Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Långsiktig tysta Intersectin-1s i muslunga genom upprepad Leverans av en specifik siRNA via katjoniska liposomer. Utvärdering av knockdown Effekter med elektronmikroskopi

Published: June 21, 2013 doi: 10.3791/50316
Automatic Translation
*1, *1,2, 1,2
1Department of Pharmacology, Rush University, 2Pulmonary and Critical Care Department, Rush University
* These authors contributed equally

Summary

Upprepade retroorbital injektioner av katjoniska liposomes/siRNA/ITSN-1s komplex i möss, var 72 timmar för 24 dagar, effektivt leverera siRNA duplex till muslunga mikrovaskulaturen minska ITSN-1s mRNA och protein expression med 75%. Denna teknik är mycket reproducerbar i en djurmodell, har inga biverkningar och undviker dödsfall.

Abstract

Tidigare studier visade att knockdown av ITSN-1s (KD ITSN), en endocytiska protein som deltar i reglering av lunga vaskulär permeabilitet och endotelceller (EC) överlevnad, inducerad apoptotisk celldöd, ett stort hinder i utvecklingen av ett system för cellodling med förlängd ITSN-1s hämning 1. Använda katjoniska liposomer som bärare, utforskade vi tysta av ITSN-1s gen i mus lungorna genom systemisk administrering av siRNA riktade ITSN-1 genen (siRNA ITSN). Katjoniska liposomer erbjuder flera fördelar för siRNA delivery: säkra med upprepad dosering, icke-immunogen, giftfritt, och lätt att producera 2. Liposomer prestanda och biologisk aktivitet beroende på deras storlek, laddning, lipidsammansättning, stabilitet, dos och administreringsväg 3 Här, effektiv och specifik KD ITSN i muslunga har erhållits med hjälp av en kolesterol-och dimetyl dioktadecyl kombination ammoniumbromid. Intravenös leveransav siRNA ITSN / katjoniska liposomkomplex knackade tillfälligt ned ITSN-1s protein och mRNA i mus lungorna vid dag 3, som återhämtade sig efter ytterligare 3 dagar. Med utnyttjande av de katjoniska liposomer som ett repeterbart säker bärare, förlängdes studien för 24 dagar. Således var retroorbital behandling med nyligen genererade komplex administreras var 3: e dag, inducera ihållande KD ITSN hela studien 4. Musvävnader samlats vid flera tidpunkter efter siRNA ITSN utsattes för elektronmikroskopi (EM) analyser för att utvärdera effekterna av kronisk KD ITSN, i lung endotel. Högupplöst EM imaging tillät oss att utvärdera morfologiska förändringar orsakade av KDITSN i lungan vaskulära sängen (dvs avbrott i endothelial barriären, minskat antal caveolae och uppreglering av alternativa transportvägar), egenskaper icke detekterbar med ljusmikroskop. Sammantaget dessa rön etablerat en viktigtig roll ITSN-1s i EC-funktionen och lung homeostas, samtidigt illustrera effektiviteten av siRNA-liposomer leverans in vivo.

Introduction

Naked siRNA kan inte tränga igenom cellmembranet, varvid negativt laddade, och det är lätt bryts ned av enzymer i blod, vävnader och celler. Även med nyligen strukturella förändringar för att förbättra stabiliteten, är siRNA ackumulering vid målplatsen efter administrering extremt låg och kräver en effektiv intracellulär fordon 5. Katjoniska liposomer framkom som säkra nukleinsyror bärare med förmåga att överföra stora bitar av DNA / RNA in i celler genom att kapsla in och skydda nukleinsyror från enzymatisk nedbrytning 6. Även katjoniska liposomer interagerar spontant med DNA / RNA, vilket främjar genöverföring till cellerna 2. Mer nyligen liposomer har använts för att leverera vaccin och låg molekylvikt droger 7. Liposomal leverans av microRNA-7-uttryckande plasmid övervinner epidermal tillväxtfaktorreceptor tyrosinkinashämmare-motstånd i lungcancerceller 8. Vid inriktning påvaskulär endotel, är intravenös tillförsel viktigt eftersom komplexen är osannolikt att korsa endothelial barriären och extravasera in till interstitium 9. Genom jämförelse med andra organ, ECS från mikrovaskulaturen av lungan har störst upptag och avidly internalisera katjonisk liposom och DNA / RNA-komplex, följt av lymfkörtlar och Peyers plack 9. Intravenös tillförsel i gnagarmodeller av siRNA via retro-orbital eller svansvenen injektioner har visat ofarligt även i höga koncentrationer, t.ex. 50 mg / kg 10. I den publicerade litteraturen sammansättningen av katjoniska liposomer skiljer, baserat på lipider formulering och deras ekvimolärt förhållande 11, 12. Det finns ett brett spektrum av potentiella tillämpningar med katjoniska liposomer för genleverans in vivo, oavsett inriktning down-regulation/over-expression av proteinerna, leverans av vaccin eller anti-tumör terapier 13-15. Viktigt att komma ihågär att effektiviteten för DNA / RNA-cellulära membranet växelverkan regleras av formen koppling mellan genererade komplex och membranlipider. Detta tyder på att skräddarsy lipider kompositionen till de riktade cellulära membran profiler kan vara välgörande och resultera i höga hastigheter av transfektion i en speciell celltyp 6.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Ett. Katjoniska liposomer Förberedelse

  1. Autoklav en ren rundkolv som skall användas för lipososmes beredning.
  2. Bered stamlösningar:
    1. - Lös upp 200 mg dimetyl-dioktadecyl-ammoniumbromid (Doab) i 10 ml kloroform med användning av en liten glasflaska.
    2. - Lös 200 mg av kolesterol i 10 ml kloroform med en liten glasflaska.
    3. - Förbereda och autoklav för att sterilisera 5% glukos i 100 ml av RNA / DNA-as fritt destillerat vatten.
  3. Skölj rundkolven med kloroform. Tillsätt 5-10 ml till kolven, virvla runt, och låt det sitta i några minuter. Håll kolven täckt med aluminiumfolie vid alla tidpunkter. Töm kloroform från kolven.
  4. Framställning av liposomer:
    1. - Lägg 315 pl Doab stamlösning till den rundbottnade kolven.
    2. - Tillsätt 200 ^ il av kolesterol stamlösning till kolven.
    3. - Lägg 9,5 ml kloroform till kolvennd mix av virvel.
  5. Ställ in rotavapor vid 37 ° C, 100 varv per minut (rpm) eller mer (100-120 rpm). Den rotavapor ska anslutas till ett vatten-pump vakuum styrning med ett sugrör ordentligt fastsatt.
  6. Anslut argon gastank och rotavapor.
  7. Fäst kolven till rotavapor och justera de optimala inställningarna innan du sänker den i vattenbadet. Öppna först ventil för argon helt genom att vrida den moturs. Alltid öppna och stänga ventilen först. Den andra ventilen styr argontryck blåser in till kolven. Trycket bör alltid vara försiktig.
  8. Sänk rotavapor i vattenbadet, tillräckligt för kolven att röra vattnet utan att bli helt dränkt och slå på hastigheten.
  9. Vänta tills alla kloroform avdunstar, ca 10 min. Stoppa sedan maskinen.
  10. Stäng av rotavapor hastighet och argon ventiler tank. Nu kolven bör tas bort.
  11. Tillsätt 2 ml 5% glukos till the-kolv för att upplösa lipider.
  12. Skrapa på botten av kolven noggrant med 1 ml pipettspets att upplösa alla lipider. Efter repor, ta bort eventuella kvarvarande lipid från 1 ml spets i kolven, om nödvändigt, med en andra spets.
  13. Inkubera den erhållna lösningen i 42 ° C vattenbad under långsam virvling (15 rpm) kolven.
  14. Fyll sonicator karet med kallt vatten. Sonikera lösningen för minst 20-30 min med kolven hålls upp och ner bara knappt vidröra vattnet.
  15. Värm kolven i rotavapor s vattenbad under 20 minuter vid 42 ° C, vid noll hastighet, med rund botten nedsänkt i vatten, den här gången.
  16. Filtrera liposomerna genom en 0,47 mikron och därefter 0,22 mikron filter spruta.
  17. Använd en liten strängsprutmaskin, filtrera liposomerna genom ett 50 nm membran för att generera en homogen population av unilamellära liposomvesiklar.
  18. Överför liposomerna till ett Eppendorf-rör och placera den på is.

2. Förbered Liposomes: siRNA-ITSN-1-komplex

  1. Resuspendera på-target ITSN mus siRNA i siRNA-buffert innehållande 20 mM HEPES och 150 mM natriumklorid, pH 7,4, till en slutlig koncentration av 2 ug / ul. Håll det på is före blandning.
  2. Förbered liposomerna: siRNA ITSN komplex i förhållandet 8 nmol liposomer: 2 mikrogram RNA (eller 400 nmol liposomer: 100 mikrogram siRNA ITSN). I den aktuella studien, har vi lagt 50 pl siRNA ITSN från stamlösning (50 M) till 100 pl nylagade liposomer med en RNA / DNA-as free Eppendorf-rör. Observera att koncentrationen av siRNA ITSN är mycket viktigt eftersom maximalt 150 ul av blandningen kan vara bilateralt och retroorbital injicerade hos mus vid en tidpunkt.
  3. Låt blandningen på is i väntan på att injicera möss.

Tre. Mouse Retro-orbitalvenen Injection (inre vinkeln av ögonhålan)

jove_content "> Alla musexperiment godkändes och genomfördes i enlighet med riktlinjerna i Rush University Institutional Animal Care och användning kommittén.

  1. Bedöva musen genom intraperitoneal injektion av en 50 mg / kg kroppsvikt ketamin och 5 mg / kg kroppsvikt xylazin (kommersiellt tillgänglig blandning). Beroende på djurets vikt och ålder, justera anestetika volym och koncentration. De möss som användes i studien möss är CD1 hanmöss, 6-8 veckor gamla och väger runt 25 gram. Sprutorna är tuberkulin 1 ml typ med kanylen påsatt.
  2. Håll musöron med ena handen och vrid musen nedåt på en sida för att exponera den inre vinkeln av ögat. Sikta medial till plica semilunaris, undvik att röra vid ögongloben.
  3. Förflyttning till lakrimala KARBUNKEL i ögat hålla injektionssprutan innehållande blandningen vid en 45 graders vinkel i alla tre axlarna.
  4. Injicera långsamt blandningen och låt musen för att återhämta sig med den injicerade uppåt. Om en stor flytandedroppe bildas vid nålinförande plats, dra in nålen, sug tillbaka droppen i sprutan och försöka igen. Upprepade injektioner görs bäst genom att växla ögonen, för att möjliggöra perfekt återhämtning. Om du är osäker, kan denna teknik kontrolleras genom att injicera blått färgämne (50 pl, 0,5% kristallviolett i metanol) och exponera muslunga att observera blå kärlsystemet.
  5. Mössen i denna studie injicerades var 3: e dag i 3 veckor utan dödsfall eller biverkningar.

4. Mus Lungperfusion och Tissue Collection för biokemiska studier

  1. Ställ den peristaltiska pumpen för att köra på 1,5 ml / min.
  2. Förbered inställningen: ventilator, operationsbord, instrument, sterila kompresser bomull, q-tips, strängar, bägare, destillerat vatten, Hanks balanserade salt, spårämne.
  3. Bedöva musen genom intraperitoneal injektion av bedövningsmedlet blandningen (100 mg / kg kroppsvikt ketamin och 10 mg / kg kroppsvikt xylazin). På halsen nivå, ta bort spottkörtlarna och exponera luftstrupen.
  4. Börja med laparotomi, punktskatter membranet, och följ med torakotomi, utsätta lungorna och hjärtat.
  5. Ta bräss.
  6. Använda Ijusmikroskopi för bättre noggrannhet, kateterisera lungartären.
  7. Gör trakeostomi och intuberas musen använder trakeostomat. Ställ ventilatorn till en hastighet av 150 slag / min och slagvolym på 150 pl.
  8. Som utlopp, öppna vänster förmak.
  9. BEGJUTA vaskulaturen muslunga fri från blod under 5 min, med användning av den peristaltiska pumpen och Hanks lösning värmdes vid 37 ° C.
  10. BEGJUTA spårämnet (8 nm guld-albumin 16) för ytterligare 10 min vid samma flödeshastighet.
  11. Spola obundet spårämne vid 5 min lung perfusion med Hanks lösning.
  12. Följ med in situ fixering av lungorna av 10 min perfusion av 4% (vikt / volym) formaldehyd, 2,5% glutaraldehyd och 1% garvsyra i 0,1 PIPESbuffert, pH 7,2.
  13. Samla lungorna, ta bort den överdrivna vävnad, skär små block (3/3 mm), och placera dem i en märkt scintillationsflaska innehållande 2 ml fixativ blandning.

Mössen kommer att upphöra helt sövd under förfarandet.

Fem. Mus lungvävnad Processing för EM

  1. Bered stamlösningar: 1% Palade OSO4, acetat veronal och Kellenberger buffert.
    1. - 1% Palade-OSO4 ​​buffert innehåller: 1 ml acetat veronal lager, 1,25 ml 4% OSO4, 1 ml 0,1 N saltsyra, och destillerat vatten upp till 5 ml slutlig volym.
    2. - Acetat veronal lager lösning erhålles genom att lösa 1,15 g andydrous natriumacetat och 2,94 g barbital i 100 ml destillerat vatten.
    3. -Kellenberger lösning innehåller 2 ml acetat veronal lager, 2,8 ml 0,1 N saltsyra, 0,05 g uranylacetat, och 5,1 mldestillerat vatten, pH = 6.
  2. Tvätta lung block i 0,1 M natriumkakodylatbuffert, pH = 7,4, kortfattat tre gånger.
  3. Fixera exemplar i 4% (vikt / volym) formaldehyd, 2,5% glutaraldehyd i 0,1 PIPES-buffert, pH 7,2, under 1 timme, vid rumstemperatur.
  4. Post-fix med 1% Palade-Osmium under 1 timme i huven, på is, i mörkret.
  5. Skölj en gång med Kellenberger buffert.
  6. Inkubera proverna i Kellenberger buffert under 2 timmar till över natten i rumstemperatur.
  7. Skölj en gång i 50% etanol.
  8. Dehydrera med graderad serie av etanol, 5 min / st: 70%, 95%, därefter 2 x 15 min 100% etanol.
  9. Växla till 100% propylenoxid, 2 x 15 min.
  10. Avlägsna propylenoxid och lägga till en blandning av 50% propylenoxid och 50% Epon 812, inkubera över natten, som roterar på ett hjul, vid rumstemperatur.
  11. Nästa morgon, ta bort blandningen och tillsätt färsk Epon 812, åtminstone för 4-5 tim på hjulet.
  12. Använda fördubblats avsmalnande formar, fylldahalvvägs med färska 100% Epon 812, lägg till utvalda exemplar och placera dem på kanterna.
  13. Flytta formarna till inkubator inställd på 60 ° C och låt dem härda under 48-72 timmar.
  14. När polymeriseras, skicka blocken att vara smal (60-70 nm tjockt) snittades.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ITSN-1s protein och mRNA-nivåer övervakades vid flera tidpunkter efter siRNA ITSN leverans av Western blot och konventionella och kvantitativ PCR som i 4. ITSN-1s protein och mRNA-nivåer i siRNA ITSN-behandlade muslunga var ca 75% lägre i förhållande till kontroller under kontinuerlig knockdown av ITSN-1s i 21 dagar. Utan ITSN-1s, dynamin-2, är en viktig samverkande partner ITSN-1s och central aktör i lossnar caveolae från plasmamembranet inte effektivt rekryteras till endocytic platsen och därmed caveolae avskildhet från plasmamembranet och bildningen av fria vesikulär bärare störs 1, 17. Därför orsakade ineffektivt membran fission och försämrad bildning av fria vesikulära bärare bristfällig endocytos och transendoteliala transport, störningar av inter-endothelial barriären och lungödem (Figur 1). Dessutom, nedreglering av ITSN-1s regleras upp alternativa transport vägar att kompensera för bristande endocytos. Vi märkte membranösa ringar (figur 2A och 2A1), tubuli pleomorfa (Figur 2B) och förstorade endosomer sammansmälta med typiska caveolae (figur 2C) aktivt involverade i upptag och transport guld-albumin. En viktig slutsats är minskningen i caveolae nummer i ITSN-1s bristfällig muslunga endotel med hänvisning till kontroller, Tabell 1. Långvarig ITSN-1s inhibition i 24 dagar med upprepad tillförsel av katjoniska liposomer / siRNA ITSN minskade lungödem hos möss genom att delvis återställa inter-endothelial barriär integritet. EM morfologiska studier visade att 8nm guld-albumin spårämne inte kunde tränga igenom de inter-endothelial korsningar, vid denna tidpunkt. Istället bildade de filtrering rester i luminala Introit av korsningen (Figur 3). Dock visade perivaskulära utrymmen viss utvidgning och miltödem, vilket tyder på att korsningar är ogenomträngliga för den här storleken av partiklarna, men fortfarande läckande. Också, de morfologiska intermediärer av alternativa endocytiska vägar är aktiva och närvarande i högre siffror. Märkbart, uppgav de morfometriska analyser att antalet membranous ring / tubuli märkta med guld-albuminpartiklar ökade med 14 gånger i ITSN-1s kronisk brist muslunga endotel jämfört med kontroller, Tabell 1. Caveolae nummer är delvis återställd, endast 17,8% minskning, med hänvisning till kontroller. Således, våra resultat visar att upprepad tillförsel av katjoniska liposomer / siRNA komplex ITSN är en lämplig metod för att studera effekterna av långvarig protein knockdown in vivo.

Figur 1
Figur 1. Representativa elektronmikrofotografier visar öppna interendothelial korsningar (IEJs) märkt throughout sin längd med 8 nm guld-albuminpartiklar. Arrowhead i A och förstoras a1, pekar på tre till fyra guld-albuminpartiklar belägna nära varandra i samma planen, som indikerar den stora öppningen av IEJ. Guldpartiklar är också associerade med den abluminala avfarten IEJs (A, B - pilar). Notera också det begränsade antalet caveolae och utvidgning av pericapillary utrymme st, asterisker). Bars: 200 nm (A), 100 nm (B, a1).

Figur 2
Figur 2. Akut störning av ITSN-1s uttryck inducerar pleomorfa endocytiska / transcytotic intermediärer. Representant EM bilder av membranösa ringar (A, A1), rörformiga element (B, pilar) och utvidgade endosomer (C, pilspetsar), laddad med 8 nm guld-albumin och associerad med caveolae-liknandemorfologi. Notera även den svåra utvidgning av perivaskulär utrymmet (PVS) och det proteinhaltiga ödem (A). Bars: 250 nm (A), 200 nm (B) 100 nm (a1, C).

Figur 3
Figur 3. Kronisk hämning av ITSN-1s uttryck återställer delvis IEJ integritet. Filtrering rester i luminala Introit av en IEJ (pilspets). Mild dilatation (*) av PVS antyder leakiness av IEJs. Multivesikulära organ (MVB), i närheten av plasmamembranet har några av sina interna små blåsor, märkt med 8 nm guld albuminpartiklar. Bar: 100 nm.

Tabell 1. Kronisk hämning av ITSN-1s uttryck orsakar aktivering av alternativa endocytiska / transcytotic vägar och delvis återställer caveolae nummer. * Resultat normaliseras per 100 um EG längd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Baserat på tidigare studier som publicerats av andra 9 och oss 1, 18 vi utvecklat denna metod för långsiktig riva av ITSN-1s in vivo genom upprepad intravenös administrering (varje 72 timmar, för 24 dagar i följd) av specifika siRNA / liposomkomplex. Denna experimentella metod är effektiv, kan användas på ett säkert och upprepade gånger och det kan lätt utvidgas till att studera medverkan av en gen som kodar för något protein av intresse i lung endotel och pulmonell homeostas. Under de experimentella betingelser som inrättats av oss för upprepad siRNA / liposomer leverans, dök möss normal utan några tecken på toxicitet eller immunsvar. Systemisk administrering av siRNA ITSN / liposomkomplexen är den mest kliniskt relevant väg för indikationer som cancer och andra metabola sjukdomar. Lungan är den första kapillärbädd stött av siRNA / liposomkomplex injiceras intravenöst och detta kan förklara den effektiva KD ITSNi lungan.

En begränsning i studien är tidsberoende kontinuerlig aggregering av katjoniska liposomer 2. För att övervinna det, var siRNA / liposomkomplex levereras inom kort (mindre än 2 tim) efter generation och bevaras på is hela tiden före användning. Konventionella katjoniska liposomer, såsom de som används i vår studie föreslås skall godkännas av den retikuloendotelialsystemet. Graden av upp-ta av fagocyter kan de minskade med liposomal pegyleringen. Sterisk stabilisering med polyetylenglykol (PEG) beläggning förlänger liposomer 'cirkulationstid samtidigt ha en jämnare tissular fördelning. Dessa faktorer blir mycket viktiga egenskaper i cancerbehandlingar där långvarig cirkulation av kemoterapeutiska medel önskas 12.

I fråga om EM förfarandet, bör de små mängder vävnad undersökta kompenseras genom systematisk och omfattande morfologiska och morphometric analys samt genom undersökning av seriella sektioner, när det behövs.

Medan vår metodik optimerar doseringsschema för fördröjd leverans och siRNA effektivitet, krävs ytterligare studier för att fokusera på den högeffektiva identifiera de rätta målen och om bedömning av riskerna / fördelarna parametrar inblandade.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har ingenting att lämna ut.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av National Institute of Health bidrag R01HL089462 till SP.

Materials

Endocytic / transcytotic strukturer Kontroll ITSN-1s siRNA, 72 hr ITSN-1s siRNA, 24 d
Caveolae öppna för lumen * 106,6 ± 9,5 50,46 ± 4,8 87,15 ± 5,9
Caveolae synes fritt i cytosolen 173,5 ± 12,0 77,41 ± 6,3 143,0 ± 9,5
Totalt caveolae (luminal och fritt i cytosolen) 280,1 ± 21,5 127,86 ± 11,1 230,14 ± 15,4
Onormala endocytiska strukturer (förstorad endosomer) 2,65 ± 0,34 11,29 ± 2,7 14,93 ± 3,8
Caveolae kluster 3,95 ± 0,4 5,64 ± 1,6 11,3 ± 2,5
Membranös ringar 1,33 ± 0,04 9,47 ± 2,4 12,8 ± 2,8
Tubuli 0,88 ± 0,05 4,0 ± 1,3 18,84 ± 3,4
Name Company Catalog Number Comments
Dimethyl Dioctadecyl Ammonium Bromide (DOAB) Sigma-Aldrich D2779
LiposoFast stabilizer (mini-extruder) Avestin Inc. LF-STB
Polycarbonate membrane, 19 mm diameter, 50 nm pore Avestin Inc. LFM-50
Cholesterol Sigma-Aldrich C-8667
Chloroform Mallinckrodt Chemicals 4432-04
Hank's balanced salts Sigma-Aldrich H1387
Round-bottom flask Fisher Scientific FHB-275-030X
Mouse siRNAITSN - on target Dharmacon/ThermoScientific J-046912-11
Peristaltic pump Ismatec REGLO-CDF digital with RHOO pump head
Ventilator Hugo Sachs Electronik NA
Barbital Sigma-Aldrich B-0500
Uranyl acetate EM Sciences 22400
Epon812 EM Sciences Discontinued by the manufacturer
Propylene oxide EM Sciences 20400
Embedding molds EM Sciences 69923-05
Tannic acid EM Sciences 21710
8 nm gold-albumin tracer Prepared in the laboratory as in16
Comments
Equipped with 2 Avestin 1 ml gas-tight syringes (cat. # LF-1)
Pyrex, 100 ml
Modified siRNA, in vivo
Part of IDEX corp.
D-79232 March, Germany
Replaced with Embed812, cat. # 14120

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Predescu, S. A., Predescu, D. N., Knezevic, I., Klein, I. K., Malik, A. B. Intersectin-1s regulates the mitochondrial apoptotic pathway in endothelial cells. J. Biol. Chem. 282 (282), 17166-17178 (2007).
  2. Uddin, S. Cationic lipids used in non-viral gene delivery systems. Biotechnology and Molecular Biology Review. 2 (2), 58-67 (2007).
  3. Barenholz, Y., et al. Influence of lipid composition on the thermotropic behavior and size distribution of mixed cationic liposomes. J. Colloid Interface Sci. (356), 46-53 (2011).
  4. Predescu, D. N., Neamu, R., Bardita, C., Wang, M., Predescu, S. A. Impaired caveolae function and upregulation of alternative endocytic pathways induced by experimental modulation of intersectin-1s expression in mouse lung endothelium. Biochem. Res. Int.. (2012), 672705 (2012).
  5. Higuchi, Y., Kawakami, S., Hashida, M. Strategies for in vivo delivery of siRNAs: recent progress. BioDrugs. 24 (24), 195-205 (2010).
  6. Caracciolo, G., Amenitsch, H. Cationic liposome/DNA complexes: from structure to interactions with cellular membranes. Eur. Biophys. J. , (2012).
  7. Barnier Quer, C., Elsharkawy, A., Romeijn, S., Kros, A., Jiskoot, W. Cationic liposomes as adjuvants for influenza hemagglutinin: more than charge alone. Eur. J. Pharm. Biopharm. 81 (81), 294-302 (2012).
  8. Rai, K., et al. Liposomal delivery of MicroRNA-7-expressing plasmid overcomes epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor-resistance in lung cancer cells. Mol. Cancer Ther. (10), 1720-1727 (2011).
  9. McLean, J. W., et al. Organ-specific endothelial cell uptake of cationic liposome-DNA complexes in mice. Am. J. Physiol. (273), H387-H404 (1997).
  10. Soutschek, J., et al. Therapeutic silencing of an endogenous gene by systemic administration of modified siRNAs. Nature. (432), 173-178 (2004).
  11. Barenholz, Y. Liposomes enhance bioremediation of oil-contaminated soil. J. Liposome Res. (13), 1-8 (2003).
  12. Zamboni, W. C. Liposomal, nanoparticle, and conjugated formulations of anticancer agents. Clin. Cancer Res. (11), 8230-8234 (2005).
  13. Newman, M. S., Colbern, G. T., Working, P. K., Engbers, C., Amantea, M. A. Comparative pharmacokinetics, tissue distribution, and therapeutic effectiveness of cisplatin encapsulated in long-circulating, pegylated liposomes (SPI-077) in tumor-bearing mice. Cancer Chemother Pharmacol. (43), 1-7 (1999).
  14. Martino, S., et al. Efficient siRNA delivery by the cationic liposome DOTAP in human hematopoietic stem cells differentiating into dendritic cells. J. Biomed. Biotechnol. (2009), 410260 (2009).
  15. Zhang, G., et al. A delivery system targeting bone formation surfaces to facilitate RNAi-based anabolic therapy. Nat. Med. 18 (18), 307-314 (2012).
  16. Predescu, D., Palade, G. E. Plasmalemmal vesicles represent the large pore system of continuous microvascular endothelium. Am. J. Physiol. (265), H725-H733 (1993).
  17. Koh, T. W., Verstreken, P., Bellen, H. J. Dap160/intersectin acts as a stabilizing scaffold required for synaptic development and vesicle endocytosis. Neuron. (43), 193-205 (2004).
  18. Miyawaki-Shimizu, K., et al. Lung Cell Mol. Physiol. (290), L405-L413 (2006).

Tags

Bioteknik medicinsk teknik biokemi genetik molekylärbiologi cellbiologi anatomi fysiologi medicin immunologi farmakologi djurmodeller hjärt-kärlsjukdomar intersectin-1s siRNA liposomer retro-orbital injektion akut och kronisk ITSN-1s knockdown transgena möss liposom endotelceller vävnad lunga perfusion elektronmikroskopi djurmodell
Långsiktig tysta Intersectin-1s i muslunga genom upprepad Leverans av en specifik siRNA via katjoniska liposomer. Utvärdering av knockdown Effekter med elektronmikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bardita, C., Predescu, D., Predescu, … More

Bardita, C., Predescu, D., Predescu, S. Long-term Silencing of Intersectin-1s in Mouse Lungs by Repeated Delivery of a Specific siRNA via Cationic Liposomes. Evaluation of Knockdown Effects by Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (76), e50316, doi:10.3791/50316 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter