Summary
Virala vektorer möjliggöra målinriktat genmanipulation. Vi visar ett förfarande för villkorlig genexpression eller ablation i mus ryggmärgen, med stereotaktisk injektion av en viral vektor i den dorsala hornet, en framstående plats av synaptisk kontakt mellan primära somatosensoriska afferenter och neuroner i det centrala nervsystemet.
Abstract
Intraparenkymal injektion av en viral vektor möjliggör villkorlig genmanipulation i distinkta populationer av nervceller eller vissa regioner i centrala nervsystemet. Vi visar en stereotaxisk injektion teknik som tillåter riktad genexpression eller tystande i det dorsala hornet av ryggmärgen hos möss. Det kirurgiska ingreppet är kort. Det kräver laminektomi av en enda kota, ger för snabb återhämtning av djuret och felfri motilitet av ryggraden. Kontrollerad injektion av en liten vektor upphängning volym på låg hastighet och användning av en mikrospruta med avfasade glas kanyl minimera vävnaden lesionen. Den lokala immunsvaret till vektorn beror på de inneboende egenskaperna hos den använda viruset, i vår erfarenhet, är det mindre och kortlivat när en rekombinant adeno-associerat virus används. En reportergen som förstärkt grönt fluorescerande protein underlättar övervakning rumsliga fördelningen av vektorn, och effekt och cellulära speficity av transfektionen.
Introduction
Avancerad teknik för villkorad genmanipulation i musen möjliggör mångsidiga tillvägagångssätt för utforskandet av synaptiska vägar och funktionella anslutningar i det centrala nervsystemet. Transgener kan regleras genom små molekyler effektorer såsom doxycyklin verkar på en tetracyklin-kontrollerad transaktivator, som kan vara utformad för att fungera som en repressor eller en aktivator av gentranskription, eller tamoxifen som känner igen en muterad ligandbindande domänen av östrogenreceptorn en . Irreversibel transgen modifiering uppnås vanligen genom deoxiribonukleinsyra (DNA) rekombinaser. Cre (orsakar rekombination) och Flp (flippas rekombination enzym) katalyserar excision, inversion eller flyttning av DNA-fragment som flankeras av loxP (platsen för korsning X över, P1) eller Främre (flippas erkännande mål) platser, respektive 1. Applikationer inkluderar genaktivering eller tysta och inducerbara ribonukleinsyra (RNA) interferens
4. Hög kapacitet (feg) adenovirus, adenoassocierat virus, herpes simplex-virus och lentivirus-används vanligen neurotropa vektorer. Välja lämplig viruset för en forskningsfråga är en viktig del av den experimentella designen. Storlek av transgenen, leverans väg, specificitet av infektionen till neuroner i motsats till gliaceller, infektion effektivitet, inflammatoriska och toxiska bieffekter måste beaktas 4.
Här beskriver vi stereotaxisk injektion av en viral vektor in dorsalhorn av ryggmärgen, en teknik som vi använder för villkorlig genreglering i vår forskning om neurobiologi av smärta. Den dorsala hornet får afferenta input från primära somatosensoriska neuroner, inklusive nociceptiva neuroner. Lokala interneuronen bearbeta informationen innan projektionen nervceller förmedlar den fråndorsalhorn till hjärnan 5. Vi visar att infektion av dorsala horn neuroner på spinal segmentell nivå L4 med en neurotrop rekombinant adenoassocierat virus (rAAV) som uttrycker förstärkt grönt fluorescerande protein (EGFP) under en konstitutivt aktiv cytomegalovirus-promotorn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Den kirurgiska förfarande som beskrivs har godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) från Columbia University.
1. Beredning av utrustning och virus partikelsuspension
- Rengör och desinficera utrustningen, sterilisera kirurgiska instrument och V spikar notch som kommer att användas för att åtgärda kota L1.
- Dra och koniska pipetter glas. Vi använder pipetter som har en spetsdiameter av 40 um och är avfasade i en vinkel av 20 °. Sterilisera glaspipetter.
- Ställ in stereotaktisk ram, montera mikrosprutan injektorn på roboten och anslut injektorn till styrenheten.
- Fäst en av glaspipetter till mikrosprutan med satsen klämringskoppling.
- Avlägsna kolven från mikrospruta och fylla sprutan med mineralolja. Oil Red O (1 - (2,5-dimetyl-4-(2,5-dimethylphenylazo) fenylazo)-2-naftol) kan sättas till mineraloljan för att öka dess volymisibility. Sätt tillbaka kolven och tryck till hela vägen till spetsen. Försiktigt undvika att skapa en luftbubbla.
- Förbered fjädring viruspartikeln i biosäkerhet skåp. Tina frusna viruset på is och, strax före användning, späda ut det med steril fosfatbuffrad saltlösning till den önskade partikelkoncentration.
- Sätt in mikrospruta i hållaren på injektorn.
- Pipettera 5 ul av virussuspension till en liten plastark, t.ex. Parafilm. Sänk spetsen glaspipett i droppen och dra kolven för att fylla spruta. Skapa en liten luftbubbla vid pipettspetsen för att hindra den från igensättning.
2. Laminektomi
- Förbered operation området genom att torka bänk och värmedyna med desinfektionsmedel.
- Söva musen. Vi använder inhalationsanestesi med isofluran (3% under induktion, 2% -3% vid underhåll).
- Placera smörjmedel på varje öga för att skydda ögonen från uttorkning underdrift.
- Raka päls från den nedre delen av ryggen till nacken hos musen och desinficera huden med alternerande dukarna i en topisk antiseptisk såsom klorhexidin eller povidon-jod och 70% etanol. Isolera aseptiskt beredda plats med kirurgisk duk och infiltrera snittet webbplats med bupivakain (0,25%, utspädd 1:10 med fysiologisk saltlösning).
- Incise huden vid den kaudala änden av bröstkorgen längs mittlinjen (2-3 cm) och separera fascian täcker ryggraden.
- Eftersom ryggmärgen slutar växa tidigare under postnatal utveckling än ryggrad, ligger spinalsegment L4 under den första ländkotan (L1). Kota L1 ligger kaudalt ryggkotan som håller det sista paret av ribbor. Identifiera och exponera kota L1 genom att ta bort de små spinal muskler och ligament är knutna till dess rygg yta.
- Lyft och håll kota L1 med en Adson pincett. Använd en dedikerad laminektomi pincett för att ta bort den dorsala portion av ryggkotan (ryggrad och lamell) och exponera ryggmärgen. Undvik att skada ryggmärgen.
- Överför musen på värmeplattan i stereotaxisk ram. Övervaka temperaturen av musen under den efterföljande operationen.
3. Injektion
- Fix kota L1 med V notch spikar. Spikarna skall stabilisera ryggraden så att ryggkotan inte rör sig under andning.
- Ta mikrosprutan närmare så att pipettspetsen är över laminektomistället. Sänk kolven tills du ser virussuspensionen lämnar pipetten. Ta bort droppen med en steril bomull spets.
- Placera pipettspetsen vid den rostrala-mesta delen av den exponerade ryggmärgen. Center pipetten ovanför bakre median sulcus, flytta sedan spetsen 500 nm i sidled. Sänk spetsen på ytan av sladden och punktera dura mater, eller om du arbetar med en unbeveled glaspipett, använd en fasad stålkanyl att punktera dura. Sänk spetsen på glaspipett 300 um in i ryggmärgen.
- Injicera 1 il virussuspension med en hastighet av 200 Nl / min.
- I slutet av injektionen, vänta minst 2 minuter innan sakta dra tillbaka pipetten.
- Upprepa steg från 3,3 till 3,5 vid den kaudala-mesta delen av den exponerade ryggmärgen för att uppnå fullständig fördelning av den virala vektorn i spinalsegment L4. De två injektionsställen är belägna rostral och kaudala av L4 segmentet för att undvika vävnadsskada i målregionen.
4. Sårtillslutning
- Släpp kota L1 från V notch klämmor och ta bort musen från stereotaktisk ram.
- Sutur fascia med 5,0 Vicryl. Den slutna fascia ger täckning för laminektomistället.
- Stäng huden med nylonsuturer eller kirurgiska klamrar.
5. Postoperativ vård
- Överför musen till en återhämtning bur med mjuk, nonparticular sängkläder. Placera den på tHan sidan för bekväm andning. Övervaka djuret tills den är helt vaken, ambulerande och startar dricka.
- Vi tillhandahåller postkirurgisk analgesi för 72 timmar med dagliga subkutana injektioner av karprofen (5,0 mg / kg).
- Övervaka postsurgical återhämtning genom daglig inspektion av de första 3 dagarna, sedan varannan dag eller 3 dagar per vecka tills experimentet är klar.
- Ta bort skinnet suturer eller häftklamrar 7 till 10 dagar efter operationen, när sårläkning är klar.
- Euthanize djuret efter fullbordande av försöket.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Framgångsrik transfektion ger robusta genuttryck i nervceller i den injicerade dorsala hornet (figur 1) och skonar dorsalhorn den kontralaterala sidan, den ventrala horn och dorsalrotsganglier.
Figur 1. Transfektion av dorsala horn neuroner. (A) Uttryck av den fluorescerande reporter EGFP (grön) i den vänstra dorsala hornet av L4 ryggmärgen, två veckor efter den stereotaxiska injektionen av rAAV-EGFP (serotyp AAV2 / 8, 10 9 genomkopior / il). Neuroner immunofärgades för neuronal kärnor protein (NeuN, röd). Pilar pekar på spridda transfekterade gliaceller i den dorsala kolumnen. Skala bar, 150 nm. (B) Cirka 80% av nervceller i den mediala dorsala hornet var smittade. Skalstock, 20 um. En monoklonal antikropp mot NeuN (EMD Millipore) användes vid en utspädning av 1:2,000 för immunfärgning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Stereotaktisk vektor injektion tillåter inriktning ryggmärgen nervceller för applikationer såsom neuronala nätverk kartläggning baserad på transsynaptisk virus sprids 6,7 eller optogenetic dissektion 8, axon vägledning under regenerering från skada 9,10 eller genterapi för förebyggande eller behandling av neurodegenerering 11, 12. Virala vektorer har använts för genmanipulation i ryggmärgen för att studera somatosensoriska, motor och autonoma vägar 9,10,13-15. Musen är modellorganism mest används i studier med stereotaktisk injektion av en viral vektor in i hjärnan eller ryggmärgen, men tekniken har använts i andra arter, inklusive icke-humana primater 16.
Stereotaktisk vektor injektion i ryggmärgen hos möss är säkra, det kirurgiska ingreppet som beskrivs här kräver en enda laminektomi vid injektionsstället så att djuret återhämtar utan instabilitethet i dess ryggrad rörelser. Injektion och långsam avlägsnande av kanylen är fullständig inom 10 minuter, varar hela förfarandet inklusive hudpreparat och sårtillslutning ungefär 40 minuter. Vi tillhandahåller postkirurgisk anestesi under 72 timmar med karprofen, en icke-steroida antiinflammatoriska analgetiska läkemedel.
För att minimera vävnadsskada, använder vi drog glas kanyler med en spets diameter på 40 nm. En skarp avfasad kanylspetsen underlättar insättning i ryggmärgen, vilket motiverar investeringen i en mikropipett kvarn. Användning av en slipmaskin medger också bibehålla en konsekvent fasvinkel i varje experiment, minskar variation av injektion resultaten. Vi föredrar automatiserad styrning av injektionen hastighet över manuell dispens 17 för en jämn fördelning av viruspartikeln suspensionen i dorsala hornet och för att minska risken för en injektion fel. Lika kritisk är en långsam extraktion av kanylen, som bör initieras 2-5 min efter avslutad injectipå att undvika att dra virussuspension tillbaka och orsakar en extraspinal spill.
Omfattning och distribution av den intraspinala transfektionen beror på den injicerade dosen partikeln och inneboende egenskaper hos den virala vektorn, såsom serotyp och infektion effektivitet. Den optimala spädningen partikel måste bestämmas empiriskt för varje virus och serotyp och kan variera mellan olika satser av samma virus. Effekten av både infektion och DNA-transduktion kan också variera beroende på målgruppen av neuroner 18,19. AAV uppnår genöverföring i nervceller utan patogena och minimala immun biverkningar 20. I vår erfarenhet är infektion av dorsala horn neuron komplett inom 1-2 veckor och stabila. Vi har observerat mindre mikrogliaceller svar på injektionsstället men dessa lösas inom en vecka.
Vi rekommenderar jämföra olika serotyper av vektorer som uttrycker en reportergen såsom EGFP till evaluate transfektion priser, bestämma tidsintervallen mellan injektion och stabil transfektion och fastställa om infektionen är begränsad till nervceller. Specificitet beror på cellen tropism av vektorn, den transfekterade genen och dess promotor. Utredarna studerar somatosensoriska vägar bör också undersöka dorsala neuroner rotganglion för en potentiell expression av reportergenen, som kan resultera från infektion av dessa neuroner vid deras centrala terminaler i det dorsala hornet eller från kontaminering av cerebrospinalvätska 19.
I USA, är användningen av virala vektorer för genmanipulation regleras av NIH riktlinjer för forskning som innefattar rekombinanta DNA-molekyler ( http://oba.od.nih.gov/rdna/nih_guidelines_oba.html ). Dessa riktlinjer ställer krav på utbildning av utredare, personligt skydd, virusvektor inneslutning, decontamination, omhändertagande av förorenade material såsom använda sprutor och kanyler, och djurhållning efter injektionen. Utredarna ska arbeta med sina lokala IACUC eller motsvarande organ för institutionell tillsyn för att fastställa de regler och förordningar som gäller för deras forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Vi tackar Bakhos A. Tannous, Ph.D., chef för vektor Utveckling och produktion i Centrum för neurovetenskap i Massachusetts General Hospital, Charlestown, Massachusetts, för att ge oss med rAAV-EGFP vektor, och John Whang för tekniskt stöd. Detta arbete stöddes av bidrag R01 NS050408 (till JS) från National Institute of neurologiska sjukdomar och stroke.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Spinal base plate | David Kopf Instruments | 912 | |
| Small animal stereotaxic instrument | David Kopf Instruments | 900 | |
| Mouse gas anesthesia head holder | David Kopf Instruments | 923-B | |
| Adjustable base mounts | David Kopf Instruments | 982 | |
| V notch spikes | David Kopf Instruments | 987 | |
| Small animal temperature control system | David Kopf Instruments | TCAT-2LV | |
| Adson forceps | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Laminectomy forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | |
| UltraMicroPump (one) with SYS-Micro4 Controller | World Precision Instruments | UMP3-1 | |
| Microsyringe, 65RN | Hamilton | 7633-01 | |
| RN compression fitting, 1 mm | Hamilton | 55750-01 | |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Microgrinder | Narishige | EG-44 |
References
- Lewandoski, M. Conditional control of gene expression in the mouse. Nature Reviews Genetics. 2, 743-755 (2001).
- Couto, L. B., High, K. A. Viral vector-mediated RNA interference. Curr. Opin. Pharmacol. 10, 534-542 (2010).
- Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. Genetic dissection of neural circuits. Neuron. 57, 634-660 (2008).
- Davidson, B. L., Breakefield, X. O. Viral vectors for gene delivery to the nervous system. Nature Reviews Neuroscience. 4, 353-364 (2003).
- Todd, A. J. Neuronal circuitry for pain processing in the dorsal horn. Nature Reviews Neuroscience. 11, 823-836 (2010).
- Wall, N. R., Wickersham, I. R., Cetin, A., De La Parra, M., Callaway, E. M. Monosynaptic circuit tracing in vivo through Cre-dependent targeting and complementation of modified rabies virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 21848-21853 (2010).
- Lo, L., Anderson, D. J. A Cre-dependent, anterograde transsynaptic viral tracer for mapping output pathways of genetically marked neurons. Neuron. 72, 938-950 (2011).
- Zhao, S., et al. Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nature Methods. 8, 745-752 (2011).
- Tang, X. Q., Heron, P., Mashburn, C., Smith, G. M. Targeting sensory axon regeneration in adult spinal cord. J. Neurosci. 27, 6068-6078 (2007).
- Cameron, A. A., Smith, G. M., Randall, D. C., Brown, D. R., Rabchevsky, A. G. Genetic manipulation of intraspinal plasticity after spinal cord injury alters the severity of autonomic dysreflexia. J. Neurosci. 26, 2923-2932 (2006).
- Passini, M. A., et al. CNS-targeted gene therapy improves survival and motor function in a mouse model of spinal muscular atrophy. The Journal of Clinical Investigation. 120, 1253-1264 (2010).
- Lutz, C. M., et al. Postsymptomatic restoration of SMN rescues the disease phenotype in a mouse model of severe spinal muscular atrophy. The Journal of Clinical Investigation. 121, 3029-3041 (2011).
- Chen, S. L., et al. dsAAV type 2-mediated gene transfer of MORS196A-EGFP into spinal cord as a pain management paradigm. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 20096-20101 (2007).
- South, S. M., et al. A conditional deletion of the NR1 subunit of the NMDA receptor in adult spinal cord dorsal horn reduces NMDA currents and injury-induced pain. J. Neurosci. 23, 5031-5040 (2003).
- Tappe, A., et al. Synaptic scaffolding protein Homer1a protects against chronic inflammatory pain. Nat. Med. 12, 677-681 (2006).
- Colle, M. A., et al. Efficient intracerebral delivery of AAV5 vector encoding human ARSA in non-human primate. Human Molecular Genetics. 19, 147-158 (2010).
- Carbajal, K. S., Weinger, J. G., Whitman, L. M., Schaumburg, C. S., Lane, T. E. Surgical Transplantation of Mouse Neural Stem Cells into the Spinal Cords of Mice Infected with Neurotropic Mouse Hepatitis Virus. J. Vis. Exp. (53), e2834 (2011).
- Snyder, B. R., et al. Comparison of adeno-associated viral vector serotypes for spinal cord and motor neuron gene delivery. Hum. Gene Ther. 22, 1129-1135 (2011).
- Towne, C., Pertin, M., Beggah, A. T., Aebischer, P., Decosterd, I. Recombinant adeno-associated virus serotype 6 (rAAV2/6)-mediated gene transfer to nociceptive neurons through different routes of delivery. Mol. Pain. 5, 52 (2009).
- Kaplitt, M. G., et al. Long-term gene expression and phenotypic correction using adeno-associated virus vectors in the mammalian. 8, 148-154 (1994).
