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Biology

धनायनित Liposomes के माध्यम से एक विशिष्ट siRNA के दोहराया डिलिवरी द्वारा माउस फेफड़े में Intersectin-1s के लंबे समय तक मुंह बंद. इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा पछाड़ना प्रभाव का मूल्यांकन

Published: June 21, 2013 doi: 10.3791/50316
Automatic Translation
*1, *1,2, 1,2
1Department of Pharmacology, Rush University, 2Pulmonary and Critical Care Department, Rush University
* These authors contributed equally

Summary

चूहों में cationic liposomes/siRNA/ITSN-1s परिसरों, 24 दिनों के लिए हर 72 घंटे के दोहराया रेट्रो कक्षीय इंजेक्शन, कुशलता 75% से ITSN-1s mRNA और प्रोटीन अभिव्यक्ति को कम करने के लिए माउस फेफड़ों microvasculature को siRNA द्वैध देने. इस तकनीक में एक पशु मॉडल में अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है, कोई प्रतिकूल असर पड़ता है और मौत से बचा जाता है.

Abstract

पिछले अध्ययनों ITSN-1s (केडी ITSN), फेफड़े संवहनी पारगम्यता और endothelial कोशिकाओं (ईसीएस) अस्तित्व, प्रेरित apoptotic कोशिका मृत्यु, ITSN-1s लंबे समय तक साथ एक सेल संस्कृति प्रणाली के विकास में एक प्रमुख बाधा को विनियमित करने में शामिल एक endocytic प्रोटीन की कि पछाड़ना पता चला निषेध 1. वाहक के रूप में धनायनित लाइपोसोम का उपयोग करना, हम ITSN -1 जीन (siRNA ITSN) को लक्षित siRNA के प्रणालीगत प्रशासन द्वारा माउस फेफड़ों में ITSN-1s जीन का मुंह बंद करने का पता लगाया. 2 निर्माण करने के लिए, दोहराया खुराक के साथ सुरक्षित nonimmunogenic, nontoxic है, और आसान: cationic liposomes siRNA वितरण के लिए कई लाभ प्रदान करते हैं. Liposomes प्रदर्शन और जैविक गतिविधि एक कोलेस्ट्रॉल और डाइमिथाइल dioctadecyl अमोनियम ब्रोमाइड संयोजन का उपयोग करके अपने आकार, प्रभारी, लिपिड रचना, स्थिरता, खुराक और प्रशासन 3 के मार्ग यहाँ, कुशल और प्राप्त किया गया है माउस फेफड़ों में विशिष्ट केडी ITSN पर निर्भर करते हैं. नसों में प्रसवsiRNA के ITSN की / धनायनित liposome परिसरों क्षणिक अतिरिक्त 3 दिनों के बाद बरामद किया जो दिन 3 पर माउस फेफड़ों में ITSN-1s प्रोटीन और mRNA, नीचे गिरा दिया. एक repeatable सुरक्षित वाहक के रूप में धनायनित लाइपोसोम का लाभ उठाते हुए, अध्ययन के 24 दिनों के लिए बढ़ा दी. इस प्रकार, हौसले से उत्पन्न परिसरों के साथ रेट्रो कक्षीय उपचार अध्ययन 4 भर में निरंतर केडी ITSN उत्प्रेरण, हर 3 दिन दिलाई. कई बार अंक के बाद siRNA के ITSN में एकत्र माउस ऊतकों फेफड़ों endothelium में, पुरानी केडी ITSN के प्रभाव का मूल्यांकन करने के इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (ईएम) विश्लेषण के अधीन थे. उच्च संकल्प ईएम इमेजिंग हमें फेफड़े संवहनी बिस्तर में KDITSN की वजह से morphological परिवर्तन का मूल्यांकन करने की अनुमति प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा विशेषताओं गैर detectable, (endothelial बाधा यानी विघटन, caveolae की संख्या और वैकल्पिक परिवहन रास्ते की upregulation कमी आई). कुल मिलाकर इन निष्कर्षों को एक महत्वपूर्ण स्थापितईसीएस समारोह और फेफड़ों homeostasis में ITSN-1s के उग्रवादी भूमिका, विवो में siRNA-liposomes के वितरण की प्रभावशीलता को चित्रित करते हुए.

Introduction

नंगे siRNA में, कोशिका झिल्ली घुसना नहीं कर सकते हैं नकारात्मक आरोप लगाया जा रहा है, और यह रक्त में एंजाइमों, ऊतकों और कोशिकाओं द्वारा आसानी से अपमानित है. यहां तक कि स्थिरता में सुधार करने के लिए हाल ही में संरचनात्मक संशोधनों के साथ प्रशासन के बाद लक्ष्य साइट में siRNA संचय बेहद कम है और एक कुशल इंट्रासेल्युलर वाहन 5 की आवश्यकता है. Cationic liposomes encapsulating और एंजाइमी गिरावट 6 से न्यूक्लिक एसिड की रक्षा के द्वारा कोशिकाओं में डीएनए / आरएनए के बड़े टुकड़े हस्तांतरण करने की क्षमता के साथ सुरक्षित न्यूक्लिक एसिड वाहक के रूप में उभरा. इसके अलावा, cationic liposomes अनायास इस प्रकार की कोशिकाओं के लिए 2 जीन स्थानांतरण को बढ़ावा देने, डीएनए / आरएनए के साथ बातचीत. अभी हाल ही में liposomes के टीके और कम आणविक वजन दवाओं 7 वितरित करने के लिए लागू किया गया है. प्लाज्मिड microRNA-7-व्यक्त की liposomal वितरण फेफड़ों के कैंसर की कोशिकाओं 8 में epidermal वृद्धि कारक रिसेप्टर tyrosine kinase अवरोध के प्रतिरोध पर काबू. लक्ष्य करते समयपरिसरों endothelial बाधा पार और interstitium 9 में बहना की संभावना नहीं है क्योंकि संवहनी endothelium, नसों में प्रसव के लिए आवश्यक है. अन्य अंगों की तुलना करके, फेफड़ों की microvasculature से ईसीएस सबसे बड़ी तेज है और उत्सुकतापूर्वक लिम्फ नोड्स और Peyer पैच 9 द्वारा पीछा धनायनित liposome और डीएनए / आरएनए परिसरों, भली. रेट्रो कक्षीय या पूंछ नस इंजेक्शन के माध्यम से siRNA के कृंतक मॉडल में नसों में प्रसव भी इस तरह के 50 मिलीग्राम / किग्रा 10 के रूप में उच्च सांद्रता में हानिरहित साबित किया गया है. प्रकाशित साहित्य में cationic liposomes की रचना लिपिड तैयार करने और उनके equimolar अनुपात 11, 12 के आधार पर अलग है. , टीके या विरोधी ट्यूमर उपचार के 13-15 का वितरण प्रोटीन की down-regulation/over-expression को लक्षित किया जाए, vivo में जीन डिलीवरी के लिए cationic liposomes का उपयोग कर संभावित अनुप्रयोगों की एक विस्तृत सरणी है. याद करने के लिए महत्वपूर्णडीएनए / आरएनए सेलुलर झिल्ली बातचीत की दक्षता उत्पन्न परिसरों और झिल्ली लिपिड के बीच युग्मन के आकार के द्वारा नियंत्रित किया जाता है. यह लक्षित सेलुलर झिल्ली प्रोफाइल को लिपिड संरचना सिलाई एक विशेष सेल प्रकार 6 में अभिकर्मक की उच्च दर में लाभकारी और परिणाम हो सकता है.

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Protocol

1. Cationic Liposomes तैयारी

  1. Lipososmes तैयारी के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए एक साफ दौर नीचे कुप्पी आटोक्लेव.
  2. शेयर समाधान तैयार:
    1. - एक छोटे से कांच की बोतल का उपयोग कर 10 मिलीलीटर क्लोरोफॉर्म में डाइमिथाइल dioctadecyl अमोनियम ब्रोमाइड (दोआब) के 200 मिलीग्राम भंग.
    2. - एक छोटे से कांच की बोतल का उपयोग कर 10 मिलीलीटर क्लोरोफॉर्म में कोलेस्ट्रॉल की 200 मिलीग्राम भंग.
    3. - तैयार है और 100 आरएनए की मिलीग्राम / डीएनए ase मुक्त आसुत जल में 5% ग्लूकोज बाँझ आटोक्लेव.
  3. क्लोरोफॉर्म के साथ दौर नीचे फ्लास्क कुल्ला. फ्लास्क, चक्कर आने के लिए 5-10 मिलीलीटर जोड़ें, और यह कुछ ही मिनट के लिए बैठते हैं. सभी समय पर एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर कुप्पी रखें. कुप्पी से क्लोरोफॉर्म खाली.
  4. Liposomes की तैयारी:
    1. - दौर नीचे फ्लास्क दोआब शेयर समाधान के 315 μl जोड़ें.
    2. - कुप्पी कोलेस्ट्रॉल शेयर समाधान के 200 μl जोड़ें.
    3. - एक कुप्पी को क्लोरोफॉर्म की 9.5 मिलीलीटर जोड़ेंएन डी चक्कर आने से मिश्रण.
  5. 37 में rotavapor सेट डिग्री सेल्सियस, 100 प्रति मिनट rotations (आरपीएम) या अधिक (100-120 आरपीएम). rotavapor ठीक से जुड़ी एक चूषण ट्यूब के साथ एक पानी पंप वैक्यूम नियंत्रण को जोड़ा जाना चाहिए.
  6. आर्गन गैस टैंक और rotavapor जुड़ें.
  7. Rotavapor को कुप्पी देते हैं और नहाने के पानी में इसे कम से पहले इष्टतम सेटिंग्स समायोजित. यह वामावर्त बदल कर पूरी तरह से आर्गन के लिए पहली वाल्व खुला. हमेशा पहले इस वाल्व को खोलने और बंद करें. दूसरा वाल्व फ्लास्क में उड़ाने आर्गन दबाव को नियंत्रित करता है. दबाव हमेशा विनम्र होना चाहिए.
  8. पूरी तरह से जलमग्न हुए बिना पानी छूने और गति पर बारी करने के लिए कुप्पी के लिए पर्याप्त है, नहाने के पानी में rotavapor लोअर.
  9. 10 मिनट के बारे में, सभी क्लोरोफॉर्म evaporates जब तक प्रतीक्षा करें. फिर मशीन बंद करो.
  10. Rotavapor गति और आर्गन टैंक वाल्व बंद करें. अब कुप्पी हटाया जाना चाहिए.
  11. वें से 5% ग्लूकोज के 2 मिलीलीटर जोड़ेंई कुप्पी लिपिड भंग करने के लिए.
  12. अच्छी तरह से सभी लिपिड भंग करने के लिए 1 मिलीलीटर विंदुक टिप का उपयोग कर कुप्पी के नीचे खरोंच. यदि आवश्यक हो तो scratching के बाद, एक दूसरे के साथ टिप, 1 मिलीलीटर सिरे से फ्लास्क में किसी भी शेष लिपिड हटा दें.
  13. धीरे धीरे (15 आरपीएम) कुप्पी vortexing जबकि 42 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में प्राप्त समाधान सेते हैं.
  14. ठंडे पानी के साथ sonicator वैट भरें. अभी मुश्किल से पानी छू तक आयोजित फ्लास्क और नीचे के साथ कम से कम 20-30 मिनट के लिए समाधान Sonicate.
  15. पानी में डूबे दौर नीचे, इस समय के साथ, शून्य की गति से 42 पर 20 मिनट डिग्री सेल्सियस, के लिए rotavapor का पानी स्नान में कुप्पी गरम करें.
  16. एक 0.47 माइक्रोन और बाद में, 0.22 माइक्रोन सिरिंज फिल्टर के माध्यम से liposomes फ़िल्टर.
  17. एक छोटे extruder उपयोग, unilamellar liposome vesicles के एक समरूप जनसंख्या उत्पन्न करने के लिए एक 50 एनएम झिल्ली के माध्यम से liposomes फिल्टर.
  18. एक Eppendorf ट्यूब liposomes के स्थानांतरण और बर्फ पर जगह है.

2. Liposomes तैयार: siRNA की ITSN -1 परिसर

  1. 2 ग्राम / μl के अंतिम एकाग्रता के लिए 20 मिमी HEPES और 150mm सोडियम क्लोराइड, 7.4 पीएच, जिसमें siRNA के बफर में पर लक्ष्य माउस siRNA के ITSN Resuspend. मिश्रण से पहले यह बर्फ पर रखें.
  2. 2 ग्राम शाही सेना (या 400 nmol liposomes: 100 ग्राम siRNA के ITSN) 8 nmol liposomes की एक अनुपात में siRNA ITSN परिसरों: liposomes तैयार. वर्तमान अध्ययन में, हम एक शाही सेना / डीएनए ase मुक्त Eppendorf ट्यूब का उपयोग कर हौसले से तैयार liposomes की 100 μl शेयर समाधान (50 माइक्रोन) से siRNA के ITSN के 50 μl गयी. मिश्रण के 150 μl की एक अधिकतम एक समय में माउस में द्विपक्षीय और रेट्रो कक्षीय इंजेक्शन हो सकता है क्योंकि siRNA के ITSN की एकाग्रता बहुत महत्वपूर्ण है कि ध्यान दें.
  3. चूहों इंजेक्षन करने के लिए इंतज़ार कर रही है, जबकि बर्फ पर मिश्रण रखें.

3. माउस रेट्रो कक्षीय नस इंजेक्शन (थैली के आंतरिक कोण)

jove_content "> सभी माउस प्रयोगों रश यूनिवर्सिटी संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति के दिशा निर्देशों के अनुसार अनुमोदित और प्रदर्शन किया गया.

  1. एक 50 मिलीग्राम / किग्रा शरीर के वजन ketamine और 5 मिलीग्राम / किग्रा शरीर के वजन xylazine (व्यावसायिक रूप से उपलब्ध मिश्रण) का अंतर peritoneal इंजेक्शन द्वारा माउस anesthetize. पशु वजन और उम्र पर निर्भर करता है, निश्चेतक मात्रा और एकाग्रता समायोजित. अध्ययन चूहों में इस्तेमाल चूहों 6-8 सप्ताह पुराने CD1 नर चूहों, कर रहे हैं और 25 ग्राम के आसपास का वजन. सीरिंज सुई जुड़ी साथ टुबरकुलीन 1 मिलीलीटर प्रकार के होते हैं.
  2. एक हाथ से माउस कान पकड़ और आंख की आंतरिक कोण का पर्दाफाश करने के लिए एक पक्ष पर माउस नीचे बारी. तह semilunaris को औसत दर्जे का निशाना लगाओ, नेत्रगोलक छूने से बचें.
  3. सभी तीन कुल्हाड़ियों में एक 45 डिग्री के कोण पर मिश्रण युक्त सिरिंज पकड़े आंख की अश्रु बीजचोलक दृष्टिकोण.
  4. धीरे धीरे मिश्रण इंजेक्षन और इंजेक्शन की ओर से ठीक करने के लिए माउस करते हैं. यदि एक बड़े तरलसुई प्रविष्टि जगह पर छोटी बूंद रूपों, सिरिंज में वापस सुई, सक्शन छोटी बूंद वापस लेना और फिर कोशिश करें. दोहराया इंजेक्शन सबसे अच्छा सही वसूली की अनुमति देने के लिए, आँखों बारी द्वारा किया जाता है. अनिश्चित हैं, तो इस तकनीक को नीले रंग की डाई (50 μl, मेथनॉल में 0.5% क्रिस्टल वायलेट) इंजेक्शन लगाने और नीले वाहिका निरीक्षण करने के लिए माउस फेफड़ों उजागर द्वारा जाँच की जा सकती.
  5. इस अध्ययन में चूहों मौत या प्रतिकूल प्रभाव के बिना 3 सप्ताह के लिए हर 3 दिन में इंजेक्शन थे.

4. बायोकेमिकल अध्ययन के लिए माउस फेफड़े छिड़काव और ऊतक संग्रह

  1. 1.5 मिलीग्राम / मिनट पर चलने के लिए क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप सेट.
  2. वेंटीलेटर, ऑपरेटिंग मेज, उपकरणों, बाँझ कपास swabs, क्ष टिप्स, तार, बीकर, आसुत जल, हांक संतुलित नमक, ट्रेसर: स्थापित करने को तैयार है.
  3. संवेदनाहारी मिश्रण (100 मिलीग्राम / किग्रा शरीर के वजन ketamine और 10 मिलीग्राम / किग्रा शरीर के वजन xylazine) की intraperitoneal इंजेक्शन द्वारा माउस anesthetize. गर्दन स्तर पर, लार ग्रंथियों को हटाने और ट्रेकिआ बेनकाब.
  4. Laparotomy, आबकारी डायाफ्राम के साथ प्रारंभ करें, और फेफड़ों और दिल उजागर thoracotomy के साथ पालन करें.
  5. थाइमस निकालें.
  6. बेहतर सटीकता के लिए प्रकाश माइक्रोस्कोपी का प्रयोग, पल्मोनरी धमनी कैथीटेराइज़.
  7. ट्रेकियोस्टोमी करो और tracheostoma का उपयोग कर माउस नली लगाना. 150 स्ट्रोक / मिनट और 150 μl के स्ट्रोक मात्रा की दर को वेंटीलेटर सेट करें.
  8. दुकान के रूप में, बाएं आलिंद खुला.
  9. क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप और हांक समाधान का उपयोग कर, 5 मिनट के लिए रक्त के मुक्त माउस फेफड़ों वाहिका छिड़कना 37 पर गरम डिग्री सेल्सियस
  10. एक ही प्रवाह दर पर अतिरिक्त 10 मिनट के लिए ट्रेसर (8 एनएम सोने एल्बुमिन 16) छिड़कना.
  11. हांक समाधान के साथ 5 मिनट फेफड़ों के छिड़काव से अनबाउंड ट्रेसर फ्लश.
  12. 0.1 पाइप में 10 मिनट के 4% का छिड़काव (भार / खंड) formaldehyde, 2.5% glutaraldehyde, और 1% tannic एसिड से फेफड़ों के सीटू निर्धारण में साथ पालन करेंबफर, 7.2 पीएच.
  13. फेफड़ों लीजिए, अत्यधिक ऊतकों को हटाने के छोटे ब्लॉकों (3/3 मिमी) में कटौती, और लगानेवाला मिश्रण के 2 मिलीलीटर युक्त एक लेबल जगमगाहट शीशी में उन्हें जगह है.

चूहों की प्रक्रिया के दौरान पूरी तरह से anesthetized समाप्त हो जाएगा.

5. ईएम के लिए माउस फेफड़े ऊतक प्रसंस्करण

  1. शेयर समाधान तैयार: 1% Palade Oso 4, Veronal एसीटेट, और Kellenberger बफर.
    1. - 1% Palade-Oso 4 बफर होता है: 1 मिलीलीटर एसीटेट Veronal शेयर, 1.25 मिलीग्राम 4% Oso 4, ऊपर अंतिम मात्रा के 5 मिलीलीटर 1 0.1 मिलीलीटर एन हाइड्रोक्लोरिक एसिड, और आसुत जल.
    2. - एसीटेट Veronal शेयर समाधान 1.15 ग्राम सोडियम एसीटेट andydrous और आसुत पानी की 100 मिलीलीटर में barbital 2.94 ग्राम भंग करके प्राप्त की है.
    3. -Kellenberger समाधान एसीटेट Veronal शेयर के 2 मिलीग्राम, 0.1 एन हाइड्रोक्लोरिक एसिड, 0.05 ग्राम uranyl एसीटेट के 2.8 मिलीलीटर, और 5.1 मिलीग्राम शामिलआसुत जल, पीएच = 6 की.
  2. संक्षेप में 0.1 एम सोडियम cacodylate बफर, = पीएच 7.4, 3 बार में फेफड़ों ब्लॉक धो लें.
  3. कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए 0.1 पाइप बफर, 7.2 पीएच, में 4% (भार / खंड) फॉर्मेल्डीहाइड में नमूनों फिक्स, 2.5% glutaraldehyde,.
  4. अंधेरे में, बर्फ पर, हुड में 1 घंटे के लिए 1% Palade-आज़मियम के साथ के बाद तय कर लो.
  5. Kellenberger बफर के साथ एक बार कुल्ला.
  6. कमरे के तापमान पर, रात भर के लिए 2 घंटे के लिए Kellenberger बफर में नमूने सेते हैं.
  7. 50% इथेनॉल में एक बार कुल्ला.
  8. 70%, 95%, तो 2 एक्स 15 मिनट 100% इथेनॉल: इथेनॉल की वर्गीकृत श्रृंखला, 5 मिनट / प्रत्येक के साथ निर्जलीकरण.
  9. 100% propylene ऑक्साइड, 2 एक्स 15 मिनट के लिए स्विच.
  10. Propylene ऑक्साइड निकालें और कमरे के तापमान पर, एक पहिया पर घूर्णन, रातोंरात सेते हैं, 50% propylene ऑक्साइड और 50% EPON 812 का एक मिश्रण जोड़ें.
  11. अगली सुबह, मिश्रण को दूर करने और कम से कम पहिया पर 4-5 घंटे के लिए ताजा EPON 812, जोड़ें.
  12. भरी दोगुनी पतला नए साँचे, का प्रयोगताजा 100% EPON 812 से आधे रास्ते, चयनित नमूनों जोड़ने के लिए और किनारों के लिए उन्हें जगह है.
  13. ° सी 60 पर मशीन सेट करने के लिए नए नए साँचे ले जाएँ और उन्हें 48-72 घंटे के लिए इलाज करते हैं.
  14. Polymerized, जब sectioned (मोटी 60-70 एनएम) पतली होने के लिए ब्लॉकों भेजें.

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Representative Results

ITSN-1s प्रोटीन और mRNA स्तर वेस्टर्न ब्लॉट और 4 में के रूप में पारंपरिक और मात्रात्मक पीसीआर द्वारा siRNA के ITSN प्रसव के बाद कई बार बिंदुओं पर नजर रखी गई. SiRNA के ITSN का इलाज माउस फेफड़ों में ITSN-1s प्रोटीन और mRNA स्तर 21 दिनों के लिए ITSN-1s की निरंतर पछाड़ना दौरान नियंत्रण करने के लिए संदर्भ से 75% के बारे में कम थे. ITSN-1s के बिना, dynamin-2, प्लाज्मा झिल्ली से caveolae की टुकड़ी में ITSN-1s और आवश्यक खिलाड़ी की एक प्रमुख बातचीत साथी कुशलतापूर्वक endocytic साइट के लिए भर्ती नहीं कर रहा है और प्लाज्मा झिल्ली और मुक्त कोष्ठकी के गठन से इस तरह, caveolae टुकड़ी वाहक 1, 17 बाधित है. इसलिए, अप्रभावी झिल्ली विखंडन और मुक्त कोष्ठकी वाहक का बिगड़ा गठन कमी endocytosis और transendothelial परिवहन, अंतर - endothelial बाधा के विघटन और फेफड़े के edema (चित्रा 1) के कारण होता है. इसके अलावा, ITSN-1s के नीचे विनियमन ऊपर वैकल्पिक टीआर विनियमितansport कमी endocytosis के लिए क्षतिपूर्ति करने के रास्ते. हम सक्रिय रूप से तेज और परिवहन सोने एल्बुमिन में शामिल ठेठ caveolae (चित्रा -2) के साथ जुड़े हुए झिल्लीदार छल्ले (आंकड़े 2A और 2A1), pleomorphic नलिकाओं (चित्रा 2 बी), और endosomes बढ़े हुए देखा. एक महत्वपूर्ण खोज नियंत्रण करने के लिए संदर्भ से ITSN-1s कमी माउस फेफड़ों endothelium में caveolae संख्या में कमी, 1 टेबल है. धनायनित लाइपोसोम / siRNA के ITSN के दोहराया प्रसव द्वारा 24 दिनों के लिए लम्बे समय तक ITSN-1s निषेध आंशिक रूप से अंतर - endothelial बाधा अखंडता को बहाल करने से चूहों में फेफड़े के edema कम कर दिया. ईएम रूपात्मक पढ़ाई 8nm सोने एल्बुमिन ट्रेसर इस समय बिंदु पर, अंतर - endothelial जंक्शनों घुसना नहीं सकता था. इसके बजाय, वे संगम की luminal मांस या होली कम्यूनियन (ईसा के अंति भोज के पर्व में सम्मिलित होने) के अवसर पर पादरी के वेदी पर आते समय गाया जानेवाला गीत में छानने का काम अवशेष (चित्रा 3) का गठन किया. हालांकि, परिवाहकीय रिक्त स्थान कुछ फैलाव और हल्के से पता चलाशोफ, जंक्शनों कणों के इस आकार के लिए अभेद्य हैं, लेकिन अभी भी टपकाया कि सुझाव. इसके अलावा, वैकल्पिक endocytic रास्ते की रूपात्मक मध्यवर्ती सक्रिय और अधिक संख्या में मौजूद हैं. ज़ाहिर, morphometric विश्लेषण नियंत्रण, 1 टेबल की तुलना में जब सोने एल्बुमिन कणों द्वारा लेबल झिल्लीदार अंगूठी / नलिकाओं की संख्या ITSN-1s जीर्ण कमी माउस फेफड़ों endothelium में 14 गुना की वृद्धि हुई है कि संकेत दिया. Caveolae संख्या आंशिक रूप से नियंत्रण करने के लिए संदर्भ से, केवल 17.8% कमी बहाल है. इस प्रकार, हमारे परिणाम बताते हैं कि धनायनित लाइपोसोम / siRNA के ITSN परिसरों के दोहराया वितरण vivo में लंबी अवधि के प्रोटीन पछाड़ना के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए एक उपयुक्त पद्धति है प्रदर्शित करता है.

चित्रा 1
चित्रा 1. खुले interendothelial जंक्शनों दिखा प्रतिनिधि इलेक्ट्रॉन micrographs (IEJs) वें लेबलमें 8 एनएम सोने एल्बुमिन कणों. Arrowhead द्वारा उनकी लंबाई roughout एक और अंक IEJ की व्यापक खोलने का संकेत एक ही योजना में एक दूसरे के करीब स्थित तीन चार सोने एल्बुमिन कणों को, A1 बढ़ाया. (- तीर ए, बी) सोने के कण भी IEJs की abluminal बाहर निकलने के साथ जुड़े रहे हैं. तारक); भी caveolae और pericapillary अंतरिक्ष पीसी के फैलाव की सीमित संख्या नोट करें. बार्स: 200 एनएम (ए), 100 एनएम (बी, A1).

चित्रा 2
चित्रा 2. ITSN-1s अभिव्यक्ति की भारी गड़बड़ी pleomorphic endocytic / transcytotic मध्यवर्ती लाती है. प्रतिनिधि ईएम 8 एनएम सोने एल्बुमिन के साथ भरी हुई झिल्लीदार छल्ले की छवियों (ए, A1), ट्यूबलर तत्वों (बी, तीर) और बढ़े endosomes (सी, तीर), और caveolae की तरह के साथ जुड़ेआकारिकी. भी परिवाहकीय अंतरिक्ष (पी वी एस) के गंभीर फैलाव और प्रोटीन शोफ (ए) नोट. बार्स: 250 एनएम (ए), 200 एनएम (बी) 100 एनएम (A1, सी).

चित्रा 3
चित्रा 3. ITSN-1s अभिव्यक्ति की पुरानी निषेध आंशिक IEJ अखंडता को पुनर्स्थापित करता है. निस्पंदन अवशेष एक IEJ (नोक) की luminal मांस या होली कम्यूनियन (ईसा के अंति भोज के पर्व में सम्मिलित होने) के अवसर पर पादरी के वेदी पर आते समय गाया जानेवाला गीत में. पी वी एस के हल्के फैलाव (*) IEJs की leakiness पता चलता है. Multivesicular निकायों (mvb), प्लाज्मा झिल्ली के करीब निकटता में 8 एनएम सोने एल्बुमिन कणों द्वारा लेबल, उनके आंतरिक vesicles छोटे से कुछ है. बार: 100 एनएम.

तालिका 1. ITSN-1s अभिव्यक्ति की पुरानी निषेध वैकल्पिक endocytic / transcytotic रास्ते की सक्रियता का कारण बनता है और आंशिक रूप से caveolae संख्या पुनर्स्थापित करता है. * परिणाम 100 माइक्रोन चुनाव आयोग लंबाई प्रति सामान्यीकृत कर रहे हैं.

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Discussion

हम लंबे समय तक विशिष्ट siRNA / liposome परिसरों के दोहराया नसों में प्रशासन (लगातार 24 दिनों के लिए हर 72 घंटा,) द्वारा vivo में ITSN-1s के नीचे दस्तक के लिए इस पद्धति विकसित दूसरों 9 और हमें 1, 18 के द्वारा प्रकाशित पिछले अध्ययनों के आधार पर. इस प्रयोगात्मक दृष्टिकोण, कुशल है और सुरक्षित रूप से बार बार इस्तेमाल किया जा सकता है और यह आसानी से फेफड़ों अन्तःचूचुक और फेफड़े के homeostasis में ब्याज की किसी भी प्रोटीन एन्कोडिंग एक जीन की भागीदारी का अध्ययन करने के लिए बढ़ाया जा सकता है. दोहराया है siRNA / liposomes के वितरण के लिए हमारे द्वारा की स्थापना की प्रयोगात्मक शर्तों के तहत, चूहों विषाक्तता या प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के कोई संकेत नहीं के साथ सामान्य दिखाई दिया. SiRNA के ITSN / liposome परिसरों की प्रणालीगत प्रशासन कैंसर और अन्य चयापचय रोगों के रूप में संकेत के लिए सबसे नैदानिक ​​प्रासंगिक मार्ग है. फेफड़ों को siRNA / liposome नसों में इंजेक्शन परिसरों और इस कुशल केडी ITSN समझा जा सकता द्वारा सामना की पहली केशिका बिस्तर हैफेफड़ों में.

अध्ययन का एक सीमा धनायनित लाइपोसोम 2 के समय निर्भर निरंतर एकत्रीकरण है. इसे दूर करने के लिए, siRNA / liposome परिसरों पीढ़ी के बाद (कम से कम 2 घंटे) शीघ्र ही जन्म दिया है और उपयोग करने से पहले हर समय बर्फ पर संरक्षित किया गया. इस तरह हमारे अध्ययन में इस्तेमाल लोगों के रूप में परम्परागत धनायनित लाइपोसोम, (समास में) जाली का, endothelial प्रणाली द्वारा मंजूरी दे जाने का प्रस्ताव है. फ़ैगोसाइट द्वारा ऊपर से लेने की दर डे लिपोसोमल PEGylation द्वारा कम कर सकते हैं. एक और भी tissular वितरण जबकि polyethylene glycol (खूंटी) कोटिंग के साथ steric स्थिरीकरण liposomes 'संचलन समय prolongs. इन कारकों में एजेंटों के लंबे समय तक संचलन 12 वांछित है जहां विरोधी कैंसर उपचार में बहुत महत्वपूर्ण विशेषताओं बन जाते हैं.

ईएम प्रक्रिया के संबंध में, ऊतक की जांच की मात्रा मिनट व्यवस्थित और रूपात्मक व्यापक और मो द्वारा लिए मुआवजा दिया जाना चाहिएजब जरूरत rphometric विश्लेषण के रूप में अच्छी तरह से धारावाहिक वर्गों की परीक्षा,.

हमारी कार्यप्रणाली निरंतर वितरण और siRNA प्रभावकारिता के लिए खुराक अनुसूची का अनुकूलन, वहीं आगे की पढ़ाई सही लक्ष्य की उच्च क्षमता की पहचान पर और जोखिम / पैरामीटर शामिल लाभ का आकलन पर ध्यान केंद्रित करने की जरूरत है.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

यह काम सपा को स्वास्थ्य अनुदान R01HL089462 के राष्ट्रीय संस्थान द्वारा समर्थित किया गया था.

Materials

Transcytotic / endocytic संरचनाओं नियंत्रित करें ITSN-1s siRNA को, 72 घंटा ITSN-1s siRNA को, 24 घ
लुमेन * के लिए खुला caveolae 106.6 ± 9.5 50.46 ± 4.8 87.15 ± 5.9
Cytosol में जाहिरा तौर पर मुक्त caveolae 173.5 ± 12.0 77.41 ± 6.3 143.0 ± 9.5
कुल caveolae (luminal और cytosol में मुक्त) 280.1 ± 21.5 127.86 ± 11.1 230.14 ± 15.4
असामान्य endocytic संरचनाओं (बढ़े endosomes) 2.65 ± .34 11.29 ± 2.7 14.93 ± 3.8
Caveolae समूहों 3.95 ± .4 5.64 ± 1.6 11.3 ± 2.5
झिल्लीदार छल्ले 1.33 ± .04 9.47 ± 2.4 12.8 ± 2.8
नलिकाओं .88 ± .05 4.0 ± 1.3 18.84 ± 3.4
Name Company Catalog Number Comments
Dimethyl Dioctadecyl Ammonium Bromide (DOAB) Sigma-Aldrich D2779
LiposoFast stabilizer (mini-extruder) Avestin Inc. LF-STB
Polycarbonate membrane, 19 mm diameter, 50 nm pore Avestin Inc. LFM-50
Cholesterol Sigma-Aldrich C-8667
Chloroform Mallinckrodt Chemicals 4432-04
Hank's balanced salts Sigma-Aldrich H1387
Round-bottom flask Fisher Scientific FHB-275-030X
Mouse siRNAITSN - on target Dharmacon/ThermoScientific J-046912-11
Peristaltic pump Ismatec REGLO-CDF digital with RHOO pump head
Ventilator Hugo Sachs Electronik NA
Barbital Sigma-Aldrich B-0500
Uranyl acetate EM Sciences 22400
Epon812 EM Sciences Discontinued by the manufacturer
Propylene oxide EM Sciences 20400
Embedding molds EM Sciences 69923-05
Tannic acid EM Sciences 21710
8 nm gold-albumin tracer Prepared in the laboratory as in16
Comments
Equipped with 2 Avestin 1 ml gas-tight syringes (cat. # LF-1)
Pyrex, 100 ml
Modified siRNA, in vivo
Part of IDEX corp.
D-79232 March, Germany
Replaced with Embed812, cat. # 14120

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References

  1. Predescu, S. A., Predescu, D. N., Knezevic, I., Klein, I. K., Malik, A. B. Intersectin-1s regulates the mitochondrial apoptotic pathway in endothelial cells. J. Biol. Chem. 282 (282), 17166-17178 (2007).
  2. Uddin, S. Cationic lipids used in non-viral gene delivery systems. Biotechnology and Molecular Biology Review. 2 (2), 58-67 (2007).
  3. Barenholz, Y., et al. Influence of lipid composition on the thermotropic behavior and size distribution of mixed cationic liposomes. J. Colloid Interface Sci. (356), 46-53 (2011).
  4. Predescu, D. N., Neamu, R., Bardita, C., Wang, M., Predescu, S. A. Impaired caveolae function and upregulation of alternative endocytic pathways induced by experimental modulation of intersectin-1s expression in mouse lung endothelium. Biochem. Res. Int.. (2012), 672705 (2012).
  5. Higuchi, Y., Kawakami, S., Hashida, M. Strategies for in vivo delivery of siRNAs: recent progress. BioDrugs. 24 (24), 195-205 (2010).
  6. Caracciolo, G., Amenitsch, H. Cationic liposome/DNA complexes: from structure to interactions with cellular membranes. Eur. Biophys. J. , (2012).
  7. Barnier Quer, C., Elsharkawy, A., Romeijn, S., Kros, A., Jiskoot, W. Cationic liposomes as adjuvants for influenza hemagglutinin: more than charge alone. Eur. J. Pharm. Biopharm. 81 (81), 294-302 (2012).
  8. Rai, K., et al. Liposomal delivery of MicroRNA-7-expressing plasmid overcomes epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor-resistance in lung cancer cells. Mol. Cancer Ther. (10), 1720-1727 (2011).
  9. McLean, J. W., et al. Organ-specific endothelial cell uptake of cationic liposome-DNA complexes in mice. Am. J. Physiol. (273), H387-H404 (1997).
  10. Soutschek, J., et al. Therapeutic silencing of an endogenous gene by systemic administration of modified siRNAs. Nature. (432), 173-178 (2004).
  11. Barenholz, Y. Liposomes enhance bioremediation of oil-contaminated soil. J. Liposome Res. (13), 1-8 (2003).
  12. Zamboni, W. C. Liposomal, nanoparticle, and conjugated formulations of anticancer agents. Clin. Cancer Res. (11), 8230-8234 (2005).
  13. Newman, M. S., Colbern, G. T., Working, P. K., Engbers, C., Amantea, M. A. Comparative pharmacokinetics, tissue distribution, and therapeutic effectiveness of cisplatin encapsulated in long-circulating, pegylated liposomes (SPI-077) in tumor-bearing mice. Cancer Chemother Pharmacol. (43), 1-7 (1999).
  14. Martino, S., et al. Efficient siRNA delivery by the cationic liposome DOTAP in human hematopoietic stem cells differentiating into dendritic cells. J. Biomed. Biotechnol. (2009), 410260 (2009).
  15. Zhang, G., et al. A delivery system targeting bone formation surfaces to facilitate RNAi-based anabolic therapy. Nat. Med. 18 (18), 307-314 (2012).
  16. Predescu, D., Palade, G. E. Plasmalemmal vesicles represent the large pore system of continuous microvascular endothelium. Am. J. Physiol. (265), H725-H733 (1993).
  17. Koh, T. W., Verstreken, P., Bellen, H. J. Dap160/intersectin acts as a stabilizing scaffold required for synaptic development and vesicle endocytosis. Neuron. (43), 193-205 (2004).
  18. Miyawaki-Shimizu, K., et al. Lung Cell Mol. Physiol. (290), L405-L413 (2006).

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धनायनित Liposomes के माध्यम से एक विशिष्ट siRNA के दोहराया डिलिवरी द्वारा माउस फेफड़े में Intersectin-1s के लंबे समय तक मुंह बंद. इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा पछाड़ना प्रभाव का मूल्यांकन
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Bardita, C., Predescu, D., Predescu, S. Long-term Silencing of Intersectin-1s in Mouse Lungs by Repeated Delivery of a Specific siRNA via Cationic Liposomes. Evaluation of Knockdown Effects by Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (76), e50316, doi:10.3791/50316 (2013).

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