Direkte Imaging af ER Calcium med målrettet-Esterase induceret Dye Loading (TED)

Summary

Målrettet-esterase induceret farvestof belastning (TED) støtter analysen af ​​intracellulære calcium butik dynamik ved fluorescens billeddannelse. Fremgangsmåden baserer på målretning af en rekombinant carboxylesterase til det endoplasmatiske reticulum (ER), hvor det forbedrer den lokale demaskering af syntetisk lav-affinitet Ca

Abstract

Visualisering af calcium dynamik er vigtigt at forstå betydningen af ​​calcium i cellefysiologi. At undersøge calcium dynamik, har syntetiske fluorescerende ^{Ca2 +} indikatorer blive populær. Her viser vi TED (= målrettet-esterase induceret farvestof lastning), en metode til at forbedre frigivelsen af ^{Ca2 +} indikatorfarvestoffer i ER lumen af forskellige celletyper. Til dato, blev TED anvendt i cellelinjer, gliaceller og neuroner in vitro. TED baser på effektiv, rekombinant målretning af høj carboxylesterase aktivitet til skadestuen lumen ved hjælp vektor-konstruktioner, der udtrykker Carboxylesterases (CES). De seneste TED vektorer indeholder et centralt element i CES2 fusioneret til et rødt fluorescerende protein, og dermed gør det muligt samtidig tofarvet billeddannelse. Dynamikken i frit calcium i ER afbildes i én farve, medens det tilsvarende ER struktur vises i rødt. Ved begyndelsen af ​​proceduren, celler transduceret med en lentivirus. Efterfølgende de inficerede celler enre podet på dækglas til endelig muliggøre levende celler. Derefter levende celler inkuberes med acetoxymethylester (AM-ester) form af lav affinitet Ca ^{2 +} indikatorer, fx Fluo5N-AM, Mag-Fluo4-AM eller Mag-fura2-AM. Esterase aktivitet i ER spalter off hydrofobe sidekæder fra AM form ^{Ca2 +} indikator og en hydrofil fluorescerende farvestof / ^{Ca2 +} borkompleks og fanget i ER lumen. Efter farvestof lastning, cellerne analyseres ved en inverteret konfokal laser scanning mikroskop. Celler løbende perfuseres med Ringer-lignende løsninger, og de ER calcium dynamik direkte visualiseres ved time-lapse billeddannelse. Calcium frigivelse fra ER er identificeret ved et fald i fluorescensintensitet i regioner af interesse, hvorimod påfyldning af ER calcium butikken frembringer en stigning i fluorescensintensitet. Endelig er ændringen i fluorescerende intensitet over tid bestemmes ved beregning af bf / F _0.

Introduction

For at løse fysiologiske calcium svarene fra ER, vi udviklet en ny strategi for at forbedre fældefangst af syntetiske calcium følsomme farvestoffer ind på skadestuen. Metoden gør det muligt direkte, ikke-forstyrrende realtidsovervågning af frit ER calcium i overværelse af ekstracellulært calcium.

Funktion og signalering af ER Calcium

Calcium-signaler findes i forskellige celletyper, fx muskel-celler, neuroner og gliaceller og deres funktioner spænder fra mediere muskelsammentrækning til en involvering i synaptisk transmission i indlæring og hukommelse ^1,2. Ændringer i fri calciumkoncentration er af høj videnskabelig interesse, fordi calcium er involveret i reguleringen af gentranskription, celledeling, neuronal uro, celledød og andre celle signalering begivenheder ^1-7. Alle disse cellulære calcium signaler er funktionelt forbundet og bidrager til intracellulær calciumbutik dynamik ^8-10.

Et fælles træk blandt alle calcium signaler er strømmen af ​​calcium mellem det ekstracellulære rum, cytosolen og organeller, hovedsagelig ER og mitokondrier. Dette forårsager dynamiske ændringer i calciumkoncentration i disse organeller, som afføles af forskellige signalsystemer komponenter. I almindelighed, calciumkoncentrationen i ER svinger mellem 100-800 uM i cytosolen calciumkoncentrationen er tæt på 100 nM, og i det ekstracellulære rum koncentrationen er omkring 1-2 mm. Følgelig er der er en høj kemisk drivkraft for calcium strømme mod cytosolen ^2,9,10.

De mest almindeligt undersøgte ER-afledte calcium signaler afhænger stimulering af G-protein-koblede receptorer (GPCR), som derefter aktiverer phospholipase C (PLC). PLC gengæld producerer inositol 1,4,5-triphosphat _(IP3) ^1.. Efter binding af _IP3 til sin receptor (IP _3-Rec, figur 1) i ER-membranen er calciumioner frigøres fra ER lumen. Historisk, _IP3-medieret calciumfrigivelse fra ER var første - selvom indirekte - målt i acinar pancreasceller ved Streb m.fl. i 1983 ^11... Denne publikation foreslået for første gang en signaleringskaskade involverer acetylcholin, phospholipase C, og _IP3. På denne måde af calcium frigivelse generelt betegnes IP _3-induceret calcium frigivelse (IiCR) (Figur 1). Kinase-afhængig aktivering af phospholipase Cy ved receptor tyrosin kinaser links virkningen af vækstfaktorer og neurotrofiske faktorer til ER calcium signalering efter IP ₃ elevation ^12.. Ud over IiCR, kan calcium elevation være medieret af ionotropisk calcium-indtrængningen, fx via spændingsstyrede calciumkanaler (Ca _V) og efterfølgende calcium-induceret calcium frigivelse (CICR) ved ryanodine receptors (Ryr). IiCR og CICR er fysiologisk bundet til butik-opererede calcium-indtrængningen (SOCE). SOCE omfatter virkningen af ​​STIM (stroma interagerende molekyle), som er en sensor for ER calcium frigivelse. STIM har vist sig at stimulere ekstracellulært calcium-indtrængningen gennem forbigående receptor potentielle kanaler (Trp) ^13, Orai calciumkanaler ¹⁴ og endda spænding kalciumkanaler ¹⁵ (figur 1). Tab af ER calcium dynamisk reddet af virkningen af ​​Sarco-endoplasmatiske reticulum calcium ATPase (SERCA), som aktivt pumper calcium tilbage ind på skadestuen. Blokering af SERCA med lægemidler såsom thapsigargin afslører en kontinuerlig tab af ER calcium til den cytosoliske rum. Dette ER calcium "lækage" er forårsaget af ER intramembrane pore komplekser såsom Sec61 protein kompleks ^16,17 (fig. 1).

I 1998 offentliggjorde Berridge en model, "neuron inden en neuron model", which foreslår et princip fysiologisk rolle for ER i at integrere neuronal calcium ^5.. Denne model anser eksistensen af et kontinuerligt ER membran-system danner en intracellulær "billede" af neuronale plasmamembranen ^5.. Denne binære eukaryot membran system blev hævdet at være en grundlæggende forudsætning for tidslige og rumlige integration af hurtige og langsomme calcium signaler i neuroner. Calcium-signaler, der opstår enten samtidig eller senere i forskellige pigge eller dendritter af samme neuron tillægges til cellens soma eller kerne via ER, hvor de opsummerede ^5,18. Derefter kan deres sum have indvirkning på, ophidselse af neuron, regulering af gentranskription eller integration af signalleringskaskader. Således ER støtter integrationen af ​​calcium-signaler. En forudsætning for dette koncept er kontinuitet ER i en enkelt celle, som er blevet hævdet af flere undersøgelser, og som er blevet bevist i det mindste for somato-dendritic områder og kort afstand axonale fremspring ^19-21. Om der er ER kontinuitet i lange axonale fremskrivninger er et spørgsmål om forhandling.

Strategier til at måle strømmen af ​​fri calcium over-membranen

Calcium signaler hyppigst overvåges i cytosolen ^22,23. Derfor kan det ikke let kan skelnes om ^{Ca2 +} strømmer ind i cytosolen fra ekstracellulære eller fra intracellulære lagre ^6,24. For at overvinde denne begrænsning, har metodiske strategier for direkte ER calcium imaging blevet udviklet. Sammenfattende er de følgende strategier anvendt: (1) ER-målrettet gensplejsede protein-indikatorer ^25-27 Protein-baserede lav affinitet ^{Ca2 +} indikatorerne bioluminescerende protein aequorin eller GFP i kombination med en kalciumfølende protein.. Disse gensplejsede ^{Ca2 +} indikatorer (GECIs) kanmålrettes til skadestuen ved hjælp af et signal-peptid og er aktivt holdt i ER ved hjælp af en tilbageholdelse og genfinding motiv. Fælles ER Ca ^{2 +} indikatorer base på Cameleon princip og er Cameleon YC4.3 ^26,28, Cameleon split YC7.3ER ²⁹ og Cameleon D1 ^30. (2) Direkte esterase-baserede farvestof lastning af AM-ester med lav affinitet Ca ^{2 +} indikatorer ^31,32. AM-derivater af indikatorfarvestoffer (Mag-fura2-AM, Mag-Fluo4-AM eller Fluo5N-AM) passere biologiske membraner i en lipofil, calcium-ufølsomme tilstand. Derefter, i cytosolen samt i ER, frigiver endogene esteraser spalter i AM-estergruppen og ^{Ca2 +} indikator, efterlader en vis mængde aktiv farvestof i cytosolen og i ER. Derfor er denne fremgangsmåde nyttig under betingelser med en høj calciumkoncentration i ER, så længe den cytosoliske calciumkoncentration forbliver godt under debeskyttelse grænse for lav-affinitet indikatorer, især under karakteristiske calcium signaler (fx nM til lave uM). (3) AM-ester belastning i kombination med plasma membranpermeabilisering ^32.. Tiloversbleven cytosolisk ^{Ca2 +} indikator fjernes ved plasma membranpermeabilisering med små mængder af en "mild" rengøringsmiddel (fx saponin) i en kunstig intracellulær puffer. Således kan intracellulære membraner stimuleres, f.eks med _IP3 i den intracellulære puffer, direkte gennem "porer" i plasmamembranen. (4) Dialyse af cytosolen under helcelle-konfiguration og samtidige målinger af Ca ^{2 +} i ER lumen og cytosolen ^32,33. En celle først fyldt med en lav-affinitet ^{Ca2 +-indikator} (f.eks Mag-fura2- AM, ratiometrisk, UV-lys). Bagefter, med hjælp af et plaster pipette resterende CYTosolic lav-affinitet ^{Ca2 +} indikator dialyseres ud af cytosolen med en buffer indeholdende en høj affinitet ^{Ca2 +-indikator} (f.eks Fluo-3, synligt lys). Denne strategi muliggør samtidig optagelse af cytosoliske og ER afledte signaler. (5) Målrettet-esterase-induceret farvestof loading ^8,34. En carboxylesterase (CES) er målrettet til lumen af ER og giver en høj esteraseaktivitet til effektiv indfangning af AM-ester form af lav-affinitet ^{Ca2 +} indikatorer.

Målrettet-esterase induceret farvestof belastning (TED)

At forbedre målretning af lav-affinitet ^{Ca2 +} indikatorer til skadestuen lumen blev TED udviklet. TED kræver overekspression af en ER målrettet mus carboxylesterase (CES2) (figur 2), som opnås ved ekspressionskonstruktioner. Celler, som udtrykker en rekombinant CES-konstrukt inkuberes med AM-ester form af et calcium idikatoren farvestof (Fluo5N-AM, figur 2). Derefter, i ER er farvestoffet omdannes til Ca ^{2 +} følsom, membran uigennemtrængelig ^{Ca2 +} indikator kompleks (Fluo5N/Ca ^{2 +)} af den høje esteraseaktivitet, derfor fange farvestoffet i en høj koncentration i ER lumen ^{8 , 34..} Metoden er specielt anvendelig til at undersøge ER calcium-release via IiCR-veje for eksempel via metabotropiske, purinerge-eller glutamat receptorer ^8,34 og at visualisere ER calcium udtømning via "lække kanaler" direkte, for eksempel efter blokade af SERCA ^{17 , 34..} Til vores erfaring med lav affinitet Ca ^{2 +} indikator Fluo5N-AM er i øjeblikket den bedste tilgængelige indikator til brug sammen med TED farvestoffet loading strategi. Fluo5N-AM har en lav affinitet til Ca ^{2 +} (dissociationskonstant _KD ~ 90 pM, figur 2), er næsten ikke-fluorescerende i sin AM-formen, men giver høj fluorescensemission ved Calcium binding ^8,34. Den Fluo5N/Ca ^{2 +} kompleks kan exciteres med en standard lyskilde ~ 490 nm, hvilket svarer til standard farvestoffer, såsom FITC, Alexa 488, eller eGFP. Cytosoliske calcium signaler næppe nå en koncentration i det lave uM rækkevidde og derfor næppe påvises ved Fluo5N i cytosolen ^35..

At forbedre TED ydeevne blev adskillige rekombinante vektorkonstruktioner udviklet (figur 3). Oprindeligt er TED vektorer baseret på den kodende sekvens af CES2 (RefSeq accession nummer NM_145603, CES2c) og bedste TED ydeevne observeres med stabil ekspression af CES konstruktioner. Nye TED vektorer udtrykker et centralt element i CES2 fusioneret med rød fluorescens protein TagRFP-T2 ^36. Disse vektorer har den fordel, at de kan anvendes til at identificere transducerede celler og til at bruge den røde fluorescens som en intern kontrol til normalisering af ændringer i Fluo5N/Ca ^{2 +} fluorescens. Den røde fluorescens også giver mulighed for at visualisere den strukturelle fordeling af ER og ændringer i ER dynamik under stimulering betingelser.

Protocol

Denne protokol introducerer TED anvendt på cellelinier, hippocampusneuroner og corticale gliaceller. TED ydeevne er bedst, når TED vektorer udtrykkes stabilt, for eksempel ved lentivirusvektorer. En skematisk oversigt over TED metoden er vist i fig. 4.

1.. Fremstilling af opløsninger

Følgende bør fremstilles før start og kan gemmes som angivet. Vi plejer at bruge steriliseret glas og plast og autoklaveret vand.

1. Forbered HEPES-Ringer (i mM): 125 NaCI, 3 KCI, 25 HEPES, 2 _MgSO4 .7 _H2O, 2 _CaCl2, 1,25 NaH ₂ PO _{4 H2O,} 10 glucose.H ₂ O.. Calcium-fri HEPES-Ringer består af (i mM): 127 NaCl, 3 KCI, 25 HEPES, 2 _MgSO4 .7 _H2O, 1,25 NaH ₂ PO _{4 H2O,} 10 glucose.H ₂ O og 0,1 EGTA.. Uden glukose disse imaging-løsninger kan be opbevaret ved 4 ° C. Den krævede mængde af D-glucose er frisk tilsat før brug.
2. For TED analyse hippocampusneuroner er kunstig cerebrospinalvæske (ACSF) anbefales. ACSF er sammensat af (i mM): 127 NaCl, 23 _NaHCO3, 3 KCI, 2,5 NaHPO _{4 H2O,} 25 D-glucose.H ₂ O 2 _CaCl2, 2 _MgCI2 .7 H ₂ 0 i ddH. ₂ 0.
3. Forbered Fluo5N-AM til en koncentration på 5 mM. At hjælpe solubilisering tilsættes 8,9 pi 20% Pluronic F-127 (i DMSO ved stuetemperatur opbevares beskyttet mod fugt og lys) til 50 ug lyofiliseret Fluo5N-AM. Så opløser Fluo5N-AM ved hjælp af et vandbad sonicator i mindst 2 min. Store portioner à 0,5 pi ved -20 ° C, beskyttet mod lys og fugt.
4. Forbered antagonist og agonist lagrene efter behov. For eksempel: a) 10 mM ATP eller ADP (i _H2O, metabotropisk aktivering af purinerge receptorer), b), 10 mM carbachol i _H2O (agonistaf muscarin acetylcholinreceptor), c), 30 mM cyclopiazonsyre (CPA) i DMSO (blokker af SERCA), d) 50 mM DHPG i PBS (metabotropisk glutamat receptor agonist til mGluR _I og mGluR _5), e) 10 mM glutamat i H ₂ O f) 1 mM ionomycin i DMSO (ionophor), g) 5 mM thapsigargin i DMSO (høj-affinitet blokker af SERCA). Opbevar alikvoter ved -20 ° C.
5. Lentivirusvektorer: Denne protokol indbefatter anvendelsen af ​​lentivirale TED ekspressionsvektoren partikler. Deres produktion og lagring er ikke en del af denne protokol. Vi bruger lentivirale vektorer af anden generation for overførsel af rekombinante Carboxylesterases cellelinjer, glialceller og neuroner. Vores lentivirale systemet baser på ekspressionsvektoren FUGW ^37, og den emballage plasmider pCMVΔR8.91 eller psPAX2 og pseudotyping plasmid pMD2.G ^38,39 ADVARSEL:. Overvej, at arbejdet med rekombinante selv inaktiveringsbetingelser lentivirusvektorer kræver omhyggeligovervejelse af biosikkerhed retningslinjer. I mange lande er disse vektorer klassificeret som biologisk risiko gruppe 2. For yderligere information henvises til http://www.addgene.org/lentiviral/ .

2.. Forberedelse og Viral Infektion af Mouse hippocampusneuroner

1. Vask dækglas i et glas petriskål med 20 cm diameter (100 dækglas pr skål) 1x i 70% ethanol i ca 30 minutter. Endelig tilsættes 100% ethanol (pa) i 2 min. Fjerne resterende ethanol og tørre dækglas under en steril hætte.
2. Forbered to forskellige slags medier til hippocampus neuron kulturer: (a) Neurobasal medium med B27 01:50 (b) fuld medium: Neurobasal medium med B27 01:50, Glutamax 1:100 og N2 supplement 1:100. Steril filtrat medierne og gemme dem i cellen inkubator indtil brug.
3. En dag før dissektion er dækglassene fremstilles ved først at anbringe en steril 10 mm dækglas i hverbrønd af en 4-godt celledyrkningsskål. Derefter omhyggeligt frakke hver dækglas med 80-100 gl 0,1% poly-L-lysin og gemme retter i en inkubator natten over.
4. På dagen for dissektion og cellekultur, begynde med vask dækglassene tre gange med 100 ul HBSS og overføre 100 pi Neurobasal medium til hver dækglas. Placer retter i en inkubator for ligevægt (fx under dissektion af mus).

Dissection

Vi udfører vores eksperimenter med mus i overensstemmelse med Den Europæiske Unions retningslinjer, som er godkendt af vores institutionelle dyrepleje og udnyttelse udvalg.

5. Fjern den totale hjerne og dissekere hippocampusen bilateralt.
6. Fjern forsigtigt eventuelle meninges og væv bortset fra hippocampus og sted én hippocampus hver i et 1,5 ml rør indeholdende 450 ul HBSS. Opbevar væv på is, indtil et tilstrækkeligt antal hippocampi blevet isoleret.

<p class = "jove_step"> Cell kultur

7. Tilsæt 50 gl 1% trypsin (Worthington) til hvert rør og inkubere dem i et 37 ° C vandbad i 15 min. Ryst rørene lejlighedsvis. For at stoppe fordøjelsen reaktion, tilsættes 50 ul 1% trypsin inhibitor til hvert rør og vend røret flere gange.
8. Overføre alle væv på op til 5 hippocampi til én 15 ml Falcon-rør undgå overførsel af væske. Tilføj B27-medium (a) til et slutvolumen på 5 ml.
9. Udriv vævet med en brand poleret Pasteur glaspipette ved omhyggeligt at pipettere op og ned ADVARSEL:. Undgå luftbobler!
10. Spin med 400 g i 3 min, aspirere supernatanten og resuspender cellepelleten i 5 ml B27-medium (a).
11. Tritureres vævet igen med glas pipette og derefter to gange ved hjælp af en 1.000 pi plastfilteret spids. Udfør denne som beskrevet i trin 2.9 og 2.10.
12. Efter den sidste centrifugering, resuspender cellepelleten i 2 ml fuld medium (b), og tritureres celler med en 200 ul plastfilteret spids. For at adskille de resterende celleklumper fra encellede suspension, lad celleklumper slår sig ned for 1-2 min.
13. Tæl celler og beregne det samlede antal celler, der er nødvendige for viral infektion. For TED imaging bruge 25.000 celler pr 10 mm dækglas.
14. Plating yderligere 25.000 non-transducerede celler som en styring anbefales på dette punkt.

Virusinfektion

15. Overfør cellesuspensionen mod virusinfektion i en frisk 15 ml Falcon-rør og centrifugeres i 3 minutter ved 400 x g..
16. Aspirer supernatanten og resuspender cellerne i 300 pi medium (b)
17. Tilsæt en passende mængde af infektiøse lentivirale TED ekspressionsvektor partikler og lad falk røret stå ved stuetemperatur i 10 min.
18. Fyld røret med fuld medium (b), til det endelige volumen er nødvendig for plettering (100 pi for hver 10 mm dækglas) aspireres mediet fra coverslip og straks placere 100 ul cellesuspension på hver dækglas.
19. Placer tallerkener i inkubatoren indtil alle celler har slået sig ned (ca. 2 timer) og forsigtigt fylde skålene indtil de indeholder 2 ml medium (b).
20. Lad neuroner vokse i mindst en uge. Erstat 50% af mediet hver uge.

3.. Kultur og Viral infektion af muse Kortikale gliaceller

Forberedelse

1. Starter med at udarbejde basal glia medium (1:1 blanding af DMEM/F12 med 10% FCS, 5% HS, 1% penicillin / streptomycin, 0,45% glucose) og coating af en T75 cellekultur kolbe med 4 ml 0,5 ng / ml Poly -DL-ornithin hydrobromid (PORN) (fortyndet i 150 mM borsyre, pH 8,35). Efter inkubation ved 37 ° C i 2 timer eller natten over, vaskes cellekultur kolben tre gange med HBSS, og der tilsættes 18 ml basal glia medium indeholdende B27 01:50 og 10 ng / ml EGF. Ækvilibrere cellekultur kolben i inkubatoren (op til 3 timer).

<p class = "jove_step"> Dissektion

1. Vi udfører vores eksperimenter med mus i overensstemmelse med Den Europæiske Unions retningslinjer, som er godkendt af vores institutionelle dyrepleje og udnyttelse udvalg.
2. Dissekere hjernen af ​​en P5-P7 mus og fjerne hippocampus og meninges fra begge halvkugler, som beskrevet i 2.5.
3. Dissekere frontale cortex, skæres i flere små stykker og samle dem i et 1,5 ml rør indeholdende HBSS. Opbevar røret på is og fortsæt til cellekultur del.

Cellekultur

4. Overføre alle væv fra røret til en 15 ml Falcon-rør ved hjælp af en brand spejlglas pipette.
5. Tilføj basalt medium til et slutvolumen på 5 ml og tritureres vævet ved pipettering flere gange op og ned med en brand spejlglas pipette. Efter centrifugering ved 300 g i 3 min, aspireres mediet, og resuspender cellepelleten i 5 ml basalt medium.
6. Gentag trin 3.5 to gange.
7. Efter Third centrifugering, resuspender cellepelleten i 2 ml basal glia medium indeholdende B27 (01:50) og 10 ng / ml EGF.
8. Titruate igen og overføre cellesuspension til den forberedte T75 cellekultur kolbe og lad celler vokse i 3-4 dage.

Vask af gliaceller (efter 3-4 dage i kultur):

9. Vask cellerne en gang med 10 ml PBS og energisk trykke eller forsigtigt ramte kolben et par gange med hånden, mens du holder den stram i den anden hånd. Ved dette trin cellerester og celleklynger fjernes fra kulturen.
10. Aspirer PBS og tilføje frisk basalt glia medium indeholdende B27 (01:50) og 10 ng / ml EGF. Yderligere dyrke kulturen i 5-7 dage, indtil cellerne når 80% konfluens.

Opdeling, transduktion og afsluttende udsåning af gliaceller:

11. Frakke 10 mm dækglas med 100 ul Poly-D-lysin (Stamopløsning: 0,1%, fortyndet 1/50 ad 20 ug / ml i PBS eller HBSS) og inkuberesdem i en inkubator natten over. Vask dækglas tre gange med HBSS og tilsæt 100 ul basal glia medium. Ækvilibrer dækglas i inkubatoren (3 timer).
12. Vask gliaceller to gange med 10 ml PBS, opsug PBS, og der tilsættes 3 ml trypsin (TrypLE, ufortyndet). Trypsinisér celler i op til 1 min ADVARSEL:. Undgå over-trypsinisering. Normalt er mere end 80% af alle celler er fritliggende efter 1 min, og det er tilstrækkeligt at have flere millioner af raske celler.
13. Reaktionen standses ved tilsætning af 10 ml basal glia medium, overføre cellesuspensionen til en 15 ml Falcon-rør, centrifugeres ved 300 xg i 3 min. Aspirer supernatanten og resuspender cellepelleten i 5 ml basal glia medium.
14. Igen, spinde og aspireres som beskrevet i trin 3.15, derefter resuspenderes cellerne i 5 ml basal Glia medium.
15. Overfør det nødvendige antal celler til et 1,5 ml rør. 10 ^{4-2x10 4} gliaceller er tilstrækkelige til en 10 mm dækglas. Normalt suspensionen vol.lumen til at transducere celler til en 4-godt-skålen er mindre end 200 ul. Tilsæt en passende mængde af lentivirale TED ekspressionsvektoren partikler til cellerne og inkuberes dem ved stuetemperatur i 10 min. Derefter fylde suspensionen med basal glia medium til seeding volumen (100 ul pr dækglas).
16. Frø 100 pi af inficerede celler pr dækglas og inkuber for omkring 2 timer, hvorefter der tilsættes basal glia medium indeholdende B27 01:50 og 10 ng / ml EGF til et slutvolumen på 2 ml.
17. For ideelle dyrkningsbetingelser bruger celler til eksperimenter på dag 3-7 efter udpladning.

4.. Generation og kultur Reporter cellelinje

TED reporter cellelinjer blev fastsat på grundlag af HeLa, BHK21, HEK293 og SH-SY5Y. Her giver vi en protokol for HeLa-celler, men protokollen kan overføres til en anden cellelinje så godt.

Generering af stabile HeLa-cellelinie

1. Opdele en vildtype HeLa cellelinie og overførsel 100.000 calen i et volumen på 200 mikroliter med en 1,5 ml rør.
2. Tilsæt en passende mængde af lentivirale TED ekspressionsvektoren partikler til røret og inkuber celle-virussuspension i 10 min ved RT. Derefter frø cellerne i et samlet volumen på 2 ml medium (DMEM, 10% FCS, 1% penicillin / streptomycin), i en 30 mm skål og inkuberes i 3 dage.
3. Efter vask gang med PBS, aspirere medium og tilsæt 500 pi trypsin (TrypLE, 02:03 i PBS). Inkuber i ca. 3 minutter og derefter standse reaktionen ved tilsætning af 3 ml medium. Overfør suspensionen til et 15 ml Falcon-rør og centrifugeres ved 400 xg i 3 min.
4. Resuspender cellepelleten i 200 ul medium og igen inficere cellerne med lentivirale partikler som beskrevet i 4.2. Derefter frø celler i en T25 cellekultur kolbe i 10 ml medium.
5. Dyrk celler, indtil en sammenflydning på 60-80% er nået. Derefter opdele kulturen.

TED reporter cellelinjer

6. TED reporter cellelinjer kan opretholdeed i enhver standard medium, fx DMEM indeholdende 5% eller 10% FCS og 1% penicillin / streptomycin anvendes.
7. Plade et passende antal celler i en 4-brønds skål indeholdende sterile 10 mm dækglas (se ovenfor), f.eks 10.000 til 20.000 celler pr dækglas.
8. Grow celler til mindst to dage, før du bruger dem for TED billeddannelse.

5.. Forberedelse til Live Imaging Procedure på et omvendt mikroskop

1. 1. Forvarm HEPES-Ringer til stuetemperatur og tilsættes D-glucose.
   2. Forvarm den ACSF (uden ^{Ca2 +} og ^{Mg2 +)} til stuetemperatur og tilsæt D-glucose. Luftes ACSF med carbogen i 5 minutter. Derefter tilsættes 1 M stamopløsninger af _CaCl2 og _MgCl2 til slutkoncentrationer på 2 mM af hver.
2. Start de levende billeddiagnostiske mikroskoper og alle edb-programmer.
3. Start perfusion på en "dummy" imaging kammer og tempereres røret system.
4. Forvarm inline løsning varmelegeme og billedbehandling kammer i mikroskopet scenen. Fastgør imaging kammer i et varmeanlæg insert.
5. Ækvilibrer systemet til 32-37 ° C, før du starter farvestoffet indføringsprocedure ADVARSEL:. At undgå utilsigtet strøm af perfusionsopløsning i mikroskopet system, vi bruger hår bånd omkring de mål og elastiske silikone ark (1 mm) for at beskytte mikroskopbordet.

6.. Dye Loading af Enten Cell Type

1. Resuspendere 1 portion af Fluo5N-AM (se 1.3) i 100 ul forvarmet imaging løsning (HEPES-Ringer eller ACSF).
2. Opløser Fluo5N-AM i billedbehandling løsning (HEPES-Ringer eller ACSF) i et vandbad sonicator for 90 sek.
3. Bruge en frisk 4 - eller 24-brønds plade og overførsel 400 pi forvarmet billedbehandling løsning til en brønd. Tilsæt farveopløsning på samme godt at komme til 500 pi af en 5 uM opløsning.
4. Placer forsigtigt et dækglas med celler (f.eks10-18 mm i diameter) i brønden, celler opad.
5. Inkuber i et passende tidsrum i en cellekultur inkubator ved 37 ° C (i mellemtiden forberede imaging indstillinger på mikroskopbordet). Typiske dye-loading tider er for neuroner og gliaceller 7-15 min og cellelinjer 10-20 min.

AFGØRENDE: Dye-loading tid og farvestof koncentration afhænge af celletypen, celletæthed, og eksperiment-specifikke behov! Lange inkubationstider i nærværelse af farvestof kan skade cellerne, især primære neuroner og primære gliaceller og dette er kritisk for at reagere på fysiologiske stimuli. Lange inkubationstider (f.eks 30 min) vil kun være nyttig for ER calcium lokalisering eksperimenter for at undersøge fordelingen af ER calcium i små subcellulære strukturer, fx fine neuritter eller pigge. I nogle eksperimenter kan en blanding af 1/3 vækstmedium med billedbehandling løsning bidrage til at beskytte celler under Fluo5N-AMlastning.

6. Straks overføre dækglas til en anden cellekultur brønd indeholdende billedbehandling løsning (HEPES-Ringer eller ACSF) og påbegynd montere celler i billeddannelse kammeret.

7.. ER-calcium Live-Cell Imaging med Inverted Laser Scanning Confocal Microscope

1. Brug en pensel til at anvende højt vakuum fedt til en imaging kammer. Fedtet er nødvendig for at fiksere dækglasset på bunden af ​​perfusionskammeret. Vi bruger self-made imaging kamre til 10-12 mm dækglas med et lille volumen, således at en høj perfusion hastigheder på op til 15-fold pufferudbytning per minut. Et kommercielt tilgængeligt perfusionskammer til 18 mm dækglas, kan købes fra Warner instrumenter (RC-49FS). Dette kammer gør det også muligt inden stimulering af neuroner.
2. Saml dækglasset med Fluo5N-loaded celler og tilføje en lille dråbe billedbehandling løsning (50-100 pi) på cellerne for at holde cellerne dækket med billedbehandling løsning.Vend dækglasset hovedet og montere celler i billeddannelse kammeret. At presse dækglasset i silicium-lim, brug en vatpind (fx Q-tip).
3. Tør resterende buffer fra bunden af dækglas med vatpinde ADVARSEL:. Forsigtigt tørre væk restfugtighed, når du bruger en olie-objektiv med høj numerisk blænde til høj opløsning billeddannelse. Resterende salt fjernes bedst ved vand. Utilsigtet udstrygning af fedt kan fjernes med acetone eller ren ethanol.
4. Exchange "dummy" imaging kammer med den eksperimentelle imaging kammer. Vask cellerne i 5-10 min ved kontinuerlig perfusion.
5. Vask cellerne for 5 - 10 min ved kontinuerlig perfusion.
6. For celle udvælgelse bruge en minimal mængde af laserbelysning, højt scan satser (2-4 Hz), et lille billede størrelse, og en høj gevinst.
7. ADVARSEL: For udvælgelsen af Fluo5N-mærkede celler bruger ikke overskud af lys eller direkte belysning med epifluorescent lys. Lyse belysning af Fluo5N/Ca ^{2 +} komplekser forårsager fuldstændig tab af ER-specifik fluorescens indenfor 2-4 sekunder (figur 5).
8. Indstil mikroskopet i henhold til den planlagte eksperiment. For orientering, er repræsentative indstillinger for billeddannelse med forskellige TED vektorer givet i tabel 1.. Til omvendt laser scanning konfokal mikroskopi, anvender vi et Olympus IX81 mikroskop kombineret med en Fluoview 1000 konfokalt system, der er udstyret med diodelasere (473 nm, 15 mW, 559 nm, 20 MW) og en spektral detektor-system.
9. I begyndelsen af ​​forsøget dokumentet cellerne af interesse ved høj opløsning x, yz billedstakke.
10. Udfør x, yt imaging at overvåge ER calcium dynamik under de specifikke eksperimentelle betingelser. Typiske indstillinger for vores system er anført i tabel 2..
11. Overvåge ændringer i ER calcium under konstant perfusion med imaging løsning. Typiske buffer valutakurser er exemplarily: (a) celle vask og store-tømt af SERCA blok: 1,5 ml / min, (b) ATP / DHPG stimulering: 3 ml / min.
12. Anskaf digitale billeder fortrinsvis med 12-bit (4096 grå værdier). For parallel billeddannelse af Fluo5N/Ca ^{2 +} og RFP, 8-bit-billeder (256 grå værdier) kan redde dit system fra data overløb.
13. Opbevar levende celle tidsserier billeder (x, yt) eller 3D billedstakke (x, yz) (for cellulær fordeling af Fluo5N/Ca ^{2 +-komplekser)} i et ImageJ kompatibelt format (f.eks TIFF).

8.. Image Processing og Data Analysis

1. Åbn billedet stakken i ImageJ programmet. I tilfælde af flerfarvet billeddannelse, opdele RGB kanaler, når spurgt af ImageJ.
2. Identificer din region (er) af interesse (ROI) ved en omhyggelig undersøgelse af de billedstakke (fx med hjælp af en intensitet versus tid plot)
3. Brug Time-serien Analyzer plugin til at læse den gennemsnitlige pixel intensitet i en ROI (F _rå). Depending om formålet, tegne ROIs omkring enten det komplette ER eller små områder af ER fx ER af dendrites af perifere celle regioner. Også omfatte 1-3 ROI i områder uden celler til baggrundssubtraktion.
4. Beregn den gennemsnitlige baggrundsfluorescens (F _b) ved at beregne den gennemsnitlige fluorescens værdi af baggrunden ROI og trække baggrundsniveauet værdi _Fb fra F _{råværdierne} at få F _roi værdi.
5. Beregn F _0, som er den basale fluorescens af cellerne, ved at beregne middelværdien af ti til 30 fluorescerende værdier for hver ROI i en hviletilstand.
6. Beregn background-korrigerede relative ændringer i fluorescens ved bf / F ₀ ved formlen:

7. Præsentere relative ændringer i fluorescerernce som et spor med bf / F ₀ for Y-aksen og tid for X-aksen.

Representative Results

Denne protokol giver en ikke-forstyrrende tilgang til direkte billeddannelse af fri ER calcium. Lav-affinitet syntetisk ^{Ca2 +} indikatorer frigives og fanget i ER lumen ved hjælp af en målrettet ER, rekombinant esterase-enzym-aktivitet. Forbedret belastning af Ca ^{2 +} indikatorfarvestoffer til skadestuen lumen giver mulighed for en direkte og hurtig billeddannelse af ER calcium butik dynamik.

Celletyper til TED

Muligheden for at metoden er blevet vist i cellelinier BHK21, HEK293 ^34, HeLa ^17, SH-SY5Y, dyrkede astrocytter ^8,40 og primære hippocampus og kortikale neuroner ^8,34,41. I vores eksperimenter, fungerer TED godt, når TED konstruktioner udtrykt stabilt, fortrinsvis ved selv-inaktivering lentivirusvektorer ^37,39 ved hjælp af en relativt svag promotor (f.eks ubiquitinpromotoren) ^35. Andre, stærkere promotorer er under efterforskning.

Vellykket TED loading med Fluo5N tilbyder en klar og lys farvning af ER lumen, der er sparet ud af det nukleare område ^34,41. Ved hvilende tilstande, repræsenterer Fluo5N/Ca ^{2 +} kompleks etiket lokalisering af calcium når det er bundet af Fluo5N dermed det repræsenterer den regionale fordeling af frit calcium i ER lumen. I figur 6, ^+-komplekser og Tag-RFP-T2 etiketter af Red-CES2 konfokale billeder af Fluo5N/Ca ² er vist i HeLa-celler, corticale astrocytter og hippocampusneuroner. Figur 6C viser den fluorescerende ^{Ca2 +} indikator kompleks i cellen krop samt neuritter af hippocampus neuroner. Dette muliggør undersøgelse af Ca ^{2 +-signaler} i temmelig små processer (se også ^34,35).

Nogle oplever er nødvendig for at adskille den typiske ER etiket fra en cytosolisk etiket, der vil blive observeret when celler er beskadiget eller usund. Cytosoliske endogene esteraser også frigive Fluo5N, hvilket fører til en meget lys farvning af cytosolen og kernen, når calcium siver gennem plasmamembranen. Cytosoliske farvning af Fluo5N/Ca ^{2 +} er også observeret, når TED-mærkede celler behandles med ionophor ionomycin i nærvær af ekstracellulært calcium (figur 7).

Direkte billeddannelse af calcium frigivelse fra ER

En væsentlig anvendelse af TED er den direkte visualisering af ER butik udtynding ^17,34. I figur 8, viser vi en repræsentativt eksperiment udført med hippocampale neuroner, der udtrykker rød-CES2. Neuroner med Rød-CES2 berige store mængder af Fluo5N i perinukleære regionen (pile i figur 8). Når SERCA blocker CPA anvendes ved perfusion, er en hurtig udtømning af ER calcium butik observeret (figur 8B). Her præsenterer vi deråværdierne (y-aksen), der er opnået, når neuroner er afbildet med 12-bit. Imaging betingelser er anført i tabel 2.. Bemærk enorme forandringer i middelfluorescens tæthed pr ROI, der er observeret, når TED påføres neuroner. For andre eksperimenter analyserer ER calcium udgivelse i neuroner bruger TED, vil vi gerne henvise til tidligere forsøg, som allerede var blevet drøftet i detaljer ^8,34,35. I korte træk er TED i neuroner in vitro bruges til at visualisere SERCA-følsomme ER calcium butik i stor detalje ved inverteret konfokal laserscanningsmikroskopi ^8,34 og blev med held anvendt til hurtig billeddannelse (15 Hz) af mGluR1 / 5 induceret IiCR ^34..

Figur 9 viser et typisk forsøg med mus kortikale astrocytter in vitro, som stimuleres af 200 uM ATP gennem perfusionssystemet ved lav opløsning med et 20x vand mål. Efter lentiviral infektion, udtrykt cellerne er vist her Rød-CES2, som drives af en ubiquitinpromotoren. Scanning hastighed var ~ 2 Hz og begge kanaler (Fluo5N/Ca ^{2 +} og rød-CES2 fusionsprotein), blev samtidig filmede (i overensstemmelse). I begyndelsen af ​​forsøget gliaceller viste god infektion med ekspressionskonstruktionerne og god læsning med Fluo5N-AM. Det ROIs der blev analyseret, er fremhævet i Figur 9A. Én ROI blev sat til at måle baggrundsfluorescens (bg), ROI 1-2 måle fluorescensen af ​​komplette celler, ROI 3 dækker det blot ER af cellen og ROI 4 blev trukket rundt hele synsfeltet. Kort efter stimulering med ATP fluorescensen af Fluo5N/Ca ^{2 +} komplekser brat faldt ned på grund af Ca ^{2 +} frigivelse fra ER. Endelig ER delvist fyldt med calcium igen. Samtidig fluorescensen af RFP falder kontinuerligt som følge af svag blegning (figur 9B, nederste panel). Spor, der repræsenterer ændringer i fluorescer ning intensitet (figur 9C) peger på en vigtig ulempe for TED. I mange (ikke alle) eksperimenter høje mængder af Fluo5N-komplekser tabt under stimulering. Som en konsekvens har de fluorescens værdier ikke vende tilbage til den oprindelige fluorescensintensitet niveau.

Figur 10 viser en CES2-inficerede BHK21 celle ved høj opløsning, mærket ved Fluo5N/Ca ^{2 +} og stimuleret med ATP. BHK21 celler fungerede som en tidlig model celle system for ER calcium analyse ^31. Bemærk, at ER calcium frigivelse og store-efterfyldning er visualiseret i fine strukturer ER tubuli. Strukturerne er blevet afbildet med langsom hastighed (~ 0,2 Hz) med 512 x 512 pixel, Airy disk 1 indstilling for konfokal pinhole, og med en 63x olie mål.

"/>
Figur 1. Oversigt over ER calcium signalering. ER calcium frigivelse skyldes "lække" kanaler, såsom ER intramembrane pore komplekse Sec61. G-protein-koblede receptorer (GPCR) stimulere _IP3 produktion, som derefter forårsager IP _3-induceret calcium frigivelse (IiCR). ER calcium frigivelse fornemmede af STIM komplekser og inducerer store betjente calcium post (SOCE) ved at ion-kanaler i Trp familie og / eller Orai calcium kanaler. Spænding kalciumkanaler (Ca _V) mægle hurtig calcium-induceret calcium frigivelse (CICR) ved at ryanodine receptorer (Ryr) enten ved direkte protein interaktion (skeletmuskulatur) eller fysiologisk interaktion (hjertemuskelceller, neuroner). Tabet af ER calcium dynamisk reddet af virkningen af ​​SERCA pumpen (sarcoplasmatisk-endoplasmatiske retikulum calcium ATPase).

res.jpg "src =" / files/ftp_upload/50317/50317fig2.jpg "/>
Figur 2. Princippet om målrettede-esterase induceret farvestof belastning (TED). Målrettet overekspression af en carboxylesterase giver en høj esterase aktivitet (CES2) i Skadestuen. Den esterase konverterer acetoxymethylester farvestof Fluo5N-AM til en calcium-følsom, fluorescerende farvestof er fortsat fanget i ER. Fluo5N har en lav affinitet til calciumioner. Derfor er der under hvilende betingelser, er fluorescerende Fluo5N/Ca ^{2 +} komplekser fortrinsvis dannet i ER, hvor calciumkoncentrationen er cirka 1.000 gange højere end i cytosolen.

Figur 3. Repræsentative TED vektorkonstruktioner CES2.: Native version af muse CES2. CES2 ^{OPT 43:} The ERsignalpeptid blev udvekslet og omfatter nu en intron, mens ER tilbageholdelse motiv blev ændret til den klassiske KDEL-ER tilbageholdelse og genfinding motiv af opløselige ER proteiner. En myc tag tilvejebringer en epitop for protein detektion ved indirekte immunofluorescens mærkning og Western blot-analyse. Rød-CES2 ^8,43: En rød fluorescerende protein blev tilsat lige bag den aminoterminale signalpeptidet. Red ^LK CES2 ^43: A glycin-serin linker er blevet indført for at etablere et fleksibelt hængsel mellem RFP og CES2 element.

Figur 4.. Arbejde flow for direkte ER calcium imaging ved hjælp TED. Cellesuspensioner af primære celler eller cellelinier transduceres med en virus, der indeholder en TED ekspressionskonstruktionen. Celler podes derefter på coverslips. Ved brug RFP-CES2 konstruktioner transducerede celler kan identificeres ved hjælp af rød fluorescens. Target-esterase induceret farvestof lastning udføres ved inkubation af cellerne i en billedbehandling løsning indeholdende en AM-koblet med lav affinitet ^{Ca2 +} indikator, såsom Fluo5N-AM eller Mag-fura2-AM. ER calcium billeddannelse udføres med en inverteret laserscanning mikroskop (se protokol) eller enhver anden kompatibel imaging enhed. Under Live imaging cellerne er under konstant perfusion med et billedbehandlings-løsning, såsom kunstig cerebrospinalvæske (ACSF). Cellestimulering udføres enten ved perfusion eller ved lokalt tryk udslyngning.

Figur 5. Stærk epifluorescens belysning ødelægger ER-specifikke Fluo5N TED label på få sekunder. Repræsentative billeder fra en video, afbildes med en opretstående imaging mikroskop. Her gliaceller udtrykEssing RFP-CES2 blev fyldt med Fluo5N-AM. Først den røde fluorescens af en inficeret celle blev afsløret med et CCD-kamera. Efterfølgende blev Fluo5N/Ca ^{2 +} signal belyst med en LED lyskilde. En indledende klar ER lokalisering af Fluo5N/Ca ^{2 +-komplekser} (gule pile) er hurtigt ødelagt af en kraftig belysning med en 470 LED lyskilde og et skift i fluorescens distributionen bliver synlig på det nukleare område (gule pile, 12,46 sek).

Figur 6.. TED loading med Fluo5N-AM i forskellige celletyper Overpanel:. HeLa-celler med stabil RED-CES2 udtryk Middle panel:. Kortikale astrocytter efter lentiviral transduktion med rød-CES2 Lower Panel:. Hippocampusneuroner med rød-CES2 på DIV 8.. Alle celler blev dyrket på dækglas og farvet med Fluo5N-AM som beskrevet i metodeafsnittet. Den Fluo5N/Ca ^{2 +} label også repræsentere lokalisering af calcium, når bundet til Fluo5N. Scale bar 40 pm.

Figur 7. Fluo5N farvestof i cytosolen bliver synlig efter ionomycin behandling. Glialceller blev inficeret med røde CES2, mærket med Fluo5N-AM, og behandlet med SERCA-blokker thapsigargin at nedbryder ER calcium. Ionomycin inducerede behandlingen en stærk tilstrømning af ekstracellulært calcium. (Øverste panel) Celler viser en drastisk stigning i Fluo5N/Ca ^{2 +-medieret} fluorescens. (Lower panel) Den gennemsnitlige intensitet projektion billede af Fluo5N/Ca ^{2 +-label} afslører en typisk cytosolisk mærkning af fluorescerende calcium kompleks Blå pil:. Et smukt mærket celle angiver, at denne celle har høje mængder af calcium i the cytosol. Formentlig er denne celle beskadiget Lilla pil:. Celler bliver klart mærket i cytosolen ved ionomycin behandling.

Figur 8. ER calcium butik udtømning i neuroner ved at blokere SERCA. (A) hippocampusneuroner (DIV 9) express Rød-CES2 (A, rød) og er mærket med Fluo5N-AM (A, grøn). Pilene peger på to analyserede celler. Billedet (maksimal intensitet projektion) er en beskåret del af økse, yz-image, der blev erhvervet i begyndelsen af forsøget. (B) Rå spor repræsenterer ER calcium butikken udtømning efter perfusion med 30 pM CPA. Her 1.000 billeder blev taget med 1 Hz og 12-bit. De rå værdier middelfluorescens tæthed pr ROI (Y-akse) i de to celler vist i A erafbildet over tid (rød og blå spor). Baggrundsværdierne (sorte trace) forbliver konstant. AU = arbitrære enheder af grå værdier repræsenterer fluorescens tæthed.

Figur 9. ER calcium release på ATP stimulering af gliaceller. Gliaceller blev inficeret med rød-CES2 og fyldt med Ca ^{2 +} indikator Fluo5N-AM. Celler blev stimuleret med 200 pM ATP via perfusion i 10 sek. (A) Glialceller udtrykker røde CES2 (midten) er mærket med Fluo5N-AM (venstre). Den ROIs er fremhævet. (B) Enkeltværelse billeder udvundet fra time-lapse-sekvens. (Upper panel) Fluorescensintensiteten er høj ved 0 sek og 71 sek før cellerne reagerer. Det brat falder (80 sek), og når et minimum på 86 SEC, før den igen stiger (160 sek) som calcium pumpes tilbage ind på skadestuen. (nederste panel) Fluorescensintensitet af RFP aftager langsomt og kontinuerligt over tid som følge af blegning. (C) Time spor viser bf / F ₀ værdier for den ROIs angivet i A. fluorescens, med angivelse af calciumkoncentrationen, falder ned efter ATP stimulation og delvist kommer sig. Klik her for at se større figur .

Figur 10.. Høj opløsning billeddannelse af ATP-induceret calcium udgivelse i BHK21 celler. Cellerne blev fyldt med Fluo5N-AM og afbildet i overværelse af ekstracellulært calcium. (A) Billede serie viser ændringer i Fluo5N/Ca ^{2 +-afledt} fluorescens under ATP-stimulation. (B) Gennemsnitlig intensitet projektion billede viser ROIs vist i C. (C) ATP induceret calcium frigivelse og genopfyldning af ER calcium butikken er analyseret i små subregioner af ER. Sporene repræsenterer ændringer i fluorescens.

Excitation laser [nm]	Detection range [nm]
TED med rød-CES2 vektorkonstruktioner
473 (Fluo5N/Ca 2 +)	507-545
559 (Tag-RFP-T2)	> 570
TED med CES2 kun vektorkonstruktioner
473 nm (Fluo5N/Ca 2 +)	> 507

Tabel 1. Indstillinger for spektrale detektor.

Eksperiment	ER udtynding ved hjælp af en rød-CES2	Stimulering af neuroner ved hjælp af en CES2 konstrukt	Høj rumlig opløsning billeddannelse, CES2
Målsætning (NA)	20x vand (0,7)	20x vand (0,7)	40x oil/63x olie (≥ 1,3)
473 nm Laser
Power	1%		1%
HV A	600-780	600-780	400-780
Gain B	0-1%	1-2%	0%
Offset	0	0	0
559 nm Laser
power	1%	optioNALC	optionalC
HV A	600-780	optionalC	optionalC
Gain B	0-1%	optionalC	optionalC
Offset	0	optionalC	optionalC
Scanningshastighed	1-2Hz	Free run	Free run
Picture size	320x320 pixel	240x240 pixel	512x512 pixel
Scanning typen	I overensstemmelse	Tovejs	Nyquistcriterion (2 pixels / element)
Stimulation	100-200 uM ATP :5-15 sek 200-500 uM glutamat til 5-15 sek	100-200 uM Agonist: 5-15 sek
Pinhole	2-5 luftige diske	2-5 luftige diske	1 luftige disk

Tabel 2. Eksempler på mikroskop indstillinger i overensstemmelse med den type eksperiment A:. HV = strøm til photomultiplier detektor, B: gain = forstærkning af PMT signal, C: ekstraudstyr: kanalen er ledig til brug med andre røde fluorescerende farvestoffer (fx CMX-Ros til visualisering af mitokondrie potentiale) eller andre røde fluorescerende proteiner.

Discussion

De fordele og ulemper ved TED metoden er blevet drøftet indgående i de seneste publikationer ^34,35. Sammenlignet med andre ovenfor beskrevne fremgangsmåder, TED omgår problemet med at forstyrre og perfusion af cellerne. Desuden to aspekter skal fremhæves. Princippet om TED for ER calcium billeddannelse kræver (1..) Den målrettede ekspression af en aktiv carboxylesterase i ER lumen ved hjælp af TED vektorkonstruktioner og (2). Effektiv og præferentielle frigivelse af lav-affinitet syntetiske AM-estere af calcium farvestoffer i ER lumen.

1.. TED vektorkonstruktionerne

Figur 3 opsummerer udviklingen af TED vektorkonstruktioner. TED er udviklet på baggrund af CES familiens proteiner (EF 3.1.1.1). Disse proteiner er bosiddende medlemmer i ER lumen. For in vitro studerer rekombinante administration af CES-proteiner fungerer bedst efter stabil ekspression afprotein eller efter virusinfektion med moderate ekspressionsniveauer. På nuværende tidspunkt er det uvist, om andre proteiner med esteraseaktivitet kan erstatte CES proteiner til TED billeddannelse. Det anbefales ikke at bruge transient transfektion af TED vektorer for dynamisk ER calcium analyse fordi cellerne er mindre lydhør efter transfektion proceduren. CES-proteiner har brug for ordentlig målretning til ER lumen og dette trin behov for en effektiv spaltning af ER-signalpeptidet. Desuden er fastholdelse og genfinding af CES proteiner i ER lumen medieret af deres aminoterminale KDEL-lignende motiv. Disse mekanismer kan være mættet, når høje ekspressionsniveauer er produceret af TED vektorer efter transient transfektion. Dette kan forårsager en falsk lokalisering af CES-proteiner og støtter dannelsen af ​​proteinaggregater.

2.. Low-affinitet Ca ^{2 +} Indikatorer for TED

Den vigtigste ulempe ved TED skyldes begrænsninger af disponiblestand indikatorfarvestoffer for ikke-forstyrrende analyse af ER calcium. ER calcium billeddannelse med TED kræver indikatorfarvestoffer med en høj K _D (dvs. en lav affinitet) og en lav fluorescens i fravær af calcium. Baseres på vores erfaring Fluo5N-AM fungerer bedst, men denne indikator farvestof er ikke bleges-resistente. Den lave affinitet ^{Ca2 +} indikatorer Mag-fura2-AM (K _D ~ 25-50 uM) ³⁴ og Mag-Fluo4 (K _D ~ 20-25 uM) blev også testet. Begge farver godt læsset ind i ER strukturer ved TED, men risikoen for at producere "blandede signaler" ved stimulering af ER frigivelse er høj. Et "blandet signal" repræsenterer først en hurtig stigning i fluorescens i cytosolen efterfulgt af reduktion af fluorescens i ER. For at overvinde denne begrænsning, kan forstyrrende tilgange til ER calcium imaging hjælpe ^32,35. Mag-Fluo4 (K _D ~ 20-25 uM) viser en stærk TED-medieret etiket Golgi cisternae, hvilket er mindre udtalt, når Fluo5N-AM is brugt.

Applikationer og perspektiver

Her fokuserer vi på inverse laserscanning konfokal analyse af ER calcium dynamik med TED. TED målinger kan også tilpasses til enhver standard konfokal system eller wide-field system med den relevante excitationskilden (laser, LED, metal Halid lamper monokromator), filtre og fluorescens detektion systemet ^6..

TED er især nyttigt i de celler, der ikke udtrykker tilstrækkelig endogen CES aktivitet i ER. Vi observerede, fx BHK21 celler giver nok endogen esteraseaktivitet i ER at frigive lav affinitet indikatorer. I vores hænder, er det ikke tilfældet med mange andre cellelinjer (HEK293, SH-SY5Y, HeLa, PC12), primær glia, og primære neuroner. Her TED metoden giver mulighed for en vellykket ikke-forstyrrende farvestof lastning til skadestuen.

Fremtidige TED vektorer kan omfang dets anvendelse fra ER lumen tilandre subcellulære rum eller cellulære mikrodomæner. Princippet i TED metoden er uafhængig af indikatorfarvestoffet, og kan derfor anvendes med AM-ester af enhver farvestof, for eksempel til billeddannelse af intracellulære pH dynamik. For nylig laboratoriet af Luke D. Lavis beskrev, at det rekombinante svineleveresterase (PLE) CES1 danner en selektiv esterase-ester par med cyclopropylester farvestoffer ^42. Cyclopropylester agenter blev fundet at være resistente over for hydrolyse af endogene esteraser og selektive afmaskering af den rekombinante CES aktivitet aktiveret cellespecifik molekyle målretning ^42. Det vil være interessant at undersøge, om calcium indikatorer basere på denne nye teknik vil forbedre subcellulære målrette specificitet af syntetiske indikatorer.

TED fungerer bedst i cellelinjer, mens TED proteiner udtrykt stabilt. Etableringen af ​​en samling med stabile TED cellelinjer ville være gavnligt.

Transgene TED musemodeller er også et vigtigt mål for vores arbejde, og det vil sætte TED i særlige vævspræparater fra specifikke neuronale kredsløb, skeletmuskulatur, hjerte, eller præparater af det vaskulære system. Denne musemodel vil bidrage til at overføre analysen af ​​ER calcium dynamik fra celleniveau til mere fysiologisk væv sammenhæng.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
(S)-3,5-DHPG (Dihydroxyphenylglycine)	Tocris	0805
5';-ATP-Na2, ATP disodium salt hydrate	Sigma	A26209-1G
B-27 supplement,50x	Invitrogen	17504-044
Carbamoylcholine chloride (Charbachol)	Sigma	C4382-1g
Cyclopiazonic acid (CPA)	Ascent scientific	Asc-300
Dimethylsulfoxide (DMSO)	Sigma	D2650
DMEM with Glutamax	Invitrogen-Gibco	31966-047
Dulbecco's PBS without Ca/Mg 1x	PAA	H15-002
Fetal calf serum	Invitrogen-Gibco	10270-106
Fluo-5N-AM, 10 x 50 μg	Invitrogen	F14204
Glutamate	Ascent scientific	Asc-049
Glutamax	Invitrogen	35050-038
Ham's F12 nutrients mixture	Invitrogen-Gibco	21765-029
Hank's BSS(1x) without Ca,without Mg, with Phenol Red, HBSS	PAA Laboratories	H15-010
Horse serum	SHD3250YK	Linearis
Ionomycin Ca2+ salt	Ascent scientific	Asc-116
murine EGF	PreproTech	315-09
N2 supplement 100x	Invitrogen	17502-048
Neurobasal medium	Invitrogen-Gibco	21103-049
Pluronic F127, low UV absorbance,2g	Invitrogen	P6867
Poly-DL-ornithine hydrobromide PORN	Sigma	P8638
Poly-D-lysine hydrobromide	Sigma	P7280
Poly-L-Lysin	Sigma	P2636
Thapsigargin	Calbiochem	586005-1mg
TryLE Express	Invitrogen	12605-028
Trypsin	Worthington	LS-003707
Trypsininhibitor from Glycine MAX (soybean)	Sigma	T6522
Materials
Confocal system: inverted laser scanning microscope: FV1000 with IX81	Olympus		user-specific configuration
Confocal system: laser combiner FV10 and diode lasers (405, 473, 559, 635)	Olympus		user-specific configuration
Confocal system: scan head FV10-SPD with spectraldetector	Olympus		user-specific configuration
Heater controller TC-344B	Warner Instruments	64-0101	to control in line solution heater
NIH ImageJ software	WS Rasband, ImageJ, US National Institutes of Health, http://rsb.info.nih.gov/ij/, 1997--2006
Objective: UAPON20XW340 NA 0,7 WD 0,35	Olympus	N2709100
Objective: UPLFLN40XO	Olympus	N1478700
Objective: UPLSAPO60XO/1.35, WD=0.15	Olympus	N1480700
Perfusion chamber, inverse	custom-made
Perfusion chamber, RC-49FS	Warner Instruments	W4 64-1709
Perfusion tube: PT-49	Warner Instruments	64-1730	for perfusion
Peristaltic pump MiniPlus 3 (4 channels)	Gilson	n.a.	perfusion pump
Single inline solution heater SH-27B	Warner Instruments	64-0102	controlled by heater controller
Suction tubes: ST3R	Warner Instruments	64-1407	for perfusion
Heating insert: Tempocontrol 37-2 digital 2-channel	Pecon	n.a.