Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Katyonik lipozomlar üzeri özel siRNA tekrar teslim ile Fare Akciğerler Intersectin-1s uzun süreli suskunluğu. Elektron Mikroskobu ile demonte Etkilerinin Değerlendirilmesi

Published: June 21, 2013 doi: 10.3791/50316
Automatic Translation
*1, *1,2, 1,2
1Department of Pharmacology, Rush University, 2Pulmonary and Critical Care Department, Rush University
* These authors contributed equally

Summary

Farelerde katyonik liposomes/siRNA/ITSN-1s kompleksleri, 24 gün boyunca her 72 saatte tekrarlanan retroorbital enjeksiyonları, verimli% 75 oranında ITSN-1s mRNA ve protein ekspresyonu azaltarak fare akciğer mikrovasküler için siRNA dubleks teslim. Bu teknik, bir hayvan modelinde yüksek tekrarlanabilir, herhangi bir olumsuz etkisi yoktur ve ölümlerin önler.

Abstract

Önceki çalışmalar ITSN-1s (KD ITSN), akciğer damar geçirgenliği ve endotel hücreleri (EC) hayatta kalma, bağlı apoptotik hücre ölümü, ITSN-1s uzun süreli bir hücre kültür sistemi geliştirilmesinde önemli bir engel düzenleyen dahil bir endositik proteinin bu demonte gösterdi 1 inhibisyonu. Taşıyıcıları olarak katyonik lipozomlar kullanarak, ITSN-1 geni (siRNA ITSN) hedef siRNA sistemik yönetimi tarafından fare akciğerlerde ITSN-1s genin susturulması araştırdı. 2 üretmek için, tekrarlanan doz güvenli immünojen olmayan, toksik olmayan ve kolay: Katyonik lipozomlar siRNA teslimat için birçok avantaj sunar. Lipozomlar performans ve biyolojik aktivite bir kolesterol ve dimetil dioktadesil amonyum bromür kombinasyonu kullanarak boyutu, ücret, lipid kompozisyonu, istikrar, doz ve uygulama 3 yolu Burada, verimli ve elde edilmiştir fare akciğerlerde belirli KD ITSN bağlıdır. İntravenöz teslimatsiRNA ITSN bir / katyonik lipozom kompleksleri geçici ek 3 gün sonra kurtarıldı gün 3 de fare akciğerlerde ITSN-1s protein ve mRNA, yere serdi. Bir tekrarlanabilir güvenli taşıyıcı olarak katyonik lipozomlar yararlanarak, çalışma 24 gün daha uzatıldı. Bu nedenle, taze üretilen kompleksleri ile retro-orbital tedavi çalışma 4 boyunca sürekli KD ITSN uyaran, her 3 gün uygulandı. Çeşitli zaman noktalarında sonrası siRNA ITSN toplanan Fare dokularda akciğer endotel, kronik KD ITSN etkilerini değerlendirmek için elektron mikroskobu (EM) analizlerine maruz bırakıldı. Yüksek çözünürlüklü EM görüntüleme bize akciğer vasküler yatakta KDITSN neden olduğu morfolojik değişiklikleri değerlendirmek için izin ışık mikroskobu ile özellikleri olmayan saptanabilir, (endotel bariyer yani bozulması, caveolae sayısı ve alternatif ulaşım yollarının upregülasyonu azalma). Genel Bu bulgular bir zayıf olmakla birlikte baskı kurduEC fonksiyonu ve akciğer homeostazında ITSN-1s tant rolü, in vivo siRNA-lipozomlar teslim etkinliğini gösteren ise.

Introduction

Çıplak siRNA, hücre zarı nüfuz edemez negatif yüklü olan ve kandaki enzimler, doku ve hücreler tarafından kolayca düşer. Hatta kararlılığını iyileştirmek için son zamanlarda yapısal değişiklikler ile birlikte, tatbikattan sonra, hedef mahallinde siRNA birikim son derece düşüktür ve etkin bir hücre içi araç 5 gerektirir. Katyonik lipozomların içine alıcı ve enzimatik degradasyona 6 nükleik asitler koruyarak hücre içine DNA / RNA 'nın büyük parça aktarmak için potansiyeli olan güvenli bir nükleik asit taşıyıcı olarak ortaya çıkmıştır. Ayrıca, katyonik lipozomlar ve böylece kendiliğinden hücreleri 2 gen transferi teşvik, DNA / RNA ile etkileşime girer. Daha yakın zamanlarda lipozomlar, aşılar ve düşük molekül ağırlığına sahip ilaçların 7 teslim etmek için uygulanmıştır. Plazmid mikroRNA-7-ifade lipozomal akciğer kanser hücrelerinin 8 epidermal büyüme faktörü reseptör tirozin kinaz inhibitörü direnç üstesinden gelir. Hedeflerkenkompleksleri endotel bariyer çapraz ve interstisyumda 9 için extravasate olası değildir, çünkü, damar endotelyumu intravenöz yoldan gereklidir. Diğer organlara kıyasla, akciğer mikrovasküler gelen ECS büyük alımı ve heyecanla lenf düğümleri ve Peyer en yamalar 9 takip katyonik lipozom ve DNA / RNA kompleksleri, içselleştirmek. Retroorbital veya kuyruk ven enjeksiyon yoluyla siRNA kemirgen modellerinde intravenöz teslim hatta 50 mg / kg 10 gibi yüksek konsantrasyonlarda, zararsız kanıtlanmıştır. Literatürde katyonik lipozomlar kompozisyonu lipid formülasyonu ve eşit molar oranı 11, 12 esas olarak farklılık gösterir. , Aşı ya da anti-tümör tedavileri 13-15 teslim proteinlerin down-regulation/over-expression hedef olup, in vivo gen aktarımı için katyonik lipozomlar kullanarak potansiyel uygulamaların geniş bir dizi bulunmaktadır. Hatırlamak önemlidirDNA / RNA-hücre membran etkileşimi verimini oluşturulan kompleksleri ve membran lipidleri arasındaki kuplajı şeklinde düzenlenir olmasıdır. Bu, hedeflenen hücre membranı profillerine lipid bileşimin dikiş belirli bir hücre tipi 6 transfeksiyon yüksek oranda faydalı ve sonuç olabileceğini düşündürmektedir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Katyonik lipozomlar hazırlanması

  1. Lipososmes hazırlanması için kullanılmak üzere temiz bir yuvarlak-tabanlı bir şişeye otoklav.
  2. Stok çözümleri hazırlayın:
    1. - Küçük bir cam şişe kullanarak 10 ml kloroform içinde dimetil dioktadesil amonyum bromür (DOAB) 200 mg çözülür.
    2. - Küçük bir cam şişe kullanılarak 10 ml kloroform içinde kolesterol 200 mg çözülür.
    3. - Hazırlamak ve 100 ml RNA / DNA-az serbest damıtılmış su içinde% 5 glukoz otoklavda sterilize edilmesi için.
  3. Kloroform ile yuvarlak-tabanlı bir şişeye durulayın. Şişesi, girdap için 5-10 ml ekleyin ve birkaç dakika bekletin. Her zaman alüminyum folyo ile kaplı şişesi tutun. Şişesi kloroform boşaltın.
  4. Lipozomların hazırlanması:
    1. - Yuvarlak-tabanlı bir şişeye DOAB stok çözeltisi 315 ul ekleyin.
    2. - Şişeye kolesterol stok çözeltisinden 200 ul ekleyin.
    3. - Bir şişeye kloroform içinde 9.5 mlnd girdap tarafından karıştırın.
  5. 37 rotavaporda ayarlayın ° C, 100 dakikadaki dönüş (rpm) veya daha fazla (100-120 rpm). Rotavaporda doğru bir şekilde takılmış olan bir emiş borusu ile birlikte bir su vakum pompası kontrol bağlı olmalıdır.
  6. Argon gazı tank ve rotavaporda bağlayın.
  7. Rotavaporda için şişesi takın ve su banyosu içinde indirmeden önce en uygun ayarları yapın. Saat yönünün tersine çevirerek tamamen argon için ilk vanasını açın. Her zaman önce bu valf açıp kapatın. Ikinci valf şişeye üfleme argon basıncı kontrol eder. Basıncı her zaman nazik olmalıdır.
  8. Tamamen sular altında olmadan su dokunun ve hız açmak için şişesi için yeterli, su banyosunda rotavaporda indirin.
  9. 10 dk, tüm kloroform buharlaşır kadar bekleyin. Daha sonra makineyi durdurun.
  10. Rotavaporda hızı ve argon tankı vanaları kapatın. Şimdi şişenin çıkarılmalıdır.
  11. Th% 5 glikoz 2 mle şişesi lipidler çözmek için.
  12. Iyice tüm lipidler çözmek için 1 ml pipet kullanarak balonun alt Scratch. Gerekirse çizilmemesi sonra, ikinci bir ucu, 1 ml ucundan balonun içine kalan lipid çıkarın.
  13. Yavaş yavaş (15 rpm) balonun Vorteks 42 ° C su banyosu içinde, elde edilen çözelti inkübe edin.
  14. Soğuk su ile sonikatör KDV doldurun. Zar zor su dokunmadan kaldırdı şişesi ve alt ile en az 20-30 dakika için çözüm sonikasyon.
  15. Suya yuvarlak tabanlı, bu kez, sıfır hızda 42 ° C'de 20 dakika C için rotavaporda su banyosunda şişeye ısıtın.
  16. Bir 0.47 mikron ve daha sonra, 0.22 mikronluk şırınga filtreleri aracılığıyla lipozomlar filtre.
  17. Küçük bir ekstrüzyon presini kullanarak, tek lamelli veziküller lipozom homojen bir popülasyon elde etmek için bir 50 nm zar içinden, lipozomların filtre.
  18. Bir Eppendorf tüp lipozomlar aktarın ve buz üzerine yerleştirin.

2. Lipozomlar hazırlayın: siRNA-ITSN-1 Kompleksleri

  1. 2 mg / ml bir son konsantrasyona kadar 20 mM HEPES ve 150 mM sodyum klorür, pH 7.4 ihtiva eden tampon içinde siRNA ile ilgili hedef fare siRNA ITSN yeniden süspanse edin. Karıştırmadan önce buz üzerinde tutun.
  2. 2 ug RNA (veya 400 nmol lipozomlar: 100 ug siRNA ITSN) 8 nmol lipozomlar oranında siRNA ITSN kompleksleri: lipozomlar hazırlayın. Bu çalışmada, bir RNA / DNA-az serbest Eppendorf tüpü kullanılarak taze hazırlanmış lipozomlar 100 ul stok çözeltisi (50 uM), ikinci siRNA ITSN 50 ul eklendi. Karışım 150 ul maksimum bir zamanda fare bilateral ve retro-orbital enjekte olabilir, çünkü siRNA ITSN konsantrasyonu çok önemli olduğu unutulmamalıdır.
  3. Fareler enjekte beklerken buz karışımı tutun.

3. Fare Retro-yörünge Ven Enjeksiyon (Göz Soket İç Açı)

jove_content "> Tüm fare deneyleri Rush Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu kurallarına uygun olarak onaylanmış ve yapıldı.

  1. 50 mg / kg vücut ağırlığı ketamin ve 5 mg / kg vücut ağırlığı ksilazin (ticari olarak temin edilebilen karışımı) intraperitonal enjeksiyonu ile fare anestezisi. Hayvanın yaşına ve ağırlığına bağlı olarak, anestezik madde hacmi ile konsantrasyonunun ayarlayın. Çalışmada kullanılan farelerin farenin 6-8 haftalık erkek fareler CD1, ve 25 gram civarında tartın. Şırınga, iğne takılı olan tüberkülin 1 ml türüdür.
  2. Tek elle fare kulakları tutun ve gözün iç açısı ortaya çıkarmak için bir yan üzerinde fare kısın. Plika semilunaris için medial Amaç, göz küresi dokunmaktan kaçının.
  3. Her üç eksende 45 derece açıda karışımı içeren şırınganın tutan gözün lakrimal karünkül Yaklaşım.
  4. Yavaşça karışımı enjekte ve enjekte tarafı ile kurtarmak için fareyi sağlar. Bir büyük bir sıvıiğne yerde damlacık formları, şırınga geri iğne, emme damlacık geri çekin ve yeniden deneyin. Tekrarlanan enjeksiyonlar iyi mükemmel kurtarma sağlamak için, gözleri alternatif tarafından yapılır. Eğer emin değilseniz, bu teknik mavi boya (50 ul, metanol içinde% 0.5 kristal viyole) enjekte ve mavi damar gözlemlemek için fareyi akciğerler açığa tarafından kontrol edilebilir.
  5. Bu çalışmada farelerin ölüm ya da yan etkisi olmadan 3 hafta boyunca her 3. gün enjekte edildi.

4. Biyokimyasal Araştırmalar Fare Akciğer Perfüzyon ve Doku Koleksiyon

  1. 1.5 mL / dk 'da çalıştırmak için peristaltik pompa ayarlayın.
  2. Ventilatör, çalışma masası, alet, steril pamuklu, q-ipuçları, dizeleri, bardak, distile su, Hank dengeli tuz, izleyici: ayar hazırlayın.
  3. Anestezik karışımı (100 mg / kg vücut ağırlığı ve ketamin 10 mg / kg vücut ağırlığı ksilazin) intraperitonal enjeksiyonu ile fare anestezisi. Boyun düzeyinde, tükürük bezleri çıkarın ve trakea ortaya.
  4. Laparotomi, tüketim diyafram ile başlayın, ve akciğer ve kalp açığa, torakotomi ile izleyin.
  5. Timus çıkarın.
  6. Daha iyi doğruluk için ışık mikroskobu kullanarak, pulmoner arter kateterize.
  7. Trakeostomi yapın ve trakeostomaya kullanarak fare entübe. 150 vuruş / dak ve 150 ul atım hacmi bir oranı ventilatör ayarlayın.
  8. Çıkış olarak, sol atrium açın.
  9. Peristaltik pompa ve Hank çözeltisi kullanarak, 5 dakika boyunca kan serbest fare akciğer damar serpmek 37 ° C'de ısıtıldı
  10. Aynı akış hızında 10 dakika daha izleyici (8 nm altın albümin 16) serpmek.
  11. Hank solüsyonu ile 5 dakika akciğer perfüzyon ile ilişkisiz izleyici yıkayın.
  12. 0.1 BORU 10 dk% 4 perfüzyon (ağırlık / hacim) formaldehit,% 2.5 glutaraldehit ve% 1 tannik asit ile akciğerlerin yerinde tespitte ile izleyintampon maddesi, pH 7.2.
  13. Akciğer toplayın, aşırı doku kaldırmak küçük bloklar (3/3 mm) kesilmiş ve sabitleştirici karışımı 2 ml içeren bir etiketli sintilasyon flakon koyun.

Fareler işlem sırasında tamamen anestezi sona erecek.

5. EM için Fare Akciğer Doku İşleme

  1. Stok çözümleri hazırlayın: 1% Palade OsO 4, veronal asetat ve Kellenberger tampon.
    1. -% 1 Palade-ogzo 4 tampon içerir: asetat, 1 ml veronal stoku, 1,25 ml% 4 OsO 4, en son hacim, 5 ml ile 1 ml 0.1 N hidroklorik asit ve damıtılmış su.
    2. - Asetat veronal stok çözeltisi, 1.15 g sodyum asetat andydrous ve damıtılmış su, 100 ml barbital 2.94 g eritilmesi ile elde edilir.
    3. -Kellenberger ve çözelti asetat veronal stok 2 ml 0.1 N hidroklorik asit, 0.05 gr uranil asetat 2.8 ml ve 5.1 ml'dedamıtılmış su, pH değeri = 6.
  2. Kısaca 0.1 M sodyum kakodilat tamponu, pH = 7,4, 3 kez akciğer blokları yıkayın.
  3. Oda sıcaklığında 1 saat boyunca 0.1 PIPES tampon, pH 7.2 'de% 4 (ağırlık / hacim) formaldehitle numuneler saptamak,% 2.5 glutaraldehid.
  4. Karanlıkta, buz üzerinde, kaputu 1 saat için 1% Palade-Osmium ile Post-düzeltmek.
  5. Kellenberger tamponu ile bir kez yıkayın.
  6. Oda sıcaklığında, gece boyunca 2 saat için Kellenberger ve tampon örnekleri inkübe edin.
  7. % 50 etanol içinde bir kez yıkayın.
  8. 70%, 95%, daha sonra 2 x 15 dakika,% 100 etanol: etanol kademeli serisi, 5 dakika / her biri kurutmak.
  9. 100% propilen oksit, 2 x 15 dakika geçin.
  10. Propilen oksit çıkarın ve oda sıcaklığında, bir tekerlek üzerinde dönen, bir gece inkübe, en az% 50 propilen oksit ve en az% 50 EPON 812 karışımı ekleyin.
  11. Ertesi sabah, karışım çıkarın ve en az tekerlek üzerinde 4-5 saat taze EPON 812, ekleyin.
  12. Dolu iki konik kalıpları kullanarak,taze% 100 EPON 812 ile yarım, seçilen örnekler ekleyebilir ve kenarlarına yerleştirin.
  13. 60 ° C sıcaklıkta inkübatör kümesine kalıp hareket ve 48-72 saat tedavi sağlar.
  14. Polimerize zaman, kesitli (kalın 60-70 nm) ince olmak blokları gönderin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ITSN-1s protein ve mRNA düzeyleri Western Blot ve 4 gibi geleneksel ve kantitatif PCR ile siRNA ITSN doğumdan sonra birkaç zaman noktalarında takip edildi. ITSN siRNA ile muamele edilmiş fare akciğerlerinde ITSN-1s protein ve mRNA seviyeleri 21 gün boyunca ITSN-1s sürekli demonte döneminde kontrol referans ile yaklaşık% 75 daha düşüktü. ITSN-1s olmadan, Dynamin-2, plazma zarından caveolae ayrılması içinde ITSN-1s ve önemli bir oyuncu önemli bir etkileşim ortağı verimli endositik siteye işe değildir ve plazma zarı ve ücretsiz veziküler oluşumu gelen böylece, caveolae dekolmanı taşıyıcı 1, 17 bozulur. Bu nedenle, etkisiz membran fisyon ve ücretsiz veziküler taşıyıcıların engelli oluşumu eksik endositoz ve transendoteliyal ulaşım, arası endotel bariyerinin bozulması ve pulmoner ödem (Şekil 1) neden oldu. Ayrıca, ITSN-1s yük atma kadar alternatif tr düzenleniransport eksik endositoz telafi etmek yollarının. Biz aktif alımını ve nakil altın albümin yer alan tipik caveolae (Şekil 2C) ile birleşir membranöz halkaları (Şekiller 2A ve 2a1), pleomorfik tübüller (Şekil 2B) ve endozomlar büyütülmüş ettim. Önemli bir bulgu kontrollere referans ile bu ITSN-1s yetersiz olan fare akciğer endotel caveolae sayısındaki azalma, Tablo 1 'dir. Katyonik lipozomlar / siRNA ITSN tekrarlanan teslim tarafından 24 gün boyunca uzun ITSN-1s inhibisyonu kısmen arası endotel bariyer bütünlüğünü geri yükleyerek farelerde akciğer ödemi azalır. EM morfolojik çalışmalar 8Nm altın-albümin izleyici bu zaman noktasında, arası endotel kavşaklar nüfuz olamayacağını gösterdi. Bunun yerine, kavşak luminal introit içinde filtrasyon artıkları (Şekil 3) kurdu. Ancak, perivasküler alanlarda bazı dilatasyon ve hafif gösterdiödem, kavşaklar bu partiküllerin boyutu geçirmez olan, ama yine de sızan olduğunu düşündürmektedir. Ayrıca, alternatif endositik yollarının morfolojik ara aktif ve daha fazla sayıda mevcuttur. Gözle, morfometrik analiz kontrolleri, Tablo 1 ile karşılaştırıldığında altın-albümin parçacıklar tarafından etiketli membranöz halka / tübül sayısı ITSN-1s kronik eksikliği fare akciğer endotel 14 kat artış göstermiştir. Caveolae sayısı kısmen kontrol atıfta bulunarak, sadece% 17.8 azalma geri yüklenir. Böylece, sonuçları katyonik lipozomlar / siRNA ITSN kompleksleri tekrar teslim in vivo uzun vadeli protein demonte etkilerini incelemek için uygun bir yöntem olduğunu göstermektedir.

Şekil 1
Şekil 1. Açık interendothelial kavşak gösteren Temsilcisi elektron mikroskop (IEJs) inci etiketli8 nm altın-albümin parçacıkları. Arrowhead kendi boyu roughout bir ve puan IEJ geniş açılış göstergesi aynı planında birbirine yakın bulunan üç-dört kez altın albümin parçacıkları, için, a1 büyütülmüş. (- Oklar A, B) Altın parçacıkları da IEJs arasında abluminal çıkış ile ilişkilidir. Yıldız), aynı zamanda caveolae ve pericapillary alanı adet dilatasyon sınırlı sayıda unutmayın. Çubuklar: 200 nm (A), 100 nm (B, a1).

Şekil 2,
Şekil 2. ITSN-1s ifade Akut pertürbasyon pleomorfik endositik / transcytotic ara neden olur. Temsilcisi EM 8 nm altın-albümin yüklü membranöz yüzük görüntüleri (A, a1), boru şeklinde elemanlar (B, oklar) ve genişlemiş endozomlar (C, ok başları) ve caveolae benzeri ile ilişkilimorfolojisi. Ayrıca, perivasküler boşluğunda (PV) ciddi genişlemesi ve proteinli ödem (A) dikkat edin. Barlar: 250 nm (A), 200 nm (B) 100 nm (a1, C).

Şekil 3,
Şekil 3,. ITSN-1s ifade kronik inhibisyonu kısmen IEJ bütünlüğünü geri yükler. Filtrasyon kalıntıları bir IEJ (ok başı) ve luminal introit içinde. Pvs hafif dilatasyon (*) IEJs bir leakiness göstermektedir. Multivesicular organları (mvb), plazma zarı yakın 8 nm altın albümin parçacıklar tarafından etiketli, kendi iç küçük veziküller bazı var. Bar: 100 nm.

Tablo 1. ITSN-1s ifade Kronik engellenmesi alternatif endositik / transcytotic yollarının aktivasyonuna neden olur ve kısmen caveolae sayı geri yükler. * Sonuçlar 100 mikron EC uzunluk başına normalize edilmiştir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Biz uzun vadeli özel siRNA / lipozom kompleksleri tekrar intravenöz (24 gün boyunca her 72 saat,) ile in vivo ITSN-1s yıkmak için bu yöntem geliştirdi diğerleri 9 ve bize 1, 18 tarafından yayınlanan önceki çalışmalara göre. Bu deneysel yaklaşım, verimli güvenli bir şekilde ve tekrar tekrar kullanılabilir ve kolayca akciğer endotel ve pulmoner dengesinin ilgi herhangi bir protein kodlayan bir genin katılımı incelemek için uzatılabilir. Tekrar siRNA / lipozomlar teslimat için bizimle tarafından kurulan deneysel koşullar altında, fare toksisite veya bağışıklık yanıtlarını belirtisi normal çıktı. SiRNA ITSN / lipozom kompleksleri sistemik uygulamasının, kanser ve diğer metabolik hastalıklar gibi belirtiler için klinik olarak en uygun yoldur. Akciğer siRNA / lipozom intravenöz enjekte kompleksleri ve bu verimli KD ITSN açıklayabilir karşılaştığı ilk kapiller yatakAkciğerde.

Çalışmanın bir sınırlama katyonik lipozomlar 2 zamana bağlı olarak sürekli olarak toplanmasıdır. Üstesinden gelmek için, siRNA / lipozom kompleksleri nesilden (en az 2 saat) kısa bir süre teslim ve kullanmadan önce her zaman buz üzerinde korunmuştur. Bu Çalışmamızda kullanılan olanlar gibi geleneksel katyonik lipozomlar, retikülo-endotel sistemi ile temizlenmesi önerilmektedir. Fagositler tarafından-almak oranı de lipozomal pegilasyonu azalmıştır olabilir. Daha da dokusal dağılımına sahip ise polietilen glikol (PEG) bir kaplama ile sterik stabilizasyon lipozomlar 'dolaşımı süresini uzatır. Bu faktörler, kemoterapötik ajanların uzun süreli dolaşım 12 arzu edilir bir anti-kanser tedavileri çok önemli özelliklere hale gelir.

EM prosedürü ile ilgili olarak, doku incelendiğinde en az miktarda sistematik ve morfolojik geniş ve mo ile telafi edilmelidirgerekli rphometric analizi yanı sıra tarafından seri bölümleri incelenmesi,.

Bizim metodoloji sürekli teslimat ve siRNA etkinlik için dozaj planı optimize ederken, daha fazla çalışmaya doğru hedeflerin yüksek verimlilik tanımlama ve risk / parametreleri ilgili faydaların değerlendirilmesi odaklanmak için ihtiyaç vardır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Acknowledgments

Bu çalışma SP Sağlık Hibeler R01HL089462 Ulusal Enstitüsü tarafından desteklenmiştir.

Materials

Transcytotic / endositik yapılar Kontrol ITSN-1s siRNA, 72 saat ITSN-1s siRNA, 24 d
Lümen * açık Caveolae 106.6 ± 9.5 50.46 ± 4.8 87.15 ± 5.9
Sitoplazmada görünüşte ücretsiz Caveolae 173.5 ± 12.0 77.41 ± 6.3 143.0 ± 9.5
Toplam caveolae (lümen ve sitoplazmada ücretsiz) 280.1 ± 21.5 127.86 ± 11.1 230,14 ± 15.4
Anormal endositik yapılar (genişlemiş endozomlar) 2.65 ± .34 11.29 ± 2.7 14.93 ± 3.8
Caveolae kümeleri 3.95 ± .4 5.64 ± 1.6 11.3 ± 2.5
Membranöz halkaları 1.33 ± .04 9.47 ± 2.4 12.8 ± 2.8
Tübüller .88 ± .05 4.0 ± 1.3 18.84 ± 3.4
Name Company Catalog Number Comments
Dimethyl Dioctadecyl Ammonium Bromide (DOAB) Sigma-Aldrich D2779
LiposoFast stabilizer (mini-extruder) Avestin Inc. LF-STB
Polycarbonate membrane, 19 mm diameter, 50 nm pore Avestin Inc. LFM-50
Cholesterol Sigma-Aldrich C-8667
Chloroform Mallinckrodt Chemicals 4432-04
Hank's balanced salts Sigma-Aldrich H1387
Round-bottom flask Fisher Scientific FHB-275-030X
Mouse siRNAITSN - on target Dharmacon/ThermoScientific J-046912-11
Peristaltic pump Ismatec REGLO-CDF digital with RHOO pump head
Ventilator Hugo Sachs Electronik NA
Barbital Sigma-Aldrich B-0500
Uranyl acetate EM Sciences 22400
Epon812 EM Sciences Discontinued by the manufacturer
Propylene oxide EM Sciences 20400
Embedding molds EM Sciences 69923-05
Tannic acid EM Sciences 21710
8 nm gold-albumin tracer Prepared in the laboratory as in16
Comments
Equipped with 2 Avestin 1 ml gas-tight syringes (cat. # LF-1)
Pyrex, 100 ml
Modified siRNA, in vivo
Part of IDEX corp.
D-79232 March, Germany
Replaced with Embed812, cat. # 14120

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Predescu, S. A., Predescu, D. N., Knezevic, I., Klein, I. K., Malik, A. B. Intersectin-1s regulates the mitochondrial apoptotic pathway in endothelial cells. J. Biol. Chem. 282 (282), 17166-17178 (2007).
  2. Uddin, S. Cationic lipids used in non-viral gene delivery systems. Biotechnology and Molecular Biology Review. 2 (2), 58-67 (2007).
  3. Barenholz, Y., et al. Influence of lipid composition on the thermotropic behavior and size distribution of mixed cationic liposomes. J. Colloid Interface Sci. (356), 46-53 (2011).
  4. Predescu, D. N., Neamu, R., Bardita, C., Wang, M., Predescu, S. A. Impaired caveolae function and upregulation of alternative endocytic pathways induced by experimental modulation of intersectin-1s expression in mouse lung endothelium. Biochem. Res. Int.. (2012), 672705 (2012).
  5. Higuchi, Y., Kawakami, S., Hashida, M. Strategies for in vivo delivery of siRNAs: recent progress. BioDrugs. 24 (24), 195-205 (2010).
  6. Caracciolo, G., Amenitsch, H. Cationic liposome/DNA complexes: from structure to interactions with cellular membranes. Eur. Biophys. J. , (2012).
  7. Barnier Quer, C., Elsharkawy, A., Romeijn, S., Kros, A., Jiskoot, W. Cationic liposomes as adjuvants for influenza hemagglutinin: more than charge alone. Eur. J. Pharm. Biopharm. 81 (81), 294-302 (2012).
  8. Rai, K., et al. Liposomal delivery of MicroRNA-7-expressing plasmid overcomes epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor-resistance in lung cancer cells. Mol. Cancer Ther. (10), 1720-1727 (2011).
  9. McLean, J. W., et al. Organ-specific endothelial cell uptake of cationic liposome-DNA complexes in mice. Am. J. Physiol. (273), H387-H404 (1997).
  10. Soutschek, J., et al. Therapeutic silencing of an endogenous gene by systemic administration of modified siRNAs. Nature. (432), 173-178 (2004).
  11. Barenholz, Y. Liposomes enhance bioremediation of oil-contaminated soil. J. Liposome Res. (13), 1-8 (2003).
  12. Zamboni, W. C. Liposomal, nanoparticle, and conjugated formulations of anticancer agents. Clin. Cancer Res. (11), 8230-8234 (2005).
  13. Newman, M. S., Colbern, G. T., Working, P. K., Engbers, C., Amantea, M. A. Comparative pharmacokinetics, tissue distribution, and therapeutic effectiveness of cisplatin encapsulated in long-circulating, pegylated liposomes (SPI-077) in tumor-bearing mice. Cancer Chemother Pharmacol. (43), 1-7 (1999).
  14. Martino, S., et al. Efficient siRNA delivery by the cationic liposome DOTAP in human hematopoietic stem cells differentiating into dendritic cells. J. Biomed. Biotechnol. (2009), 410260 (2009).
  15. Zhang, G., et al. A delivery system targeting bone formation surfaces to facilitate RNAi-based anabolic therapy. Nat. Med. 18 (18), 307-314 (2012).
  16. Predescu, D., Palade, G. E. Plasmalemmal vesicles represent the large pore system of continuous microvascular endothelium. Am. J. Physiol. (265), H725-H733 (1993).
  17. Koh, T. W., Verstreken, P., Bellen, H. J. Dap160/intersectin acts as a stabilizing scaffold required for synaptic development and vesicle endocytosis. Neuron. (43), 193-205 (2004).
  18. Miyawaki-Shimizu, K., et al. Lung Cell Mol. Physiol. (290), L405-L413 (2006).

Tags

Biyomühendislik Sayı 76 Biyomedikal Mühendisliği Biyokimya Genetik Moleküler Biyoloji Hücre Biyolojisi Anatomi Fizyoloji Tıp İmmünoloji Farmakoloji hayvan modellerinde Kalp ve Damar Hastalıkları intersectin-1s siRNA lipozomlar retro-orbital enjeksiyonu akut ve kronik ITSN-1s demonte transgenik fareler lipozom endotelyal hücreler doku akciğer perfüzyon elektron mikroskobu hayvan modeli
Katyonik lipozomlar üzeri özel siRNA tekrar teslim ile Fare Akciğerler Intersectin-1s uzun süreli suskunluğu. Elektron Mikroskobu ile demonte Etkilerinin Değerlendirilmesi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bardita, C., Predescu, D., Predescu, … More

Bardita, C., Predescu, D., Predescu, S. Long-term Silencing of Intersectin-1s in Mouse Lungs by Repeated Delivery of a Specific siRNA via Cationic Liposomes. Evaluation of Knockdown Effects by Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (76), e50316, doi:10.3791/50316 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter