Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

التصوير المباشر من الكالسيوم مع ER-المستهدفة استريز المستحثة صبغ تحميل (TED)

Published: May 7, 2013 doi: 10.3791/50317
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1, 3, 1
1Institute for Clinical Neurobiology, University of Wuerzburg, 2Department of Synapses - Circuits - Plasticity, Max Planck Institute of Neurobiology, Martinsried, 3Walter Brendel Centre of Experimental Medicine, Ludwig-Maximilians University of Munich

Summary

استهدفت-استريز التي يسببها صبغ التحميل (TED) يدعم تحليل الديناميات داخل الخلايا مخزن الكالسيوم عن طريق التصوير مضان. تستند هذه الطريقة على استهداف من إستيراز الكربوكسيل المؤتلف إلى الشبكة الإندوبلازمية (ER)، حيث أنه يحسن إماطة اللثام المحلية الاصطناعية منخفضة تقارب كا

Abstract

تصور ديناميات الكالسيوم المهم أن نفهم دور الكالسيوم في علم وظائف الأعضاء الخلية. لدراسة ديناميات الكالسيوم، أصبحت الاصطناعية الفلورسنت كا 2 + المؤشرات شعبية. هنا علينا أن نظهر TED (= يسببها استهدفت-استريز صبغ التحميل)، وهي طريقة لتحسين الإفراج عن كا 2 + الأصباغ مؤشر في التجويف ER من أنواع مختلفة من الخلايا. حتى الآن، تم استخدام TED في خطوط الخلايا، والخلايا الدبقية، والخلايا العصبية في المختبر. قواعد TED على كفاءة، المؤتلف استهداف نشاط إستيراز الكربوكسيل عالية لمعة ER باستخدام ناقلات التركيبات التي Carboxylesterases صريح (CES). أحدث ناقلات TED تحتوي على عنصر أساسي من CES2 تنصهر لبروتين أحمر فلوري، وبالتالي تمكين المتزامن التصوير اللونين. يتم تصوير ديناميات الكالسيوم الحرة في ER في لون واحد، في حين يظهر هيكل ER المقابلة باللون الأحمر. في بداية الإجراء، والخلايا transduced مع الفيروسة البطيئة. وفي وقت لاحق، والخلايا المصابة لإعادة المصنف coverslips على لتمكين أخيرا التصوير الخلية الحية. ثم، يتم تحضين الخلايا الحية مع استر acetoxymethyl (AM-استر) شكل من الاسعار المنخفضة للتقارب كا 2 + المؤشرات، على سبيل المثال Fluo5N-AM، MAG-Fluo4-AM، أو ماج-Fura2-AM. يتم تشكيل النشاط استريز في ER يشق قبالة سلاسل الجانب مسعور من النموذج AM من كا 2 + المؤشر وماء صبغة الفلورسنت / كا 2 + معقدة والمحاصرين في التجويف ER. بعد صبغ التحميل، ويتم تحليل الخلايا في مقلوب ليزر متحد البؤر المجهر الضوئي. و perfused الخلايا باستمرار مع حلول قارع الأجراس تشبه وديناميات الكالسيوم ER هي تصور مباشرة بواسطة الوقت الفاصل بين التصوير. يتم التعرف الافراج الكالسيوم من ER من انخفاض في كثافة مضان في المناطق ذات الاهتمام، في حين أن إعادة تعبئتها من مخزن الكالسيوم ER تنتج زيادة في كثافة مضان. وأخيرا، يتم تحديد التغير في كثافة الفلورسنت بمرور الوقت من خلال حساب ΔF / F 0.

Introduction

من أجل حل الاستجابات الفسيولوجية الكالسيوم من ER، قمنا بتطوير استراتيجية جديدة لتحسين محاصرة من الكالسيوم الاصطناعية الأصباغ الحساسة في ER. تمكن الطريقة المباشرة وغير مدمرة في الوقت الحقيقي رصد الحر ER الكالسيوم في وجود الكالسيوم خارج الخلية.

وظيفة وإشارات من الكالسيوم ER

تم العثور على إشارات الكالسيوم في الخلية أنواع مختلفة، مثل خلايا العضلات، الخلايا العصبية والخلايا الدبقية وتتراوح الوظائف من التوسط تقلص العضلات لتورطه في انتقال متشابك في التعلم والذاكرة 1،2. التغييرات في تركيز الكالسيوم الحرة هي ذات أهمية علمية عالية لأن الكالسيوم ويشارك في تنظيم النسخ الجيني، تكاثر الخلايا، استثارة الخلايا العصبية، موت الخلايا والخلايا الأخرى مما يشير الأحداث 1-7. وترتبط وظيفيا كل هذه الإشارات الخلوية الكالسيوم داخل الخلايا وتساهم في الكالسيوممخزن 8-10 ديناميكية.

ثمة سمة مشتركة بين جميع إشارات الكالسيوم هو تدفق الكالسيوم بين الفضاء خارج الخلية، العصارة الخلوية والعضيات، وعلى رأسها ER والميتوكوندريا. هذا يسبب تغيرات ديناميكية في تركيز الكالسيوم داخل هذه العضيات، والتي لمست من قبل مكونات إشارات مختلفة. في العام، وتركيز الكالسيوم في نطاقات ER بين 100-800 ميكرون، في العصارة الخلوية تركيز الكالسيوم على مقربة من 100 نانومتر، وفي الفضاء خارج الخلية تركيز حوالي 1-2 ملم. وفقا لذلك، هناك قوة دافعة عالية الكيميائية لتدفق الكالسيوم نحو العصارة الخلوية 2،9،10.

تعتمد إشارات الكالسيوم ER-استمدت معظم التحقيق عادة على تحفيز مستقبلات البروتين G-يقترن (GPCR)، التي تنشط ثم فسفوليباز C (PLC). PLC بدورها تنتج اينوزيتول 1،4،5-trisphosphate (IP 3) 1. عند ربط الملكية الفكرية 3 إلى تفصيل لهاeptor (IP-3 التوصية، الشكل 1) في ER-الغشاء، يتم الافراج أيونات الكالسيوم من لمعة ER. تاريخيا، كان IP إطلاق الكالسيوم 3 بوساطة من لائحة الأول - حتى ولو بشكل غير مباشر - في قياس خلايا البنكرياس عنيبية بواسطة Streb وآخرون في عام 1983 11. واقترح هذا المنشور لأول مرة شلال إشارات تنطوي على أستيل، فسفوليباز C، وIP 3. هذه الطريقة في إطلاق الكالسيوم ويطلق عموما IP إطلاق الكالسيوم 3 التي يسببها (IiCR) (الشكل 1). التنشيط التي تعتمد على كيناز من فسفوليباز Cγ بواسطة مستقبلات tyrosin تحركات روابط العمل من عوامل النمو وعوامل عصبية إلى ER الكالسيوم مما يشير IP بعد 3 الارتفاع 12. بالإضافة إلى IiCR، قد يتم بوساطة ارتفاع الكالسيوم عن طريق دخول الكالسيوم ionotropic، على سبيل المثال عبر قنوات الكالسيوم الجهد بوابات (كا V)، وإطلاق الكالسيوم الكالسيوم التي يسببها اللاحقة (CICR) من خلال إعادة ryanodineمستقبلات (RYR). وترتبط IiCR وCICR الناحية الفسيولوجية لدخول الكالسيوم المخزن التي تديرها (SOCE). يتضمن SOCE عمل STIM (ستروما جزيء التفاعل)، وهو جهاز استشعار لإطلاق الكالسيوم ER. وقد تبين STIM لتحفيز دخول الكالسيوم خارج الخلية من خلال قنوات عابر مستقبلات المحتملة (التربتوفان) 13، وقنوات الكالسيوم Orai 14 وحتى قنوات الكالسيوم الجهد بوابات 15 (الشكل 1). فقدان ER الكالسيوم هو انقاذ حيوي بواسطة العمل من الكالسيوم شبكية هيولي باطني أتباز-ساركو (SERCA)، الذي بنشاط مضخات الكالسيوم مرة أخرى في ER. منع SERCA مع عقاقير مثل thapsigargin، يكشف عن استمرار فقدان الكالسيوم ER إلى المقصورة عصاري خلوي. ويتسبب هذا ER الكالسيوم "تسرب" بواسطة ER intramembrane المجمعات المسام مثل بروتين معقد Sec61 16،17 (الشكل 1).

في عام 1998، نشرت Berridge نموذجا، و "الخلايا العصبية ضمن نموذج الخلايا العصبية"، حركتيح يشير إلى وجود دور الفسيولوجية مبدأ ER في دمج الخلايا العصبية الكالسيوم 5. ويرى هذا النموذج وجود نظام مستمر غشاء ER تشكيل الخلايا "صورة" من ​​غشاء البلازما الخلايا العصبية 5. وقد ادعى هذا النظام غشاء حقيقية النواة الثنائية لتكون شرط أساسي لتحقيق التكامل الزمانية والمكانية للإشارات الكالسيوم السريعة والبطيئة في الخلايا العصبية. وتمنح إشارات الكالسيوم التي تحدث إما بالتزامن أو في وقت لاحق في العمود الفقري التشعبات المختلفة أو من نفس العصبون إلى سوما الخلية أو النواة عبر ER، حيث تتلخص أنها تصل 5،18. ثم، قد يكون لها آثار مجموعهما على استثارة الخلايا العصبية، وتنظيم النسخ الجيني أو التكامل من أجهزة الطرد المركزي الإشارة. وهكذا، فإن ER يدعم دمج إشارات الكالسيوم. واحد شرط مسبق لهذا المفهوم هو استمرارية ER في خلية واحدة، والتي تم الادعاء من قبل العديد من الدراسات والتي ثبت على الأقل لsomato-Dالمناطق endritic ومسافة قصيرة التوقعات محور عصبي 19-21. ما إذا كان هناك استمرارية ER ضمن التوقعات محور عصبي طويل هو موضوع نقاش.

استراتيجيات لقياس تدفق الكالسيوم مجانا عبر غشاء ER

في معظم الأحيان يتم رصد إشارات الكالسيوم في العصارة الخلوية 22،23. وبالتالي، فإنه لا يمكن بسهولة أن تميز سواء كا 2 + والتي تصب في العصارة الخلوية من خارج الخلية أو من مخازن داخل الخلايا 6،24. للتغلب على هذا القيد، وقد وضعت استراتيجيات منهجية لمباشرة التصوير الكالسيوم ER. في ملخص، يتم استخدام الاستراتيجيات التالية: (1) ER-استهدفت المهندسة وراثيا، مؤشرات بروتين 25-27 كا 2 + المؤشرات المنخفضة تقارب البروتين على أساس استخدام البروتين GFP إضاءة الحيوية aequorin أو في توليفة مع البروتين الاستشعار الكالسيوم. هذا كا 2 + المؤشرات المعدلة وراثيا (GECIs) ويمكنأن تستهدف لائحة مع مساعدة من الببتيد إشارة ويتم الاحتفاظ بنشاط في ER باستخدام الاستبقاء وعزر استرجاعها. مشترك ER كا 2 + مؤشرات على قاعدة مبدأ كمليون وهي كمليون YC4.3 26،28؛ كمليون الانقسام YC7.3ER 29، وD1 كمليون 30. (2) تحميل مباشر صبغ المستندة إلى استريز من AM-استر منخفضة تقارب كا 2 + المؤشرات 31،32. AM-مشتقات الأصباغ مؤشر (ماج-Fura2-AM، MAG-Fluo4-AM أو Fluo5N-AM) تمرير الأغشية البيولوجية في محبة للدهون، دولة الكالسيوم الأحرف. ثم، في العصارة الخلوية وكذلك في لائحة، الاسترات الذاتية يلتصق الفريق AM-استر والإفراج عن كا 2 + المؤشر، مخلفين وراءهم كمية معينة من صبغة نشطة في العصارة الخلوية وفي ER. ولذلك، فإن هذا النهج هو مفيد في ظل ظروف من تركيز عالية من الكالسيوم في ER طالما يبقى تركيز الكالسيوم عصاري خلوي أقل بكثير من ديالحد بحماية المناخ من المؤشرات المنخفضة تقارب، ولا سيما خلال إشارات الكالسيوم مميزة (مثل نانومتر إلى ميكرومتر منخفض). (3) تحميل AM-استر في تركيبة مع غشاء البلازما permeabilization 32. تتم إزالة أي المتبقية عصاري خلوي كا 2 + المؤشر بواسطة غشاء البلازما permeabilization مع كميات صغيرة من المنظفات "خفيفة" (على سبيل المثال سابونين) في وجود مخزن مؤقت داخل الخلايا الاصطناعية. وبالتالي، قد يكون حافزا للأغشية الخلايا، على سبيل المثال مع IP 3 في المخزن المؤقت داخل الخلايا، مباشرة من خلال "مسام" في غشاء البلازما. (4) غسيل الكلى من العصارة الخلوية ضمن تكوين خلية كاملة والقياسات في وقت واحد من كا 2 + في التجويف ER والعصارة الخلوية 32،33. يتم تحميل الخلية الأولى مع انخفاض تقارب كا 2 + مؤشر (على سبيل المثال ماج-Fura2- AM، ratiometric، ضوء الأشعة فوق البنفسجية). بعد ذلك، مع مساعدة من ماصة التصحيح، أي CYT المتبقيةوdialysed osolic منخفضة تقارب كا 2 + مؤشر للخروج من العصارة الخلوية مع العازلة التي تحتوي على نسبة عالية تقارب كا 2 + مؤشر (على سبيل المثال فلوو-3، الضوء المرئي). تمكن هذه الاستراتيجية في وقت واحد تسجيل الاشارات عصاري خلوي وER مشتقة. (5) التي تستهدف استريز التي يسببها صبغ التحميل 8،34. A إستيراز الكربوكسيل (CES) والتي تستهدف تجويف ER ويوفر النشاط استريز السامية لمحاصرة كفاءة من النموذج AM-استر من كا 2 + مؤشرات الاسعار المنخفضة للتقارب.

التي يسببها استهدفت-استريز صبغ التحميل (TED)

لتحسين استهداف كا 2 + المؤشرات المنخفضة تقارب إلى ER التجويف، وقد وضعت TED. يتطلب TED على overexpression من وER إستيراز الكربوكسيل الماوس المستهدفة (CES2) (الشكل 2)، والذي يتحقق من خلال بنيات التعبير. يتم تحضين الخلايا معربا عن المؤتلف CES-بناء مع شكل AM-استر من الكالسيوم فيdicator صبغ (Fluo5N-AM، الشكل 2). ثم، في لائحة، يتم تحويل الصبغة إلى كا 2 + حساسة، غشاء كتيمة كا 2 + مجمع مؤشر (Fluo5N/Ca 2 +) من قبل النشاط استريز عالية، وبالتالي محاصرة الصبغة في تركيز عال في التجويف ER 8 ، 34. هذه الطريقة مفيدة بشكل خاص للتحقيق ER الكالسيوم الإفراج عبر مسارات-IiCR على سبيل المثال عن طريق metabotropic purinergic أو الغلوتامات المستقبلات، 8،34 وتصور استنزاف الكالسيوم ER عبر "قنوات تسرب" مباشرة، على سبيل المثال بعد الحصار المفروض على SERCA 17 ، 34. لتجربتنا انخفاض تقارب كا 2 + مؤشر Fluo5N-AM حاليا أفضل مؤشر متاحة للاستخدام مع استراتيجية جار صبغ TED. Fluo5N-AM يحتوي على نسبة منخفضة تقارب لكا 2 + (التفكك المستمر K D ~ 90 ميكرون، الشكل 2)، هي تقريبا غير الفلورسنت في تقريرها AM-شكل، ولكنها توفر الانبعاثات مضان عالية على calciuم ملزمة 8،34. يمكن متحمس Fluo5N/Ca 2 + معقدة مع مصدر ضوء معيار من ~ 490 نانومتر، والتي تتطابق مع الأصباغ القياسية مثل FITC، اليكسا 488، أو EGFP. إشارات الكالسيوم عصاري خلوي نكاد نبلغ تركيز في نطاق ميكرومتر منخفضة، وبالتالي يتم الكشف عنها من قبل بالكاد Fluo5N في العصارة الخلوية 35.

لتحسين أداء TED، وقد وضعت عدة بنيات ناقلات المؤتلف (الشكل 3). في الأصل، وناقلات TED على أساس تسلسل الترميز من CES2 (Refseq انضمام عدد NM_145603، CES2c) وأفضل أداء TED لوحظ مع التعبير المستقرة للبنيات CES. ناقلات TED نيو اكسبريس عنصرا أساسيا من CES2 تنصهر في البروتين مضان أحمر TagRFP-T2 36. هذه النواقل لها ميزة أنها يمكن أن تستخدم لتحديد الخلايا transduced واستخدام مضان أحمر باعتبارها الرقابة الداخلية لتطبيع التغييرات في Fluo5N/Ca 2 + مضان. كما يقدم مضان أحمر إمكانية لتصور توزيع الهيكلي للER والتغيرات في ديناميات ER في ظل ظروف التحفيز.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

هذا البروتوكول يدخل تطبيق TED إلى خطوط الخلايا، الخلايا العصبية قرن آمون والخلايا الدبقية القشرية. هو أفضل عندما يتم التعبير عن TED أداء ناقلات TED ثابت، على سبيل المثال بواسطة ناقلات lentiviral. ويرد وصف تخطيطي لطريقة TED في الشكل 4.

1. تحضير محاليل

وينبغي إعداد الحلول التالية قبل البدء، ويمكن تخزينها على النحو المشار إليه. ونحن عموما استخدام الزجاج المعقم والمواد البلاستيكية والمياه تعقيمها.

  1. إعداد HEPES-قارع الأجراس (مم): 125 كلوريد الصوديوم، 3 بوكل، 25 HEPES، 2 MgSO 4 .7 H 2 O، 2 و CaCl 2، 1.25 ناه 2 ص 4 H 2 O، 10 glucose.H 2 O.. خالية من الكالسيوم HEPES-قارع الأجراس يتكون من (مم): 127 كلوريد الصوديوم، 3 بوكل، 25 HEPES، 2 MgSO 4 .7 H 2 O، 1.25 ناه 2 ص 4 H 2 O، 10 glucose.H 2 O و 0.1 EGTA. دون الجلوكوز يمكن للحلول التصوير هذه به تخزينها في 4 درجة مئوية. يتم إضافة المبلغ المطلوب من D-جلوكوز طازجة قبل الاستخدام.
  2. لتحليل TED في الخلايا العصبية قرن آمون، فمن المستحسن الاصطناعي السائل النخاعي (ACSF). وتتألف ACSF من (مم): 127 كلوريد الصوديوم، 23 NaHCO 3، 3 بوكل، 2.5 NaHPO 4 H 2 O، 25 D-glucose.H 2 O، 2 و CaCl 2، 2 2 MgCl .7 H 2 0 في DDH. 2 0.
  3. إعداد Fluo5N-AM إلى تركيز 5 ملم. للمساعدة على إذابة إضافة 8.9 ميكرولتر من 20٪ بلورونيك F-127 (في DMSO وتخزينها في درجة حرارة الغرفة، وحمايتها من الرطوبة والضوء) إلى 50 ميكروغرام من مجفف بالتجميد Fluo5N-AM. ثم ذوبان Fluo5N-AM عن طريق sonicator حمام الماء لمدة 2 دقيقة على الأقل. مخزن مأخوذة à 0.5 ميكرولتر في -20 درجة مئوية، محمية من الضوء والرطوبة.
  4. إعداد خصم والأرصدة ناهض حسب الحاجة. على سبيل المثال: أ) 10 ملي ATP أو ADP (في H 2 O، وتفعيل metabotropic من المستقبلات purinergic)، ب) 10 ملي كرباكول في H 2 O (ناهضمن مستقبلات أستيل المسكارينية)، ج) 30 ملم حمض cyclopiazonic (CPA) في DMSO (مانع من SERCA)، د) DHPG 50MM في برنامج تلفزيوني (metabotropic الغلوتامات ناهض مستقبلات لmGluR الأول وmGluR 5)، ه) 10 الغلوتامات ملم في H 2 O، و) 1 ionomycin ملم في DMSO (حامل الأيون)، ز) 5 thapsigargin ملم في DMSO (مانع عالية تقارب من SERCA). مأخوذة تخزينها في -20 درجة مئوية.
  5. ناقلات lentiviral: ويشمل هذا البروتوكول استخدام lentiviral TED التعبير جزيئات النواقل. الإنتاج والتخزين الخاصة بهم ليست جزءا من هذا البروتوكول. نحن نستخدم ناقلات lentiviral من الجيل الثاني لنقل Carboxylesterases المؤتلف إلى خطوط الخلايا، والخلايا الدبقية والخلايا العصبية. لدينا قواعد نظام lentiviral على التعبير ناقلات FUGW 37، والبلازميدات التعبئة والتغليف pCMVΔR8.91 أو psPAX2 وpseudotyping البلازميد pMD2.G 38،39 تنبيه: أرى أن العمل مع المؤتلف تعطيل الذاتي ناقلات lentiviral يتطلب حذراالنظر في المبادئ التوجيهية للسلامة الأحيائية. في العديد من البلدان، وتصنف هذه النواقل كمجموعة مخاطر بيولوجية 2. لمزيد من المعلومات الرجوع إلى http://www.addgene.org/lentiviral/ .

2. إعداد والعدوى الفيروسية من الماوس الخلايا العصبية قرن آمون

  1. غسل coverslips الزجاج في الزجاج طبق بتري 20 سم القطر (100 coverslips على كل طبق) 1X في الايثانول 70٪ لحوالي 30 دقيقة. أخيرا، إضافة الإيثانول بنسبة 100٪ (سنويا) لمدة 2 دقيقة. إزالة الايثانول المتبقية وتجفيف coverslips تحت غطاء العقيمة.
  2. إعداد نوعين مختلفين من وسائل الإعلام للثقافات الخلايا العصبية قرن آمون: (أ) متوسطة neurobasal مع B27 01:50، (ب) كامل المتوسطة: متوسط ​​neurobasal مع B27 01:50، Glutamax 1:100، وN2 الملحق 1:100. العقيمة الترشيح وسائل الإعلام وتخزينها في الخلية الحاضنة حتى الاستخدام.
  3. يوم واحد قبل التشريح، ويتم إعداد coverslips على طريق وضع أول واحد العقيمة ساترة 10 مم في كلبئر من صحن الثقافة الخلية 4 جيدا. بعد ذلك، بعناية معطف كل ساترة مع 80-100 ميكرولتر 0.1٪ بولي-L-يسين وتخزين الأطباق في حاضنة أكثر من ليلة.
  4. في يوم من تشريح والثقافة الخلية، تبدأ مع غسل coverslips على ثلاث مرات مع 100 ميكرولتر HBSS ونقل 100 ميكرولتر المتوسطة neurobasal إلى كل ساترة. ضع الأطباق في حاضنة للموازنة (على سبيل المثال خلال تشريح الفئران).

تشريح

ونحن أداء تجاربنا مع الفئران وفقا للمبادئ التوجيهية للاتحاد الأوروبي، كما وافقت عليها لدينا رعاية الحيوان واللجنة المؤسسية الاستخدام.

  1. إزالة الدماغ الكلي وتشريح الحصين ثنائيا.
  2. إزالة بعناية أي السحايا والأنسجة الأخرى من الحصين والمكان الحصين واحد كل في أنبوب مل 1.5 تحتوي على 450 HBSS ميكرولتر. تخزين الأنسجة على الجليد حتى تم عزل عدد كاف من الحصين.
<فئة P = "jove_step"> خلية ثقافة

  1. إضافة 50 ميكرولتر 1٪ التربسين (رثينجتون) إلى كل أنبوب واحتضان لهم في 37 ° C حمام الماء لمدة 15 دقيقة. يهز أنابيب أحيانا. لوقف رد فعل الهضم، إضافة 50 ميكرولتر 1٪ التربسين المانع إلى كل أنبوب وعكس الأنبوب عدة مرات.
  2. نقل جميع أنسجة تصل إلى 5 الحصين إلى واحد 15 مل أنبوب الصقر تجنب نقل السائل. إضافة B27 المتوسطة (أ) إلى الحجم النهائي من 5 مل.
  3. يسحن الأنسجة باستخدام النار مصقول باستور الزجاج ماصة بعناية من قبل pipetting صعودا وهبوطا تنبيه: تجنب فقاعات الهواء!
  4. تدور مع 400 x ج لمدة 3 دقائق، نضح طاف و resuspend الخلية بيليه في 5 مل B27 المتوسطة (أ).
  5. يسحن الأنسجة مرة أخرى مع ماصة الزجاج، ثم مرتين مع مساعدة من ميكرولتر غيض من البلاستيك مرشح 1،000. تنفيذ هذا كما هو موضح في الخطوات 2.9 و 2.10.
  6. بعد الطرد المركزي الماضي، resuspend وبيليه الخلية في 2 مل كامل جامعة المدينة العالميةم (ب) ويسحن الخلايا مع 200 ميكرولتر طرف مرشح البلاستيك. لفصل كتل الخلايا المتبقية من تعليق وحيد الخلية، والسماح كتل الخلية يستقر لمدة 1-2 دقيقة.
  7. عد الخلايا وحساب العدد الكلي للخلايا اللازمة للعدوى الفيروسية. لTED التصوير استخدام 25،000 خلية لكل 10 مم ساترة.
  8. تصفيح 25،000 غير ترانسدوسيد خلايا إضافية كعنصر تحكم ينصح في هذه المرحلة.

العدوى الفيروسية

  1. نقل تعليق الخلية للعدوى الفيروسية إلى طازجة 15 مل أنبوب الصقر وأجهزة الطرد المركزي لمدة 3 دقائق في 400 ز س.
  2. نضح في وطاف resuspend الخلايا في 300 ميكرولتر المتوسطة (ب)
  3. إضافة كمية مناسبة من المعدية lentiviral TED التعبير جزيئات النواقل والسماح للأنبوب فالكون الوقوف في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة.
  4. تملأ أنبوب مع المتوسطة كاملة (ب) إلى الحجم النهائي المطلوب لتصفيح (100 ميكرولتر لكل 10 مم ساترة)، نضح المتوسطة من COVerslip، ووضع على الفور 100 تعليق خلية ميكرولتر على كل ساترة.
  5. ضع الأطباق في الحاضنة حتى استقروا جميع الخلايا أسفل (حوالي 2 ساعة) وملء بعناية حتى الأطباق حتى أنها تحتوي على 2 مل المتوسطة (ب).
  6. اسمحوا الخلايا العصبية تنمو لمدة أسبوع واحد على الأقل. استبدال 50٪ من المتوسط ​​كل أسبوع.

3. الثقافة والفيروسية إصابة الفأر الخلايا الدبقية القشرية

إعداد

  1. تبدأ من خلال إعداد المتوسطة الدبقية القاعدية (1:01 خليط من DMEM/F12 مع 10٪ FCS، 5٪ HS، 1٪ البنسلين / الستربتوميسين، 0.45٪ سكروز) وطلاء من T75 خلية قارورة الثقافة مع 4 مل 0.5 نانوغرام / مل بولي -DL-الأورنيثين هيدروبروميد (اباحي) (مخففة في 150 ملي محلول حمض البوريك، ودرجة الحموضة 8.35). بعد الحضانة عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة أو أكثر من ليلة، وغسل القارورة ثقافة الخلية ثلاث مرات مع HBSS وإضافة 18 مل بصل متوسطة الدبقية تحتوي على B27 01:50 و 10 نانوغرام / مل EGF. تتوازن القارورة ثقافة الخلية في الحاضنة (تصل إلى 3 ساعة).
<ف الطبقة = "jove_step"> تشريح

  1. ونحن أداء تجاربنا مع الفئران وفقا للمبادئ التوجيهية للاتحاد الأوروبي، كما وافقت عليها لدينا رعاية الحيوان واللجنة المؤسسية الاستخدام.
  2. تشريح الدماغ من واحد الماوس P5-P7 وإزالة الحصين والسحايا من نصفي الكرة الأرضية كما هو موضح في 2.5.
  3. تشريح القشرة الأمامية، قطع عليه إلى عدة قطع صغيرة وجمعها في أنبوب مل 1.5 التي تحتوي على HBSS. تخزين أنبوب على الجليد، والشروع في الجزء ثقافة الخلية.

خلية ثقافة

  1. نقل جميع الأنسجة من أنبوب إلى أنبوب 15 مل الصقر باستخدام النار مصقول ماصة الزجاج.
  2. أضف متوسطة بصل إلى الحجم النهائي من 5 مل ويسحن الأنسجة بواسطة pipetting عدة مرات صعودا وهبوطا مع النار مصقول ماصة الزجاج. بعد الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 3 دقائق، نضح المتوسطة، و resuspend الخلية بيليه في 5 مل متوسطة بصل.
  3. كرر الخطوة 3.5 مرتين.
  4. بعد ثيطريق الطرد المركزي، resuspend وبيليه الخلية في 2 مل بصل متوسطة الدبقية تحتوي B27 (1:50) و 10 نانوغرام / مل EGF.
  5. Titruate مرة أخرى ونقل تعليق الخلية إلى خلية معدة T75 قارورة الثقافة والسماح تنمو الخلايا لمدة 3-4 أيام.

غسل الخلايا الدبقية (بعد 3-4 أيام في الثقافة):

  1. غسل خلايا مرة واحدة مع 10 مل PBS والاستفادة بقوة أو بلطف ضرب قارورة عدة مرات مع يدك، في حين الضغط عليه ضيق في اليد الأخرى. بواسطة هذه الخطوة الحطام الخلية ومجموعات الخلايا يتم إزالتها من الثقافة.
  2. نضح في برنامج تلفزيوني وإضافة جديدة المتوسطة الدبقية القاعدية التي تحتوي B27 (1:50) و 10 نانوغرام / مل EGF. مزيد زراعة ثقافة لمدة 5-7 أيام حتى الخلايا تصل إلى 80٪ confluency.

تقسيم، تنبيغ وبذر النهائي من الخلايا الدبقية:

  1. معطف 10 ملم coverslips على مع 100 ميكرولتر بولي-D-يسين (حل الأوراق المالية: 0.1٪، مخففة 1/50 إعلان 20 ميكروغرام / مل في برنامج تلفزيوني أو HBSS)، واحتضانلهم في حاضنة أكثر من ليلة. غسل coverslips على ثلاث مرات مع HBSS وإضافة 100 ميكرولتر بصل متوسطة الدبقية. تتوازن coverslips على في الحاضنة (3 ساعة).
  2. غسل الخلايا الدبقية مرتين مع 10 مل PBS، نضح في برنامج تلفزيوني، وإضافة 3 مل التربسين (TrypLE، غير مخفف). يعرض للتريبسين الخلايا لمدة تصل إلى 1 دقيقة تنبيه: تجنب الإفراط في trypsinization. يتم فصل عادة أكثر من 80٪ من جميع الخلايا بعد 1 دقيقة وهذا يكفي أن يكون عدة ملايين من الخلايا السليمة.
  3. وقف رد الفعل من خلال إضافة 10 مل بصل متوسطة الدبقية، ونقل تعليق خلية إلى 15 مل أنبوب الصقر، أجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 3 دقائق. نضح طاف و resuspend الخلية بيليه في 5 مل بصل متوسطة الدبقية.
  4. مرة أخرى، وتدور ونضح كما هو موضح في الخطوة 3.15، ثم resuspend الخلايا في 5 مل بصل متوسطة الدبقية.
  5. نقل العدد المطلوب من الخلايا إلى أنبوب 1.5 مل. 10 4-2X10 4 خلايا الدبقية هي كافية لواحدة 10 ملم ساترة. عادة، وتعليق المجلدأوميا لتنبيغ الخلايا لمدة 4 سنوات من طبق جيدا هو أقل من 200 ميكرولتر. إضافة كمية مناسبة من lentiviral TED التعبير جزيئات النواقل إلى الخلايا واحتضان لهم في RT لمدة 10 دقيقة. ثم تملأ التعليق مع بصل متوسطة الدبقية لحجم البذر (100 ميكرولتر في ساترة).
  6. البذور 100 ميكرولتر من الخلايا المصابة في ساترة واحتضان لمدة 2 ساعة تقريبا، ثم يضاف بصل متوسطة الدبقية تحتوي على B27 1:50 و 10 نانوغرام / مل EGF إلى الحجم النهائي من 2 مل.
  7. للظروف مثالية ثقافة استخدام الخلايا للتجارب في يوم 3-7 بعد الطلاء.

4. جيل والثقافة من خط الخلية مراسل

تم تأسيس TED خطوط الخلايا مراسل على أساس هيلا، BHK21، HEK293 وSH-SY5Y. هنا نقدم بروتوكول للخلايا هيلا، ولكن لا يجوز نقل البروتوكول على أي خط الخلية الأخرى كذلك.

توليد مستقرة خط الخلية هيلا

  1. تقسيم نوع البرية هيلا خط الخلية ونقل 100،000 جells في حجم 200 ميكرولتر إلى أنبوب 1.5 مل.
  2. إضافة كمية مناسبة من lentiviral TED التعبير جزيئات النواقل إلى الأنبوب واحتضان تعليق الفيروسات خلية لمدة 10 دقيقة في RT. ثم البذور الخلايا في إجمالي حجم 2 مل المتوسطة (DMEM، و 10٪ FCS، 1٪ البنسلين / الستربتوميسين) في 30 ملم صحن واحتضان لمدة 3 أيام.
  3. بعد غسل مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني، ونضح المتوسطة وإضافة 500 ميكرولتر التربسين (TrypLE، 02:03 في برنامج تلفزيوني). احتضان لمدة تقريبا. 3 دقائق ثم وقف رد الفعل بإضافة 3 مل المتوسطة. نقل تعليق إلى 15 مل أنبوب الصقر وأجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 3 دقائق.
  4. Resuspend وبيليه الخلية في 200 ميكرولتر المتوسطة ومرة ​​أخرى تصيب الخلايا مع جزيئات lentiviral كما هو موضح في 4.2. ثم، وخلايا البذور في خلية قارورة الثقافة T25 في 10 مل المتوسطة.
  5. تنمو الخلايا حتى يتم التوصل إلى confluency من 60-80٪. ثم تقسيم الثقافة.

TED خطوط الخلايا مراسل

  1. TED خطوط الخلايا مراسل يمكن الحفاظ علىيستخدم إد في أي وسيط القياسية، مثل DMEM تحتوي على 5٪ أو 10٪ FCS و 1٪ البنسلين / الستربتوميسين.
  2. لوحة عدد مناسب من الخلايا في طبق 4 جيدا تحتوي على معقم 10 ملم coverslips على (انظر أعلاه)، على سبيل المثال من 10،000 الى 20،000 خلية لكل ساترة.
  3. تنمو الخلايا لمدة يومين على الأقل قبل استخدامها لTED التصوير.

5. التحضير لإجراء تصوير لايف في مجهر مقلوب

    1. Prewarm HEPES-قارع الأجراس لدرجة حرارة الغرفة وإضافة D-الجلوكوز.
    2. Prewarm في ACSF (دون كا 2 + والمغنيسيوم 2 +) إلى درجة حرارة الغرفة وإضافة D-الجلوكوز. تهوية ACSF مع كربوجين لمدة 5 دقائق. ثم إضافة 1 M حلول الأوراق المالية من و CaCl 2 و MgCl 2 لتركيزات النهائية 2 مم لكل منهما.
  2. بدء المجاهر التصوير الحي وجميع برامج الكمبيوتر.
  3. بدء نضح على "دمية" غرفة التصوير وتتوازن نظام أنبوب.
  4. Prewarm سخان حل المضمنة وغرفة التصوير في المرحلة المجهر. إصلاح غرفة التصوير في إدراج التدفئة.
  5. تتوازن النظام إلى 32-37 درجة مئوية قبل البدء في إجراء التحميل صبغ تنبيه: لتجنب تدفق عرضي من حل نضح في النظام المجهر نستخدم العلاقات شعر حول الأهداف وصحائف السيليكون المرنة (1MM) لحماية المسرح المجهر.

6. تحميل صبغ إما نوع من الخلايا

  1. Resuspend 1 قسامة من Fluo5N-AM (انظر 1.3) في 100 ميكرولتر حل prewarmed التصوير (HEPES-قارع الأجراس أو ACSF).
  2. ذوبان Fluo5N-AM في حلول التصوير (HEPES-قارع الأجراس أو ACSF) في sonicator حمام مائي لمدة 90 ثانية.
  3. استخدام العذبة 4 - أو 24 لوحة جيدا ونقل 400 ميكرولتر حل prewarmed التصوير لبئر واحدة. إضافة محلول الصبغة لنفس البئر للقدوم إلى 500 ميكرولتر من محلول 5 ميكرومتر.
  4. وضع بعناية ساترة مع الخلايا (على سبيل المثال10-18 ملم في القطر) في البئر، وخلايا مواجهة.
  5. احتضان لفترة مناسبة من الوقت في ثقافة الخلية الحاضنة عند 37 ° C (إعداد هذه الأثناء إعدادات التصوير في مرحلة المجهر). مرات التحميل صبغ النموذجية هي لالخلايا العصبية والخلايا الدبقية 7-15 دقيقة وخطوط الخلايا 10-20 دقيقة.

عامل هام: دوام صبغ التحميل وتركيز الصبغة تعتمد على نوع من الخلايا، كثافة الخلية، واحتياجات التجربة الخاصة! مرات حضانة طويلة في وجود الصبغة قد تضر الخلايا، الخلايا العصبية وخصوصا الابتدائي والخلايا الدبقية الابتدائي وهذا أمر بالغ الأهمية للاستجابة للمحفزات الفسيولوجية. سوف أوقات طويلة الحضانة (على سبيل المثال 30 دقيقة) تكون فقط مفيدة لER تجارب التعريب الكالسيوم للتحقيق في توزيع الكالسيوم ER في الهياكل التحت خلوية صغيرة، على سبيل المثال neurites التي غرامة أو العمود الفقري. في بعض التجارب، قد خليط من 1/3 متوسط ​​النمو مع حلول التصوير يساعد على حماية الخلايا خلال Fluo5N-AMتحميل.

  1. على الفور، نقل ساترة لثقافة أخرى الخلية التي تحتوي كذلك حل التصوير (HEPES-قارع الأجراس أو ACSF) والبدء في تركيب الخلايا في غرفة التصوير.

7. ER-الكالسيوم يعيش التصوير خلية مع ليزر متحد البؤر المجهر الضوئي مقلوب

  1. استخدام فرشاة الطلاء لتطبيق الشحوم فراغ عالية إلى غرفة التصوير. وهناك حاجة إلى يحملق الشحوم ساترة على الجزء السفلي من غرفة نضح. نحن نستخدم غرف التصوير عصامي لمدة 10-12 ملم coverslips على مع حجم صغير، مما يسمح بسرعة نضح عالية تصل إلى تبادل العازلة 15 أضعاف في الدقيقة الواحدة. غرفة التروية المتاحة تجاريا لمدة 18 ملم coverslips على ذلك، قد يتم شراؤها من وارنر الصكوك (RC-49FS). تمكن هذه القاعة أيضا التحفيز مجال الخلايا العصبية.
  2. التقط ساترة مع الخلايا Fluo5N محملة وإضافة قطرة صغيرة من محلول التصوير (50-100 ميكرولتر) على الخلايا للحفاظ على الخلايا مغطاة حلول التصوير.تحويل ساترة رأسا على عقب وتركيب الخلايا في غرفة التصوير. للضغط على ساترة في السيليكون الغراء، واستخدام القطن برعم (مثل Q-نصائح).
  3. يمسح العازلة المتبقية من الجزء السفلي من الزجاج ساترة مع براعم القطن تنبيه: مسح دقيق بعيدا الرطوبة المتبقية عند استخدام موضوعية النفط مع الفتحة العددية عالية عالية الدقة التصوير. من الأفضل إزالة الملح المتبقية عن طريق المياه. قد تتم إزالة لطخة عرضية من الشحوم مع الأسيتون أو الإيثانول النقي.
  4. صرف "زائف" غرفة التصوير مع غرفة التصوير التجريبية. غسل الخلايا لمدة 5-10 دقيقة عن طريق نضح المستمر.
  5. غسل الخلايا لمدة 5 - 10 دقيقة بواسطة نضح المستمر.
  6. لتحديد الخلية تستخدم كمية اقل من الليزر والإضاءة، وارتفاع معدلات المسح الضوئي (2-4 هرتز)، حجم صورة صغيرة، وتحقيق مكاسب عالية.
  7. تنبيه: لتحديد الخلايا Fluo5N المسمى لا تستخدم الزائدة من إضاءة الضوء أو مباشرة مع epifluorescenر ضوء. إضاءة ساطعة من Fluo5N/Ca 2 + المجمعات يتسبب في فقدان كامل للمضان ER-محددة في غضون 2-4 ثانية (الشكل 5).
  8. إعداد المجهر وفقا لتجربة المخطط لها. للتوجيه، وتعطى إعدادات ممثل للتصوير مع مختلف نواقل TED في الجدول 1. ليزر متحد البؤر المجهر المقلوب، ونحن نستخدم أوليمبوس IX81 المجهر جنبا إلى جنب مع 1000 نظام Fluoview متحد البؤر التي هي مجهزة تجهيزا مع ليزر الصمام الثنائي (473 نانومتر، 15 ميغاواط؛ 559 نانومتر، 20 ميغاواط) ونظام للكشف عن الطيفية.
  9. في بداية المستند التجربة الخلايا من الفوائد بنسبة عالية الدقة X، YZ مداخن صورة.
  10. أداء X، YT التصوير لرصد ديناميات الكالسيوم ER تحت ظروف تجريبية معينة. يتم سرد الإعدادات النموذجية لنظامنا في الجدول 2.
  11. رصد التغيرات في الكالسيوم ER تحت نضح المستمر مع حلول التصوير. نموذجي أسعار الصرف العازلة والبريدxemplarily: (أ) غسل الخلايا ومخزن استنفاد بواسطة SERCA كتلة: 1.5 مل / دقيقة، (ب) ATP / DHPG التحفيز: 3 مل / دقيقة.
  12. الحصول على الصور الرقمية بشكل تفضيلي مع 12 بت (4096 قيم الرمادي). للتصوير موازية من Fluo5N/Ca 2 + وطلب تقديم العروض والصور 8 بت (256 القيم الرمادي) تنقذ النظام من تجاوز البيانات.
  13. تخزين يعيش مرة سلسلة الصور الخلية (س، YT) أو مداخن صورة 3D (X، YZ) (للتوزيع الخلوية من Fluo5N/Ca 2 + المجمعات) في تنسيق متوافق يماغيج (مثل TIFF).

8. معالجة الصور وتحليل البيانات

  1. فتح المكدس الصورة في برنامج يماغيج. في حالة متعدد الألوان والتصوير، وتقسيم قنوات RGB عندما سئل من قبل يماغيج.
  2. تحديد المنطقة الخاصة بك (ق) من الفائدة (ROI) من خلال دراسة متأنية من مداخن صورة (على سبيل المثال مع مساعدة من كثافة مقابل الوقت المؤامرة)
  3. استخدام البرنامج المساعد محلل السلاسل الزمنية أن أتلو متوسط ​​كثافة بكسل في العائد على الاستثمار (F الخام). Dependinز عن قصد، ورسم رويس حول إما ER كاملة أو مناطق صغيرة من مثل ER ER من التشعبات من المناطق خلية الطرفية. وتشمل أيضا 1-3 العائد على الاستثمار في المناطق دون خلايا لخلفية الطرح.
  4. حساب متوسط ​​مضان الخلفية (F ب) عن طريق حساب قيمة مضان متوسط ​​العائد على الاستثمار الخلفية وطرح F قيمة الخلفية ب من القيم الخام F للحصول على قيمة العائد على الاستثمار F.
  5. حساب F 0، والذي هو مضان القاعدية من الخلايا، عن طريق حساب القيمة المتوسطة من عشرة إلى 30 القيم الفلورسنت لكل ROI في حالة الراحة.
  6. حساب التغيرات النسبية، تصحيح الخلفية في مضان من قبل ΔF / F 0 بواسطة الصيغة التالية:

المعادلة 1

  1. التغيرات النسبية في الوقت الحاضر يتألقNCE بوصفها تتبع مع ​​ΔF / F 0 لصالح العمودي والوقت لمحور X.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يوفر هذا البروتوكول نهجا غير التخريبية للتصوير مباشرة من حر ER الكالسيوم. انخفاض تقارب الاصطناعية كا 2 + يتم الافراج المؤشرات والمحاصرين في التجويف ER مع مساعدة من ER المستهدفة، المؤتلف نشاط انزيم استريز. تحسين التحميل من كا 2 + الأصباغ مؤشر إلى ER التجويف تمكن التصوير المباشر والسريع من ER ديناميات مخزن الكالسيوم.

أنواع الخلايا لTED

وقد تبين جدوى الأسلوب في خطوط الخلايا BHK21، HEK293 34، هيلا 17، SH-SY5Y، مثقف الخلايا النجمية والخلايا العصبية قرن آمون 8،40 والقشرية الأولية 8،34،41. في تجاربنا، TED يعمل بشكل جيد عندما يتم التعبير عن بنيات TED ثابت، تفضيلي عن طريق تعطيل الذاتي ناقلات lentiviral 37،39 باستخدام المروج ضعيفة نسبيا (مثل المروج اليوبيكويتين) 35. أخرى، هي أقوى المروجين قيد التحقيق.

SS = "jove_step"> ER-خصوصية التسمية TED

ناجح TED التحميل مع Fluo5N يقدم تلطيخ واضحة ومشرقة من التجويف ER، والذي يدخر من المنطقة النووي 34،41. في الولايات يستريح، وFluo5N/Ca 2 + التسمية المعقدة يمثل توطين الكالسيوم عندما ملزمة Fluo5N، وبالتالي، فإنه يمثل التوزيع الإقليمي من الكالسيوم الحرة في التجويف ER. في الشكل (6) والصور متحد البؤر من Fluo5N/Ca 2 ترد + المجمعات والتسميات تاج RFP-T2 من الأحمر CES2 في خلايا هيلا، النجمية القشرية والخلايا العصبية قرن آمون. الشكل 6C يكشف الفلورسنت كا 2 + مجمع المؤشر في الخلية الجسم وكذلك neurites التي من الخلايا العصبية قرن آمون. وهذا يتيح دراسة كا 2 + إشارات في عمليات صغيرة إلى حد ما (انظر أيضا 34،35).

هناك حاجة إلى بعض الخبرة للتمييز بين التسمية ER نموذجية من تسمية عصاري خلوي التي سيتم وحظ عرجتلف الخلايا N أو غير صحية. عصاري خلوي، الاسترات الذاتية الإفراج أيضا Fluo5N، الأمر الذي يؤدي إلى تلطيخ مشرق جدا من العصارة الخلوية ونواة عندما الكالسيوم يتسرب من خلال غشاء البلازما. تلطيخ عصاري خلوي من Fluo5N/Ca 2 + لوحظ أيضا عندما يتم التعامل TED-صفت الخلايا مع ionomycin حامل الأيون، في وجود الكالسيوم خارج الخلية (الشكل 7).

التصوير المباشر لإطلاق الكالسيوم من ER

واحد اهم تطبيقات TED هو التصور المباشر من ER مخزن نضوب 17،34. في الشكل 8، وتبين لنا التجربة ممثل واحد يقوم مع الخلايا العصبية الحصين، معربا عن الأحمر CES2. الخلايا العصبية مع الأحمر CES2 تخصيب كميات عالية من Fluo5N في المنطقة محيط بالنواة (الأسهم في الشكل 8). عندما يتم تطبيق SERCA مانع CPA من قبل التروية، لوحظ الاستنفاد السريع للمخزن الكالسيوم ER (8B الشكل). نحن هنا تقديمالقيم الخام (المحور الصادي) التي يتم الحصول عليها عندما يتم تصوير الخلايا العصبية مع 12 بت. يتم سرد ظروف التصوير في الجدول 2. لاحظ تغييرا هائلا في متوسط ​​كثافة مضان في العائد على الاستثمار الذي لوحظ عند تطبيق TED إلى الخلايا العصبية. لتجارب أخرى تحليل الافراج الكالسيوم في الخلايا العصبية ER باستخدام TED، نود الإشارة إلى التجارب السابقة، التي سبق مناقشتها بالتفصيل 8،34،35. باختصار، يتم استخدام TED في الخلايا العصبية في المختبر لتصور ER مخزن الكالسيوم حساسة SERCA بقدر كبير من التفصيل من قبل مقلوب ليزر متحد البؤر المجهر 8،34 وطبق بنجاح للتصوير سريع (15 هرتز) من mGluR1 / 5 يسببها IiCR 34.

ويبين الشكل 9 تجربة نموذجية مع الخلايا النجمية القشرية الماوس في المختبر، تحفزها 200 ميكرومتر ATP من خلال نظام نضح في دقة منخفضة باستخدام الهدف 20X المياه. بعد الإصابة lentiviral، الخلايا هو موضح هنا وأعرب الأحمرCES2، التي يقودها المروج اليوبيكويتين. سرعة المسح كان ~ 2 هرتز وكلتا القناتين (Fluo5N/Ca 2 + والبروتين الانصهار الأحمر CES2) تم تصويرها في وقت واحد (في الخط). في بداية التجربة أظهرت الخلايا الدبقية عدوى جيدة مع بنيات التعبير وجار جيد مع Fluo5N-AM. ويسلط الضوء على رويس التي تم تحليلها في الشكل 9A. تم تعيين واحد ROI لقياس الخلفية مضان (BG)، ROI 1-2 قياس مضان من الخلايا كاملة، وعائدات الاستثمار 3 يغطي فقط ER من الخلية واسترعي ROI 4 حول المجال البصري كاملة. بعد وقت قصير من التحفيز مع ATP ومضان من Fluo5N/Ca 2 + المجمعات انخفض فجأة إلى أسفل بسبب كا 2 + بيان من لائحة. وأخيرا، يتم ملء ER جزئيا مع الكالسيوم مرة أخرى. في وقت واحد، ومضان من RFP يقلل بشكل مستمر نتيجة لتبيض طفيف (الشكل 9B، اللوحة السفلى). آثار التغيرات تمثل في fluoresc كثافة جزأين (الشكل 9C) نقطة إلى الحرمان من المهم TED. في العديد من التجارب (وليس كل) يتم فقدان كميات عالية من Fluo5N المجمعات خلال التحفيز. ونتيجة لذلك، فإن القيم مضان لا يعود إلى المستوى الأولي كثافة مضان.

ويبين الشكل 10 أ CES2 المصابة BHK21 الخلية بدقة عالية، وصفت من قبل Fluo5N/Ca 2 + وحفز مع ATP. خدم BHK21 الخلايا كنظام نموذج الخلية في وقت مبكر للتحليل الكالسيوم ER 31. لاحظ أن إطلاق الكالسيوم ER ومخزن إعادة تعبئتها هو تصور في الهياكل الدقيقة من الأنابيب ER. تم تصوير الهياكل في سرعة بطيئة (~ 0.2 هرتز)، مع 512 X 512 بكسل، ومتجدد الهواء القرص 1 الإعداد للذات الثقب متحد البؤر، مع وجود الهدف النفط 63X.

"/>
الشكل 1. ويتسبب محة عامة عن ER إشارات الكالسيوم. إطلاق الكالسيوم ER عبر قنوات "تسرب" مثل المسام intramembrane ER معقدة Sec61. مستقبلات البروتين يقترن G-(GPCR) تحفيز IP 3 الإنتاج، والذي يسبب ثم الافراج IP الكالسيوم 3 التي يسببها (IiCR). لمست إطلاق الكالسيوم من ER المجمعات STIM ويؤدي دخول الكالسيوم المخزن التي تديرها (SOCE) من خلال القنوات الأيونية من عائلة التربتوفان و / أو قنوات الكالسيوم Orai. قنوات الكالسيوم الجهد بوابات (كا V) توسط بسرعة الافراج عن الكالسيوم الكالسيوم التي يسببها (CICR) بواسطة ryanodine المستقبلات (RYR) إما عن طريق التفاعل المباشر البروتين (العضلات والهيكل العظمي) أو التفاعل الفسيولوجية (خلايا عضلة القلب، الخلايا العصبية). فقدان ER الكالسيوم هو انقاذ حيوي بفعل المضخة SERCA (الهيولى العضلية-هيولي باطني شبكية أتباز الكالسيوم).

res.jpg "SRC =" / files/ftp_upload/50317/50317fig2.jpg "/>
الشكل 2. المبدأ الموجه الذي استريز التي يسببها صبغ التحميل (TED). من overexpression المستهدفة من إستيراز الكربوكسيل يوفر النشاط استريز عالية (CES2) في ER. واستريز تحويل acetoxymethylester صبغ Fluo5N-AM إلى الكالسيوم الحساسة، صبغة الفلورسنت التي لا تزال المحاصرين في ER. Fluo5N يحتوي على نسبة منخفضة تقارب لأيونات الكالسيوم. لذلك، في ظل ظروف يستريح، تتشكل الفلورسنت Fluo5N/Ca 2 + المجمعات تفضيلي في ER، حيث تركيز الكالسيوم ما يقرب من 1،000 أضعاف مما كانت عليه في العصارة الخلوية.

الشكل (3)
الشكل (3). ممثل TED يبني ناقلات CES2.: النسخة الأصلية من الماوس CES2. CES2 الأراضي الفلسطينية المحتلة (43): إيهووقع تبادل لإشارة الببتيد وتشمل الآن إنترون، في حين تم تغيير عزر الاحتفاظ ER إلى الكلاسيكية الاحتفاظ KDEL-ER وعزر استرجاع من البروتينات القابلة للذوبان ER. يوفر العلامة MYC حاتمة للكشف عن البروتين بواسطة الوسم المناعي غير المباشر وتحليل لطخة غربية. الحمراء CES2 8،43: تمت إضافة بروتين أحمر فلوري مباشرة وراء الببتيد إشارة aminoterminal. وقد تم إدخال رابط الجلايسين-سيرين لإنشاء المفصلي مرنة بين RFP وعنصر CES2: أحمر LK CES2 43.

الشكل 4
الشكل 4. تدفق العمل للتصوير الكالسيوم ER مباشرة باستخدام TED. تعليق خلية من الخلايا الأولية أو خطوط الخلايا يتم ترانسدوسيد مع فيروس يحتوي على بناء التعبير TED. ثم هي المصنفة الخلايا على coversliPS. عند استخدام بنيات RFP-CES2، ترانسدوسيد يمكن تحديد الخلايا باستخدام مضان أحمر. يتم تنفيذ الهدف-استريز التي يسببها صبغ التحميل التي يحتضنها الخلايا في محلول يحتوي على التصوير AM-إلى جانب انخفاض تقارب كا 2 + المؤشر، مثل Fluo5N-AM أو ماج-Fura2-AM. يتم إجراء التصوير الكالسيوم ER مع ليزر مقلوب المجهر الضوئي (انظر البروتوكول) أو أي جهاز التصوير المتوافقة الأخرى. خلال التصوير الحي الخلايا تحت نضح مستمر مع حلا التصوير مثل الاصطناعي السائل النخاعي (ACSF). يتم تنفيذ التحفيز خلية إما عن طريق نضح أو عن طريق الضغط المحلي طرد.

الرقم 5
الشكل 5. إضاءة epifluorescence قوي يدمر التسمية ER-محددة TED Fluo5N في غضون ثوان. صور الممثل من شريط فيديو، تصوير مع المجهر تستقيم التصوير. هنا، الخلايا الدبقية EXPRessing RFP-CES2 كانت محملة Fluo5N-AM. الأول تم الكشف عن مضان أحمر من الخلية المصابة مع كاميرا CCD. وفي وقت لاحق، كانت مضاءة Fluo5N/Ca 2 + إشارة مع مصدر ضوء LED. لتوطين ER اضحة الأولي من Fluo5N/Ca 2 + المجمعات (الأسهم الصفراء) يتم إتلاف بسرعة عن طريق إضاءة قوية مع 470 مصدر ضوء LED والتحول في توزيع مضان تصبح مرئية في المجال النووي (الأسهم الصفراء، 12.46 ثانية).

الشكل (6)
الشكل (6). TED التحميل مع Fluo5N-AM في أنواع مختلفة من الخلايا لوحة العلوي:. خلايا هيلا مع مستقرة التعبير RED-CES2 لوحة الأوسط:. النجمية القشرية بعد تنبيغ lentiviral مع الأحمر CES2 اللوحة السفلى:. الخلايا العصبية قرن آمون مع RED-CES2 في DIV 8. ومثقف جميع خلايا coverslips على وملطخة Fluo5N-AM كما هو موضح في المقطع الأسلوب. أيضا تمثل Fluo5N/Ca 2 + التسمية توطين الكالسيوم وعندما يرتبط Fluo5N. شريط مقياس 40 ميكرون.

الرقم 7
الرقم 7. Fluo5N صبغ في العصارة الخلوية تصبح مرئية بعد العلاج ionomycin. أصيب الخلايا الدبقية مع الأحمر CES2، وصفت مع Fluo5N-AM، وتعامل مع thapsigargin SERCA محصر إلى استنزاف الكالسيوم ER. التي يسببها العلاج Ionomycin تدفق قوي من الكالسيوم خارج الخلية. (لوحة العلوي) خلايا تظهر زيادة كبيرة في Fluo5N/Ca 2 مضان + بوساطة. (اللوحة السفلى) ويبلغ متوسط ​​كثافة صورة الإسقاط من Fluo5N/Ca 2 + التسمية يكشف عن وضع العلامات عصاري خلوي نموذجي من قبل مجمع الكالسيوم الفلورسنت السهم الأزرق: A الخلية المسمى الزاهية يشير إلى أن هذه الخلية لديه كميات عالية من الكالسيوم في اله العصارة الخلوية. ويفترض، تلف هذه الخلايا سهم بنفسجي: تصبح الخلايا الزاهية المسمى في العصارة الخلوية على العلاج ionomycin.

الرقم 8
الرقم 8. ER نضوب مخزن الكالسيوم في الخلايا العصبية من خلال منع SERCA. (A) الخلايا العصبية قرن آمون (DIV 9) صريحة الحمراء CES2 (A، أحمر) ويطلق عليها مع Fluo5N-AM (A، أخضر). السهام تشير إلى خليتين تحليلها. صورة (كحد أقصى الإسقاط كثافة) هو عنصر اقتصاص من الفأس، YZ-الصورة التي تم الحصول عليها في بداية التجربة. (B) آثار الخام تمثل ER نضوب مخزن الكالسيوم بعد نضح مع 30 ميكرومتر CPA. وقد اتخذت هنا 1،000 الصور مع 1 هرتز و 12 بت. القيم الخام من كثافة مضان يعني في العائد على الاستثمار (المحور الصادي) من الخلايا جهازي المبينة في (أ) هيتآمر على مر الزمن (الأحمر والأزرق التتبع). القيم الخلفية (تتبع السوداء) تظل ثابتة. AU = وحدات التعسفي من القيم الرمادية التي تمثل كثافة مضان.

الرقم 9
الشكل 9. أصيب إطلاق الكالسيوم ER على ATP تنشيط الخلايا الدبقية. الخلايا الدبقية مع الأحمر CES2 ومحملة كا 2 + مؤشر Fluo5N-AM. وحفز الخلايا مع 200 ميكرومتر ATP عن طريق نضح لمدة 10 ثانية. (A) وصفت الخلايا الدبقية معربا الأحمر CES2 (وسط) مع Fluo5N-AM (يسار). ويسلط الضوء على رويس. (B) الصور واحدة المستخرجة من تسلسل الوقت الفاصل. (لوحة العلوي) كثافة مضان عالية في 0 ثانية و 71 ثانية قبل الرد الخلايا. فإنه يسقط فجأة (80 ثانية) ويصل الحد الأدنى في 86 SEج، قبل أن يرتفع مرة أخرى (160 ثانية)، والكالسيوم وضخها في عروق ER. (اللوحة السفلى) كثافة مضان من RFP يقلل ببطء وبشكل مستمر مع مرور الوقت نظرا لتبيض. (C) التوقيت آثار تظهر ΔF / F 0 قيم أشار رويس في A. ومضان، مما يدل على تركيز الكالسيوم، يسقط باستمرار بعد ATP التحفيز ويتعافى جزئيا. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

الرقم 10
الشكل 10. تم تحميلها التصوير عالية الدقة من إطلاق الكالسيوم ATP التي يسببها في BHK21 الخلايا. خلايا مع Fluo5N-AM وتصويرها في وجود الكالسيوم خارج الخلية. (A) سلسلة صورة تظهر التغييرات في انفلونزاo5N/Ca 2 + المستمدة مضان خلال ATP-التحفيز. (B) يشير متوسط ​​صورة الإسقاط كثافة على رويس معروضة في C. يتم تحليل (C) ATP الناجم عن إطلاق الكالسيوم وإعادة تعبئتها من مخزن الكالسيوم ER في مناطق فرعية صغيرة من ER. آثار وتمثل التغييرات في مضان.

الإثارة ليزر [نيوتن متر] اكتشاف مجموعة [نيوتن متر]
TED مع الأحمر CES2 يبني ناقلات
473 (Fluo5N/Ca 2 +) 507-545
559 (TAG-RFP-T2) > 570
TED مع CES2 يبني ناقلات فقط
473 نيوتن متر (Fluo5N/Ca 2 +) > 507

الجدول 1. إعدادات كاشف الطيفية.

تجربة نضوب ER باستخدام الأحمر CES2 تحفيز الخلايا العصبية باستخدام بناء CES2 قرار مكانية عالية والتصوير، وCES2
الهدف (NA) 20x والمياه (0.7) 20x والمياه (0.7) النفط oil/63x 40X (≥ 1،3)
473 نانومتر ليزر
قوة 1٪ 1٪
HV A 600-780 600-780 400-780
كسب B 0-1٪ 1-2٪ 0٪
عوض 0 0 0
559 نانومتر ليزر
قوة 1٪ OPTIOnalC optionalC
HV A 600-780 optionalC optionalC
كسب B 0-1٪ optionalC optionalC
عوض 0 optionalC optionalC
سرعة المسح الضوئي 1-2HZ تشغيل الخطوط تشغيل الخطوط
حجم الصورة 320x320 بكسل 240X240 بكسل 512X512 بكسل
مسح نوع في خط ثنائية الاتجاه Nyquistcriterion (2 بكسل / عنصر)
تنبيه 100-200 ميكرومتر ATP :5-15 ثانية؛ 200-500 الغلوتامات ميكرومتر ل5-15 ثانية 100-200 ميكرومتر ناهض: 5-15 ثانية
الثقب 2-5 أقراص مهواة 2-5 أقراص مهواة 1 أسطوانة مهواة

الجدول 2. أمثلة من إعدادات المجهر وفقا لنوع من التجربة A:. HV = الحالي إلى كاشف مضخم، B: كسب = التضخيم للإشارة PMT، C: اختياري: قناة مجاني للاستخدام مع غيرها من الأصباغ الفلورية الحمراء (على سبيل المثال CMX-روس لتصور إمكانات الميتوكوندريا) أو البروتينات الفلورية الحمراء الأخرى.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وقد نوقشت مزايا وعيوب الأسلوب TED على نطاق واسع في المنشورات الحديثة 34،35. بالمقارنة مع الطرق الأخرى المذكورة أعلاه، TED تلتف مشكلة تعطيل وperfusing الخلايا. وعلاوة على ذلك، لا بد من التأكيد على جانبين. مبدأ TED لER الكالسيوم التصوير يتطلب (1). التعبير المستهدفة من إستيراز الكربوكسيل النشطة في التجويف ER بمساعدة TED ناقلات بنيات و (2.) الإفراج كفاءة وتفضيلية من الاسعار المنخفضة للتقارب الاصطناعية AM-استرات الأصباغ الكالسيوم في التجويف ER.

1. TED ناقلات يبني

يلخص الشكل (3) تطوير TED ناقلات بنيات. وقد وضعت TED على أساس البروتينات الأسرة CES (EC 3.1.1.1). هذه البروتينات يقيمون الأعضاء في التجويف ER. لفي المختبر يدرس إدارة المؤتلف للبروتينات CES يعمل بشكل أفضل بعد التعبير المستقرة للالبروتين أو بعد العدوى الفيروسية مع مستويات التعبير معتدلة. في الوقت الحاضر، ومن غير المعروف ما إذا كانت البروتينات الأخرى مع النشاط استريز يمكن أن تحل محل البروتينات CES لTED التصوير. فمن غير المستحسن استخدام ترنسفكأيشن عابرة من ناقلات TED لتحليل الكالسيوم ER الحيوية لأن الخلايا هي أقل استجابة بعد إجراء ترنسفكأيشن. البروتينات CES تحتاج السليم استهداف لER التجويف وهذه الخطوة تحتاج إلى انشقاق كفاءة من الببتيد إشارة ER. وبالإضافة إلى ذلك، يتم بوساطة الاحتفاظ بها واسترجاعها من البروتينات CES في التجويف بواسطة ER بهم aminoterminal KDEL مثل عزر. قد تكون مشبعة هذه الآليات عندما يتم إنتاج مستويات التعبير عالية من قبل ناقلات TED بعد ترنسفكأيشن عابرة. هذا قد يؤدي إلى توطين كاذبة للبروتينات CES ويدعم تشكيل المجاميع البروتين.

2. انخفاض تقارب كا 2 + مؤشرات لTED

ويتسبب العيب أهم من TED بواسطة قيود من جدوىالأصباغ مؤشر قادرة على تحليل غير المدمرة للER الكالسيوم. التصوير الكالسيوم ER مع TED يتطلب الأصباغ مؤشر مع ارتفاع K D (يعني تقارب منخفضة) ومضان منخفضة في غياب الكالسيوم. مستندة على تجربتنا Fluo5N-AM يعمل بشكل أفضل، ولكن هذه الصبغة مؤشر ليس مقاوما للمواد التبييض. انخفاض تقارب كا 2 + تم اختبار أيضا مؤشرات ماج-Fura2-AM (K D ~ 25-50 ميكرومتر) 34 وماج-Fluo4 (K D ~ 20-25 ميكرومتر). يتم تحميل كل الأصباغ بشكل جيد في الهياكل ER بواسطة TED، ولكن الخطر من إنتاج "إشارات متضاربة" على التحفيز الإفراج ER عالية. A "إشارة مختلطة" يمثل أول زيادة سريعة من مضان في العصارة الخلوية تليها بإنخفاض قدره مضان في ER. للتغلب على هذا القيد، قد النهج التخريبية للتصوير الكالسيوم ER مساعدة 32،35. MAG-Fluo4 (K D ~ 20-25 ميكرومتر) يبين تسمية TED بوساطة قوية من صهاريج جولجي، والتي هي أقل وضوحا عندما Fluo5N-أناق المستخدمة.

التطبيقات وجهات نظر

هنا علينا أن نركز على الليزر معكوس المسح تحليل متحد البؤر من ER الكالسيوم ديناميكية مع TED. ويمكن أيضا أن تتكيف القياسات TED إلى أي نظام متحد البؤر معيار أو نظام اسعة المجال مع المصدر المناسب الإثارة (ليزر، LED، ومصابيح المعدنية حالد، مستوحد اللون) والفلاتر ونظام الكشف عن مضان 6.

TED يكون مفيدا بشكل خاص في تلك الخلايا التي لا تعبر كافية عن النشاط CES الذاتية في ER. لاحظنا أن مثل خلايا BHK21 توفير النشاط استريز الذاتية كافية في ER للافراج عن مؤشرات تقارب منخفضة. في أيدينا، وهذا ليس هو الحال مع العديد من خطوط أخرى الخلية (HEK293، SH-SY5Y، هيلا، PC12)، الدبقية الأولية، والخلايا العصبية الأولية. هنا، تمكن طريقة TED ناجحة غير التخريبية التحميل صبغ إلى ER.

يجوز المستقبل TED ناقلات مدى تطبيقه من لائحة التجويف إلىالمقصورات التحت خلوية أخرى أو microdomains الخلوية. مبدأ طريقة TED مستقلة عن صبغ المؤشر، وبالتالي يمكن استخدامها مع AM-استر من أي صبغة، على سبيل المثال للتصوير ديناميات درجة الحموضة داخل الخلايا. مؤخرا، وصف مختبر لوقا D. LAVIS أن المؤتلف الخنزيري استريز الكبد (PLE) CES1 يشكل انتقائية الزوج استريز استر مع الأصباغ cyclopropylester 42. تم العثور على وكلاء Cyclopropylester لتكون مقاومة للتحلل المائي من قبل الاسترات الذاتية وإماطة اللثام انتقائية من قبل النشاط CES المؤتلف تمكين الخلية جزيء محددة تستهدف 42. سيكون من المثير للتحقيق في ما إذا كانت المؤشرات الكالسيوم مستندة على أن التقنية الجديدة من شأنها تحسين نوعية تستهدف التحت خلوية من المؤشرات الاصطناعية.

TED يعمل بشكل أفضل في خطوط الخلايا عندما يتم التعبير عن البروتينات TED ثابت. ومن شأن إنشاء مجموعة مستقرة مع خطوط الخلايا TED يكون مفيدا.

TED نماذج الماوس المعدلة وراثيا هي أيضا الهدف الرئيسي من عملنا وهذا سيمكن TED في الاستعدادات الأنسجة محددة من الدوائر العصبية محددة، الهيكل العظمي والعضلات والقلب، أو التحضير لنظام الأوعية الدموية. وهذا نموذج الفأر تساعد على نقل تحليل ديناميات الكالسيوم ER من المستوى الخلوي إلى أكثر السياق الأنسجة الفسيولوجية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

Acknowledgments

وقد تم دعم هذا العمل من المنح المقدمة من جمعية الألمانية للبحوث (DFG) BL567/3-1 وفريدريش باور شتيفتونغ. ونود أن نشكر روجر تسين Y.، معهد هوارد هيوز الطبي المختبرات في جامعة كاليفورنيا، سان دييغو لتزويدنا تاج RFP-T2. ونحن نعترف لله الحمد ديفيد بالتيمور، معهد كاليفورنيا للتكنولوجيا في باسادينا، وديدييه Trono، جامعة جنيف، جنيف، لتقديم لنا lentiviral البلازميدات FUGW، وpsPAX2/pMD2.G.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(S)-3,5-DHPG (Dihydroxyphenylglycine) Tocris 0805
5';-ATP-Na2, ATP disodium salt hydrate Sigma A26209-1G
B-27 supplement,50x Invitrogen 17504-044
Carbamoylcholine chloride (Charbachol) Sigma C4382-1g
Cyclopiazonic acid (CPA) Ascent scientific Asc-300
Dimethylsulfoxide (DMSO) Sigma D2650
DMEM with Glutamax Invitrogen-Gibco 31966-047
Dulbecco's PBS without Ca/Mg 1x PAA H15-002
Fetal calf serum Invitrogen-Gibco 10270-106
Fluo-5N-AM, 10 x 50 μg Invitrogen F14204
Glutamate Ascent scientific Asc-049
Glutamax Invitrogen 35050-038
Ham's F12 nutrients mixture Invitrogen-Gibco 21765-029
Hank's BSS(1x) without Ca,without Mg, with Phenol Red, HBSS PAA Laboratories H15-010
Horse serum SHD3250YK Linearis
Ionomycin Ca2+ salt Ascent scientific Asc-116
murine EGF PreproTech 315-09
N2 supplement 100x Invitrogen 17502-048
Neurobasal medium Invitrogen-Gibco 21103-049
Pluronic F127, low UV absorbance,2g Invitrogen P6867
Poly-DL-ornithine hydrobromide PORN Sigma P8638
Poly-D-lysine hydrobromide Sigma P7280
Poly-L-Lysin Sigma P2636
Thapsigargin Calbiochem 586005-1mg
TryLE Express Invitrogen 12605-028
Trypsin Worthington LS-003707
Trypsininhibitor from Glycine MAX (soybean) Sigma T6522
Materials
Confocal system: inverted laser scanning microscope: FV1000 with IX81 Olympus user-specific configuration
Confocal system: laser combiner FV10 and diode lasers (405, 473, 559, 635) Olympus user-specific configuration
Confocal system: scan head FV10-SPD with spectraldetector Olympus user-specific configuration
Heater controller TC-344B Warner Instruments 64-0101 to control in line solution heater
NIH ImageJ software WS Rasband, ImageJ, US National Institutes of Health, http://rsb.info.nih.gov/ij/, 1997--2006
Objective: UAPON20XW340 NA 0,7 WD 0,35 Olympus N2709100
Objective: UPLFLN40XO Olympus N1478700
Objective: UPLSAPO60XO/1.35, WD=0.15 Olympus N1480700
Perfusion chamber, inverse custom-made
Perfusion chamber, RC-49FS Warner Instruments W4 64-1709
Perfusion tube: PT-49 Warner Instruments 64-1730 for perfusion
Peristaltic pump MiniPlus 3 (4 channels) Gilson n.a. perfusion pump
Single inline solution heater SH-27B Warner Instruments 64-0102 controlled by heater controller
Suction tubes: ST3R Warner Instruments 64-1407 for perfusion
Heating insert: Tempocontrol 37-2 digital 2-channel Pecon n.a.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Berridge, M. J., Bootman, M. D., Roderick, H. L. Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 4, 517-529 (2003).
  2. Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. The versatility and universality of calcium signalling. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 1, 11-21 (2000).
  3. Agulhon, C., et al. What is the role of astrocyte calcium in neurophysiology. Neuron. 59, 932-946 (2008).
  4. Augustine, G. J., Santamaria, F., Tanaka, K. Local calcium signaling in neurons. Neuron. 40, 331-346 (2003).
  5. Berridge, M. J. Neuronal calcium signaling. Neuron. 21, 13-26 (1998).
  6. Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging calcium in neurons. Neuron. 73, 862-885 (2012).
  7. Neher, E., Sakaba, T. Multiple roles of calcium ions in the regulation of neurotransmitter release. Neuron. 59, 861-872 (2008).
  8. Jaepel, J., Blum, R. Capturing ER calcium dynamics. European Journal of Cell Biology. 90, 613-619 (2011).
  9. Verkhratsky, A. Physiology and pathophysiology of the calcium store in the endoplasmic reticulum of neurons. Physiological Reviews. 85, 201-279 (2005).
  10. Burdakov, D., Petersen, O. H., Verkhratsky, A. Intraluminal calcium as a primary regulator of endoplasmic reticulum function. Cell Calcium. 38, 303-310 (2005).
  11. Streb, H., Irvine, R. F., Berridge, M. J., Schulz, I. Release of Ca2+ from a nonmitochondrial intracellular store in pancreatic acinar cells by inositol-1,4,5-trisphosphate. Nature. 306, 67-69 (1983).
  12. Choi, J. H., Ryu, S. H., Suh, P. G. On/off-regulation of phospholipase C-gamma 1-mediated signal transduction. Advances in Enzyme Regulation. 47, 104-116 (2007).
  13. Clapham, D. E. TRP channels as cellular sensors. Nature. 426, 517-524 (2003).
  14. Cahalan, M. D. STIMulating store-operated Ca(2+) entry. Nature Cell Biology. 11, 669-677 (2009).
  15. Soboloff, J., Madesh, M., Gill, D. L. Sensing cellular stress through STIM proteins. Nature Chemical Biology. 7, 488-492 (2011).
  16. Erdmann, F., et al. Interaction of calmodulin with Sec61alpha limits Ca2+ leakage from the endoplasmic reticulum. The EMBO Journal. 30, 17-31 (2011).
  17. Schäuble, N., et al. BiP-mediated closing of the Sec61 channel limits Ca(2+) leakage from the ER. The EMBO Journal. , (2012).
  18. Park, M. K., Choi, Y. M., Kang, Y. K., Petersen, O. H. The endoplasmic reticulum as an integrator of multiple dendritic events. The Neuroscientist : a review journal bringing neurobiology, neurology and psychiatry. 14, 68-77 (2008).
  19. Cooney, J. R., Hurlburt, J. L., Selig, D. K., Harris, K. M., Fiala, J. C. Endosomal compartments serve multiple hippocampal dendritic spines from a widespread rather than a local store of recycling membrane. The Journal of Neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 22, 2215-2224 (2002).
  20. Holbro, N., Grunditz, A., Oertner, T. G. Differential distribution of endoplasmic reticulum controls metabotropic signaling and plasticity at hippocampal synapses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 15055-15060 (2009).
  21. Terasaki, M., Slater, N. T., Fein, A., Schmidek, A., Reese, T. S. Continuous network of endoplasmic reticulum in cerebellar Purkinje neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 7510-7514 (1994).
  22. Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. Calcium imaging of cortical neurons using Fura-2 AM. J. Vis. Exp. (23), e1067 (2009).
  23. Lang, S., Schäuble, N., Cavalie, A., Zimmermann, R. Live cell calcium imaging combined with siRNA mediated gene silencing identifies Ca(2)(+) leak channels in the ER membrane and their regulatory mechanisms. J. Vis. Exp. (53), e2730 (2011).
  24. Rudolf, R., Mongillo, M., Rizzuto, R., Pozzan, T. Looking forward to seeing calcium. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 4, 579-586 (2003).
  25. Mank, M., Griesbeck, O. Genetically encoded calcium indicators. Chemical Reviews. 108, 1550-1564 (2008).
  26. Miyawaki, A., et al. Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin. Nature. 388, 882-887 (1997).
  27. Montero, M., et al. Monitoring dynamic changes in free Ca2+ concentration in the endoplasmic reticulum of intact cells. The EMBO Journal. 14, 5467-5475 (1995).
  28. Griesbeck, O., Baird, G. S., Campbell, R. E., Zacharias, D. A., Tsien, R. Y. Reducing the environmental sensitivity of yellow fluorescent protein. Mechanism and applications. The Journal of Biological Chemistry. 276, 29188-29194 (2001).
  29. Ishii, K., Hirose, K., Iino, M. Ca2+ shuttling between endoplasmic reticulum and mitochondria underlying Ca2+ oscillations. EMBO Reports. 7, 390-396 (2006).
  30. Palmer, A. E., Jin, C., Reed, J. C., Tsien, R. Y. Bcl-2-mediated alterations in endoplasmic reticulum Ca2+ analyzed with an improved genetically encoded fluorescent sensor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 17404-17409 (2004).
  31. Hofer, A. M., Machen, T. E. Technique for in situ measurement of calcium in intracellular inositol 1,4,5-trisphosphate-sensitive stores using the fluorescent indicator mag-fura-2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 2598-2602 (1993).
  32. Solovyova, N., Verkhratsky, A. Monitoring of free calcium in the neuronal endoplasmic reticulum: an overview of modern approaches. Journal of Neuroscience Methods. 122, 1-12 (2002).
  33. Solovyova, N., Veselovsky, N., Toescu, E. C., Verkhratsky, A. Ca(2+) dynamics in the lumen of the endoplasmic reticulum in sensory neurons: direct visualization of Ca(2+)-induced Ca(2+) release triggered by physiological Ca(2+) entry. The EMBO Journal. 21, 622-630 (2002).
  34. Rehberg, M., Lepier, A., Solchenberger, B., Osten, P., Blum, R. A new non-disruptive strategy to target calcium indicator dyes to the endoplasmic reticulum. Cell Calcium. 44, 386-399 (2008).
  35. Blum, R., Verkhratsky, A., Petersen, O. H. Calcium imaging of intracellular organelles: endoplasmic reticulum. 43, Humana Press. (2010).
  36. Shaner, N. C., et al. Improving the photostability of bright monomeric orange and red fluorescent proteins. Nature Methods. 5, 545-551 (2008).
  37. Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors. Science. 295, 868-872 (2002).
  38. Zufferey, R., et al. Self-inactivating lentivirus vector for safe and efficient in vivo gene delivery. Journal of Virology. 72, 9873-9880 (1998).
  39. Zufferey, R., Nagy, D., Mandel, R. J., Naldini, L., Trono, D. Multiply attenuated lentiviral vector achieves efficient gene delivery in vivo. Nature Biotechnology. 15, 871-875 (1997).
  40. Li, D., Herault, K., Oheim, M., Ropert, N. FM dyes enter via a store-operated calcium channel and modify calcium signaling of cultured astrocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 21960-21965 (2009).
  41. Blum, R., Petersen, O. H., Verkhratsky, A. Calcium measurement methods. Verkhratsky, A., Petersen, O. H. Vol. Neuromethods 43 (Springer protocols), Humana Press. 147-167 (2010).
  42. Tian, L., et al. Selective esterase-ester pair for targeting small molecules with cellular specificity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 4756-4761 (2012).
  43. Samtleben, S., Blum, R. Improved vectors for direct ER calcium imaging with targeted-estersase induced dye loading. , In preparation (2012).

Tags

البيولوجيا الخلوية، العدد 75، بيولوجيا الأعصاب وعلم الأعصاب، علم الأحياء الجزيئية، الكيمياء الحيوية، الهندسة الطبية الحيوية، الهندسة الحيوية، علم الفيروسات، الطب، علم التشريح، علم وظائف الأعضاء، والجراحة، الشبكة الإندوبلازمية، ER، مما يشير إلى الكالسيوم، وتخزين الكالسيوم، والتصوير الكالسيوم، مؤشر الكالسيوم، مما يشير metabotropic، CA
التصوير المباشر من الكالسيوم مع ER-المستهدفة استريز المستحثة صبغ تحميل (TED)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Samtleben, S., Jaepel, J., Fecher,… More

Samtleben, S., Jaepel, J., Fecher, C., Andreska, T., Rehberg, M., Blum, R. Direct Imaging of ER Calcium with Targeted-Esterase Induced Dye Loading (TED). J. Vis. Exp. (75), e50317, doi:10.3791/50317 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter