfección.
Introduction
Las tecnologías avanzadas de manipulación de genes en el ratón condicional permitir que los enfoques multifacéticos para la exploración de las vías sinápticas y las conexiones funcionales en el sistema nervioso central. Los transgenes pueden ser reguladas por efectores de moléculas pequeñas tales como doxiciclina que actúan sobre un transactivador controlado por tetraciclina, que puede ser diseñado para funcionar como un represor o un activador de la transcripción de genes, o tamoxifeno reconociendo un ligando mutado dominio de unión del receptor de estrógeno 1 . Modificación irreversible transgén se consigue comúnmente por el ácido desoxirribonucleico (ADN) recombinasas. Cre (recombinación causas) y FLP (enzima flipasa recombinación) catalizan la escisión, la inversión o translocación de fragmentos de ADN que están flanqueadas por loxP (locus de cruce sobre x, P1) o frontales (objetivo flipasa reconocimiento) los sitios, respectivamente 1. Las aplicaciones incluyen la activación de genes o el silenciamiento y inducible por ácido ribonucleico (ARN) interferencia
4. De alta capacidad (gutless) adenovirus, virus adeno-asociados, virus del herpes simple y lentivirus son comúnmente utilizados vectores neurotrópicos. Selección del virus apropiado para una pregunta de investigación es una parte crucial del diseño experimental. Tamaño del transgén, vía de administración, la especificidad de la infección a las neuronas frente a las células gliales, infección de eficacia, los efectos secundarios inflamatorios y tóxicos necesitan ser considerados 4.
Aquí se describe la inyección estereotáxica de un vector viral en el asta dorsal de la médula espinal, una técnica que se emplea para la regulación génica condicional en nuestra investigación sobre la neurobiología del dolor. El cuerno dorsal recibe impulsos aferentes primarios de neuronas somatosensoriales incluyendo las neuronas nociceptivas. Interneuronas locales procesar la información antes de transmitirla neuronas de proyección deel cuerno dorsal al cerebro 5. Se demuestra que la infección de las neuronas del asta dorsal a nivel espinal segmentaria L4 con un neurotrópico recombinante adeno-associated virus (rAAV) que expresa aumento de proteína verde fluorescente (EGFP) bajo un promotor de citomegalovirus constitutivamente activo.
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Protocol
El procedimiento quirúrgico descrito ha sido aprobado por el Cuidado de Animales institucional y el empleo Comisión (IACUC) de la Universidad de Columbia.
1. Preparación de equipos y suspensión de partículas de virus
- Limpiar y desinfectar el equipo, esterilizar los instrumentos quirúrgicos y los picos de primera categoría V que se utilizan para fijar L1 vértebra.
- Tire y pipetas de cristal biselado. Nosotros usamos pipetas que tienen un diámetro de punta de 40 micras y están biselados en un ángulo de 20 °. Esterilice las pipetas de vidrio.
- Establecer el marco estereotáxico, montar el inyector microjeringa sobre el manipulador y conectar el inyector al controlador.
- Conecte una de las pipetas de vidrio a la microjeringa utilizando el kit de conexión de compresión.
- Retire el émbolo de la microjeringa y llene la jeringa con aceite mineral. Oil Red O (1 - (2,5-dimetil-4-(2,5-dimethylphenylazo) fenilazo)-2-naftol) se puede añadir al aceite mineral para aumentar su visibility. Vuelva a insertar el émbolo y empujar a todo el camino hasta la punta. Con cuidado, evitar la creación de una burbuja de aire.
- Preparar la suspensión de partículas de virus en una cabina de bioseguridad. Descongelar el virus congelado en hielo y, justo antes de su uso, diluir con agua estéril salina tamponada con fosfato a la concentración de partículas deseado.
- Inserte la microjeringa en el soporte del inyector.
- Verter de 5 l de la suspensión de virus en una hoja de plástico, por ejemplo Parafilm. Baje la punta de la pipeta de vidrio en la gota y tire del émbolo para llenar la microjeringa. Crear una pequeña burbuja de aire en la punta de la pipeta para evitar que se obstruya.
2. Laminectomía
- Prepare el área de la cirugía, limpiando banco y almohada eléctrica con desinfectante.
- Se anestesia el ratón. Usamos anestesia por inhalación con isoflurano (3% durante inducción, 2% -3% durante el mantenimiento).
- Coloque lubricante en cada ojo para proteger los ojos se sequen durante laoperación.
- Afeitar el pelo de la espalda baja para el cuello del ratón y desinfectar la piel con alternancia de toallitas de un antiséptico tópico como la clorhexidina o povidona yodada y 70% de etanol. Aislar el sitio preparado asépticamente con paño quirúrgico y se infiltran en el sitio de la incisión con bupivacaína (0,25%, diluido 1:10 con solución salina fisiológica).
- Incisión en la piel en el extremo caudal de la caja torácica a lo largo de la línea media (2-3 cm) y separar la fascia que cubre la columna vertebral.
- Debido a que la médula espinal deja de crecer antes durante el desarrollo postnatal de la columna vertebral, segmento vertebral L4 se encuentra debajo de la primera vértebra lumbar (L1). Vértebra L1 se encuentra caudal a la vértebra que sostiene el último par de costillas. Identificar y exponer vértebra L1 mediante la eliminación de los pequeños músculos de la columna vertebral y los ligamentos adheridos a la superficie dorsal.
- Levante ligeramente y mantén presionado L1 vértebra con una pinza Adson. Use unas pinzas laminectomía dedicados a eliminar el dorsal Portion de la vértebra (columna vertebral y de la lámina) y exponer la médula espinal. Evitar daños en la médula espinal.
- Transferir el ratón sobre la placa de calentamiento en el marco estereotáxico. Controlar la temperatura del ratón durante la operación posterior.
3. Inyección
- Fijar vértebra L1 con puntas de primera clase V. Las espigas deben estabilizar la columna vertebral de modo que la vértebra no se mueve durante la respiración.
- Llevar la microjeringa más cerca de modo que la punta de la pipeta está por encima del sitio de laminectomía. Baje el émbolo hasta que vea la suspensión de virus que sale de la pipeta. Retire la gota con una punta de algodón estéril.
- Coloque la punta de la pipeta en la parte rostral más de la médula espinal expuesta. Centro de la pipeta por encima del surco mediano posterior, a continuación, mover la punta 500 m lateralmente. Baje la punta a la superficie de la médula y punción de la duramadre o, si usted está trabajando con una pipeta de vidrio unbeveled, use una cánula de acero biselado para perforar el dura. Baje la punta de la pipeta de vidrio 300 micras en la médula espinal.
- Inyectar 1 l de suspensión de virus a una tasa de 200 NL / min.
- Al final de la inyección, espere al menos 2 min antes de retraer lentamente la pipeta.
- Repetir los pasos desde 3,3 hasta 3,5 en la porción caudal más-de la médula espinal expuesta para conseguir una distribución completa del vector viral en L4 segmento espinal. Los dos sitios de inyección se encuentran rostral y caudal del segmento L4 para evitar el daño tisular en la región diana.
4. Cierre de la herida
- Release vértebra L1 de las abrazaderas de primera clase V y quitar el ratón del marco estereotáxico.
- Sutura de la fascia con vicryl 5.0. La fascia cerrado proporciona cobertura para el sitio de laminectomía.
- Cierre la piel con suturas de nylon o grapas quirúrgicas.
5. Cuidado Postoperatorio
- Transferir el ratón en una jaula de recuperación con ropa de cama blanda, nonparticular. Colócalo en tél laterales para respirar cómodo. Supervisar el animal hasta que esté completamente alerta, ambulante y empieza a beber.
- Nos proporcionar analgesia posquirúrgica durante 72 h con inyecciones subcutáneas diarias de carprofeno (5,0 mg / kg).
- Monitorear la recuperación postquirúrgica mediante la inspección diaria durante los primeros 3 días, luego cada dos días o 3 días a la semana hasta que el experimento está completo.
- Eliminar las suturas de la piel o las grapas 7 a 10 días después de la operación, cuando la curación de heridas es completa.
- Sacrificar al animal después de la finalización del experimento.
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Representative Results
El éxito de los rendimientos de transfección de expresión génica robusto en las neuronas del asta dorsal de inyección (Figura 1), evitando que el cuerno dorsal del lado contralateral, el cuerno ventral y los ganglios de la raíz dorsal.
Figura 1. Transfección de neuronas del asta dorsal. (A) Expresión de la EGFP reportero fluorescente (verde) en el cuerno izquierdo dorsal de la médula espinal L4, dos semanas después de la inyección estereotáxica de rAAV-EGFP (serotipo AAV2 / 8, 10 9 copias del genoma / l). Las neuronas se inmunotiñeron para la proteína núcleos neuronales (NeuN, rojo). Arrow dirige a punto dispersas células transfectadas gliales en la columna dorsal. Barra de escala, a 150 m. (B) Aproximadamente el 80% de las neuronas del asta dorsal medial estaban infectados. Barra de escala, a 20 m. Un anticuerpo monoclonal contra NeuN (EMD Millipore) se utilizó a una dilución de 1:2,000 para la inmunotinción.
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Discussion
La inyección del vector estereotáxica permite dirigir las neuronas de médula espinal para aplicaciones tales como mapeo de la red neuronal basada en virus transsynaptic propagación 6,7 o disección optogenético 8, guiado de los axones durante la regeneración de lesiones 9,10, o la terapia génica para la prevención o el tratamiento de la neurodegeneración 11, 12. Los vectores virales han sido utilizados para la manipulación de genes en la médula espinal para estudiar las vías somatosensoriales, motoras y autonómicas 9,10,13-15. El ratón es el organismo modelo más ampliamente utilizado en estudios que implican la inyección estereotáxica de un vector viral en el cerebro o la médula espinal, pero la técnica ha sido empleada en otras especies, incluyendo primates no humanos 16.
Inyección estereotáxica vector en la médula espinal de ratón es segura, el procedimiento quirúrgico descrito aquí requiere una laminectomía único en el sitio de inyección, de modo que el animal se recupera sin instabilidad en sus movimientos de la columna vertebral. Inyección y extracción lenta de la cánula se completa dentro de 10 min, el procedimiento completo, incluyendo la preparación de la piel y el cierre de la herida dura aproximadamente 40 min. Ofrecemos anestesia postoperatoria durante 72 horas con carprofeno, un fármaco antiinflamatorio analgésico.
Para minimizar el trauma del tejido, empleamos tirados cánulas de vidrio con un diámetro de punta de 40 micras. Una cánula de punta afilada biselada facilita la inserción en la médula espinal, lo que justifica la inversión en un molinillo de micropipeta. El uso de un triturador también permite mantener un ángulo de bisel constante en cada experimento, la reducción de la variación de los resultados de la inyección. Nosotros preferimos el control automatizado de la velocidad de inyección durante 17 dispensación manual para una distribución uniforme de la suspensión de partículas de virus en el asta dorsal y para reducir el riesgo de un error de inyección. Igualmente crítico es una extracción lenta de la cánula, que debe iniciarse 2-5 min después de completar la injectia evitar llamar la suspensión de virus retroceder y causar un derrame extraespinales.
Extensión y distribución de la transfección intraespinal dependen de la dosis de partículas inyectado y propiedades intrínsecas del vector viral tal como el serotipo y eficacia infección. La dilución de partícula óptimo tiene que ser determinada empíricamente para cada virus y serotipo y puede variar entre los diferentes lotes del mismo virus. La eficacia de la infección y la transducción de ADN también pueden ser diferentes dependiendo de la población específica de neuronas 18,19. AAV logra la transferencia génica en neuronas sin patógenos y mínimos efectos secundarios inmunológicos 20. En nuestra experiencia, la infección de las neuronas del asta dorsal se completa en 1-2 semanas y estables. Hemos observado menores respuestas microglial en lugares de inyección, pero estos se resolvieron en una semana.
Se recomienda la comparación de diferentes serotipos de vectores que expresan un gen informador tal como EGFP a evalluar las tasas de transfección, determinar los intervalos de tiempo entre la inyección y la transfección estable y determinar si la infección es limitada a las neuronas. Especificidad dependerá del tropismo celular del vector, el gen transfectado y su promotor. Los investigadores que estudian las vías somatosensoriales también debe examinar dorsal neuronas ganglionares de la raíz de una posible expresión del gen informador, que puede resultar de la infección de estas neuronas en sus terminales centrales en el asta dorsal o de la contaminación del líquido cefalorraquídeo 19.
En los Estados Unidos, el uso de vectores virales para la manipulación de genes está regulada por las directrices del NIH para la investigación con moléculas de ADN recombinante ( http://oba.od.nih.gov/rdna/nih_guidelines_oba.html ). Estas directrices establecen los requisitos para la formación investigadora, la protección personal, la contención vector viral, decontamination, eliminación de materiales contaminados, tales como jeringas y cánulas y alojamiento de los animales después de la inyección. Los investigadores deben trabajar con su IACUC local u organismo equivalente de la supervisión institucional para determinar las reglas y regulaciones que se aplican a su investigación.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto financieros.
Acknowledgments
Damos las gracias a A. Bakhos Tannous, Ph.D., Director de Desarrollo y Producción del vector en el Centro de Neurociencia del Hospital General de Massachusetts en Charlestown, Massachusetts, para que nos proporciona el vector rAAV-EGFP, Whang y Juan de asistencia técnica. Este trabajo recibió el apoyo de subvención R01 NS050408 (a JS) del Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Spinal base plate | David Kopf Instruments | 912 | |
| Small animal stereotaxic instrument | David Kopf Instruments | 900 | |
| Mouse gas anesthesia head holder | David Kopf Instruments | 923-B | |
| Adjustable base mounts | David Kopf Instruments | 982 | |
| V notch spikes | David Kopf Instruments | 987 | |
| Small animal temperature control system | David Kopf Instruments | TCAT-2LV | |
| Adson forceps | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Laminectomy forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | |
| UltraMicroPump (one) with SYS-Micro4 Controller | World Precision Instruments | UMP3-1 | |
| Microsyringe, 65RN | Hamilton | 7633-01 | |
| RN compression fitting, 1 mm | Hamilton | 55750-01 | |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Microgrinder | Narishige | EG-44 |
References
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