Summary
Mirata-esterasi indotta colorante di caricamento (TED) supporta l'analisi delle dinamiche di calcio intracellulare negozio di imaging di fluorescenza. Il metodo basa sul targeting di un carbossilesterasi ricombinante al reticolo endoplasmatico (ER), dove migliora la smascheramento locale di sintetico a bassa affinità Ca
Abstract
Visualizzazione delle dinamiche di calcio è importante per capire il ruolo del calcio nella fisiologia cellulare. Per esaminare le dinamiche del calcio, fluorescenti Ca 2 + indictors sintetici sono diventati popolari. Qui mostriamo TED (= colorante carico mirato-esterasi indotto), un metodo per migliorare il rilascio di Ca 2 + pigmenti indicatori nel lume ER di tipi cellulari. Ad oggi, TED è stato utilizzato in linee cellulari, cellule gliali e neuroni in vitro. Basi TED su efficiente, ricombinante di mira di un'attività ad alto carbossilesterasi al lume ER utilizzando vettori costrutti che esprimono carbossilesterasi (CES). Le ultime vettori TED contengono un elemento centrale della CES2 fuso ad una proteina fluorescente rossa, consentendo in tal modo l'imaging simultaneo a due colori. La dinamica del calcio libero in ER vengono esposte in un unico colore, mentre la corrispondente struttura di ER appare in rosso. All'inizio del procedimento, le cellule vengono trasdotte con un lentivirus. Successivamente, le cellule infette ari seminati su vetrini per consentire finalmente l'imaging cellulare dal vivo. Poi, le cellule viventi sono incubate con l'estere acetossimetil (AM-estere) sotto forma di bassa affinità Ca 2 + indicatori, per esempio Fluo5N-AM, Mag-Fluo4-AM, o Mag-Fura2-AM. L'attività esterasi nei unirà ER off catene laterali idrofobiche dal modulo AM del + indicatore Ca 2 e una idrofila colorante fluorescente / Ca 2 + complesso è formato e intrappolato in ER lumen. Dopo il colorante di caricamento, le cellule vengono analizzate con un microscopio confocale a scansione laser invertito. Le cellule sono continuamente perfusi con soluzioni di Ringer-like e le dinamiche del calcio ER sono direttamente visualizzati da time-lapse imaging. Rilascio del calcio dal RE è identificato da una diminuzione della intensità di fluorescenza in regioni di interesse, mentre il riempimento del negozio calcio ER produce un aumento di intensità di fluorescenza. Infine, la variazione di intensità fluorescente nel tempo è determinata mediante calcolo di Af / F 0.
Introduction
Al fine di risolvere le risposte fisiologiche di calcio del ER, abbiamo sviluppato una nuova strategia per migliorare la cattura di calcio sintetici coloranti sensibili al pronto soccorso. Il metodo consente la diretta, senza interruzioni monitoraggio in tempo reale di libero ER calcio in presenza di calcio extracellulare.
Funzione e segnalazione di calcio ER
Segnali di calcio si trovano in diversi tipi di cellule, ad esempio-cellule muscolari, neuroni e cellule gliali e la loro gamma di funzioni di mediazione contrazione muscolare ad un coinvolgimento nella trasmissione sinaptica nell'apprendimento e nella memoria di 1,2. Cambiamenti nella concentrazione di calcio libero sono di grande interesse scientifico perché il calcio è coinvolto nella regolazione della trascrizione genica, la proliferazione cellulare, eccitabilità neuronale, la morte cellulare e altri eventi di segnalazione cellulare 1-7. Tutti questi segnali di calcio cellulari sono funzionalmente collegati e contribuiscono a intracellulare di calcionegozio dinamiche 8-10.
Una caratteristica comune a tutti i segnali di calcio è il flusso di calcio tra lo spazio extracellulare, citoplasma e organelli, soprattutto il ER e mitocondri. Questo provoca cambiamenti dinamici nella concentrazione di calcio all'interno di questi organelli, che vengono rilevate dai diversi componenti di segnalamento. In generale, la concentrazione di calcio nelle gamme ER tra 100 a 800 pM, nel citosol della concentrazione di calcio è quasi 100 nM, e nello spazio extracellulare la concentrazione è di circa 1-2 mm. Pertanto, vi è una forza motrice elevato chimica per flusso di calcio verso il citosol 2,9,10.
I segnali di calcio ER-derivati più comunemente studiate dipendono dalla stimolazione dei recettori accoppiati alla proteina G (GPCR), che poi attivano la fosfolipasi C (PLC). PLC a sua volta produce inositolo 1,4,5-trifosfato (IP 3) 1. In seguito al legame di IP 3 alla sua receptor (IP 3-Rec, Figura 1) in ER-membrana, gli ioni calcio vengono rilasciati dal lume ER. Storicamente, IP rilascio di calcio 3-mediata dal pronto soccorso è stato il primo - anche se indirettamente - misurata in cellule pancreatiche acinose di Streb et al nel 1983 11.. Questa pubblicazione suggerito per la prima volta una cascata di segnalazione che coinvolge acetilcolina, fosfolipasi C, e IP 3. Questo modo di rilascio del calcio è generalmente definito IP rilascio del calcio 3-indotta (IiCR) (Figura 1). L'attivazione della chinasi-dipendente della fosfolipasi Cγ da recettore tirosin chinasi link l'azione di fattori di crescita e fattori neurotrofici di ER di calcio di segnalazione IP dopo 3 elevazione 12. Oltre a IiCR, elevazione di calcio può essere mediata da recettori ionotropici ingresso di calcio, per esempio attraverso i canali del calcio voltaggio-dipendenti (CA V), e il successivo rilascio di calcio di calcio indotta (CICR) di ryanodine rirecettori (RyR). IiCR e CICR sono fisiologicamente legati al negozio-Entry operato di calcio (SOCE). SOCE comprende l'azione di STIM (stroma interagenti molecola), che è un sensore per il rilascio di calcio ER. STIM ha mostrato di stimolare l'ingresso di calcio extracellulare attraverso canali potenziali transitori recettore (Trp) 13, Orai canali del calcio 14 e anche canali del calcio voltaggio-dipendenti 15 (Figura 1). Perdita di ER calcio viene salvato dinamicamente dall'azione del Sarco-reticolo endoplasmatico calcio ATPasi (SERCA), che attivamente pompe indietro calcio nel ER. Bloccare il SERCA con farmaci come thapsigargin svela una continua perdita di calcio ER al compartimento citosolico. Questo calcio ER "fuga" è causato da ER intramembrane complessi del poro come il complesso proteico Sec61 16,17 (figura 1).
Nel 1998, Berridge pubblicato un modello, il "neurone all'interno di un modello di neurone", which suggerisce un ruolo fisiologico principio della ER nell'integrazione di calcio neuronale 5. Questo modello considera l'esistenza di un sistema a membrana ER continuo formando una "immagine" intracellulare della membrana plasmatica neuronale 5. Questo sistema a membrana eucariotica binario è stato affermato di essere un prerequisito fondamentale per l'integrazione temporale e spaziale dei segnali veloci e lenti di calcio nei neuroni. Segnali di calcio che si verificano sia in concomitanza o successivamente in diverse spine o dendriti del neurone stesso sono conferiti a soma o nucleo attraverso il pronto soccorso, dove vengono riassunte 5,18 della cellula. Quindi, la loro somma può avere effetto sul l'eccitabilità del neurone, regolazione della trascrizione genica o l'integrazione di cascate di segnalazione. Così, l'ER sostiene l'integrazione dei segnali di calcio. Una condizione per questo concetto è la continuità della ER in una singola cella, che è stato rivendicato da diversi studi e che è stato dimostrato almeno per somato-daree endritic e breve distanza proiezioni assonali 19-21. Che ci sia continuità ER entro lunghe proiezioni assonale è una questione di dibattito.
Strategie per misurare il flusso di calcio gratis su membrana ER
Segnali di calcio sono più frequentemente monitorati nel citosol 22,23. Pertanto, non può essere distinto facilmente se Ca 2 + fluisce nel citosol da extracellulare o da riserve intracellulari 6,24. Per superare questa limitazione, sono state sviluppate strategie metodologiche per l'imaging diretto di calcio ER. In sintesi, le seguenti strategie da utilizzare sono: (1) ER-mirati geneticamente proteine indicatori 25-27 a base di proteine a bassa affinità Ca 2 + indicatori utilizzano la proteina bioluminescente aequorina o GFP in combinazione con una proteina di rilevamento. Calcio. Queste Ca 2 + indicatori geneticamente (GeCIS) puòessere mirati al pronto soccorso con l'aiuto di un peptide segnale e sono tenute attivamente al pronto soccorso con una ritenzione e motivo recupero. Comune ER Ca 2 + indicatori di base sul principio Cameleon e sono il Cameleon YC4.3 26,28; Cameleon spaccatura YC7.3ER 29, e Cameleon D1 30. (2) colorante diretto carico esterasi a base di AM-estere a bassa affinità Ca 2 + indicatori 31,32. Dell'indicatore di coloranti (Mag-Fura2-AM, Mag-Fluo4-AM o Fluo5N-AM)-derivati AM passare il membrane biologiche in una lipofila, Stato di calcio-insensitive. Poi, nel citosol, nonché in ER, esterasi endogene fendere del gruppo AM-estere e rilasciano l'indicatore di Ca 2 +, lasciando una certa quantità di colorante attivo nel citosol e nel ER. Pertanto, questo approccio è utile in condizioni di una concentrazione elevata di calcio in ER finché la concentrazione di calcio citosolico rimane ben al di sotto delimite di protezione degli indicatori a bassa affinità, in particolare durante segnali di calcio caratteristici (per esempio nM a basse pM). (3) loading AM-estere in associazione con permeabilizzazione della membrana plasmatica 32. Qualsiasi residuo + citosolico indicatore Ca 2 viene rimosso mediante permeabilizzazione della membrana plasmatica con piccole quantità di un detergente "neutro" (ad es saponina) in un tampone intracellulare artificiale. Così, le membrane intracellulari possono essere stimolate, ad esempio con IP 3 nel buffer intracellulare, direttamente attraverso "pori" nella membrana plasmatica. (4) Dialisi del citosol in configurazione whole-cell e misure simultanee di Ca 2 + nel lume ER e il citosol 32,33. Una cella viene prima caricato con una bassa affinità Ca 2 + indicatore (ad esempio Mag-Fura2- AM, raziometrico, luce UV). In seguito, con l'aiuto di una pipetta di patch, qualsiasi residuo cytosolic Ca + indicatore a bassa affinità 2 viene dializzato dal citosol con un tampone contenente un Ca 2 + indicatore ad alta affinità (es. Fluo-3, luce visibile). Questa strategia consente la registrazione simultanea di segnali derivati citosolici e ER. (5) Targeted-esterasi indotta colorante carico 8,34. Un carbossilesterasi (CES) è mirato a lume del ER e fornisce una elevata attività di esterasi intrappolamento efficiente del modulo AM-estere di bassa affinità Ca 2 + indicatori.
Mirata-esterasi indotta colorante di caricamento (TED)
Per migliorare il targeting di bassa affinità Ca 2 + indicatori per l'ER lumen, TED è stato sviluppato. TED richiede la sovraespressione di un ER carbossilesterasi topo mirata (CES2) (Figura 2), che si ottiene tramite costrutti di espressione. Cellule esprimenti un CES-costrutto ricombinante vengono incubate con il modulo AM-estere di un calcio nelgnalazione colorante (Fluo5N-AM, la Figura 2). Poi, in ER, il colorante viene convertito al Ca 2 + sensibile, membrana impermeabile Ca 2 + indicatore complesso (Fluo5N/Ca 2 +) dall'attività elevata esterasi, quindi intrappolando il colorante in una concentrazione elevata nel lume ER 8 , 34. Il metodo è particolarmente utile per indagare ER calcio-release tramite i IiCR-percorsi per esempio tramite metabotropici purinergici-o glutammato recettori, 8,34 e visualizzare ER deplezione di calcio attraverso "canali di perdite" direttamente, per esempio, dopo il blocco del SERCA 17 , 34. Per la nostra esperienza la bassa affinità Ca 2 + indicatore Fluo5N-AM è attualmente il miglior indicatore disponibile per l'utilizzo con la strategia di caricamento TED colorante. Fluo5N-AM ha una bassa affinità per il Ca 2 + (costante di dissociazione K D ~ 90 pM, Figura 2), è quasi non fluorescente nella sua AM-forma, ma fornisce alta emissione di fluorescenza upon calcium 8,34 vincolante. Il Fluo5N/Ca 2 + complesso può essere eccitato con una sorgente luminosa standard di ~ 490 nm, che corrisponde a coloranti standard come FITC, Alexa 488, o eGFP. Segnali di calcio citosolico raggiungono appena un concentrazione nell'intervallo pM bassa e sono quindi appena rilevati dal Fluo5N nel citosol 35.
Per migliorare la prestazione TED, sono stati sviluppati diversi costrutti vettore ricombinante (Figura 3). In origine, vettori TED base alla sequenza codificante di CES2 (Refseq numero adesione NM_145603, CES2c) e migliori prestazioni TED si osserva con espressione stabile del CES costrutti. Nuovi TED vettori esprimono un elemento centrale della CES2 fusa alla proteina fluorescente rossa TagRFP-T2 36. Questi vettori hanno il vantaggio che possono essere utilizzati per identificare cellule trasdotte e di utilizzare la fluorescenza rossa come controllo interno per la normalizzazione dei cambiamenti in Fluo5N/Ca 2 + fluorescenza. La fluorescenza rossa offre anche la possibilità di visualizzare la distribuzione strutturale del ER e cambiamenti nelle dinamiche ER in condizioni di stimolazione.
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Protocol
Questo protocollo introduce TED applicata alle linee di cellule, neuroni ippocampali e cellule gliali corticali. TED performance è migliore quando vettori TED sono stabilmente espresse, ad esempio vettori lentivirali. Una panoramica schematica del metodo TED è mostrato in Figura 4.
1. Preparazione delle soluzioni
Le seguenti soluzioni devono essere preparate prima di iniziare e possono essere conservati come indicato. Usiamo generalmente di vetro sterilizzati e materiale plastico e acqua autoclavato.
- Preparare HEPES-Ringer (in mm): 125 NaCl, KCl 3, 25 HEPES, 2 MgSO 4 .7 H 2 O, 2 CaCl 2, 1.25 NaH 2 PO 4 H 2 O, 10 glucose.H 2 O.. Priva di calcio HEPES-Ringer è costituito da (in mM): 127 NaCl, KCl 3, 25 HEPES, 2 MgSO 4 .7 H 2 O, 1.25 NaH 2 PO 4 H 2 O, 10 glucose.H 2 O e 0,1 EGTA.. Senza glucosio queste soluzioni di imaging può be conservati a 4 ° C. La quantità richiesta di D-glucosio è appena aggiunto prima dell'uso.
- Per l'analisi TED in neuroni dell'ippocampo, si consiglia di liquido cerebrospinale artificiale (ACSF). ACSF è composto di (in mM): 127 NaCl, 23 NaHCO 3, 3 KCl, 2,5 NaHPO 4 H 2 O, 25 D-glucose.H 2 O, 2 CaCl 2, 2 MgCl2 .7 H 2 0 in DDH. 2 0.
- Preparare Fluo5N-AM per una concentrazione di 5 mM. Per aiutare la solubilizzazione aggiungere 8,9 ml di 20% Pluronic F-127 (in DMSO, conservato a temperatura ambiente, al riparo dalla luce e dall'umidità) a 50 mcg di liofilizzato Fluo5N-AM. Poi solubilizzare Fluo5N-AM per mezzo di un sonicatore bagnomaria per almeno 2 min. Conservare aliquote à 0,5 microlitri a -20 ° C, al riparo dalla luce e dall'umidità.
- Preparare antagonista e le scorte agonisti come necessario. Per esempio: a) 10 mM ATP o ADP (in H 2 O, l'attivazione dei recettori metabotropici purinergici), b) 10 mM carbachol in H 2 O (agonistadei recettori muscarinici dell'acetilcolina), c), 30 mM acido ciclopiazonico (CPA) in DMSO (bloccante del SERCA), d) DHPG 50 mM in PBS (metabotropici agonista del recettore del glutammato per mGluR I e mGluR 5), e), 10 mM glutammato in H 2 O, f) 1 mM in DMSO ionomicina (ionoforo), g), 5 mM in DMSO thapsigargin (ad alta affinità bloccante del SERCA). Conservare aliquote a -20 ° C.
- Vettori lentivirali: Questo protocollo prevede l'utilizzo di particelle lentivirali TED vettore di espressione. La loro produzione e stoccaggio, non sono parte di questo protocollo. Usiamo vettori lentivirali della seconda generazione per il trasferimento di carbossilesterasi a linee cellulari ricombinanti, cellule gliali e neuroni. Le nostre basi di sistema lentivirali sul vettore di espressione FUGW 37, ed i plasmidi di imballaggio pCMVΔR8.91 o psPAX2 e il pseudotipizzazione plasmide pMD2.G 38,39. ATTENZIONE: Si consideri che il lavoro con i ricombinanti di auto-inattivanti vettori lentivirali richiede l'attentaconsiderazione delle linee guida di biosicurezza. In molti paesi, questi vettori sono classificati come gruppo a rischio di rischio biologico 2. Per ulteriori informazioni fare riferimento al http://www.addgene.org/lentiviral/ .
2. Preparazione e Infezione virale del topo neuroni dell'ippocampo
- Lavare vetrini in una piastra di Petri di vetro del diametro di 20 cm (100 vetrini per ogni piatto) 1x in etanolo al 70% per circa 30 min. Infine, aggiungere 100% di etanolo (pa) per 2 min. Rimuovere l'etanolo residuo e asciugare i vetrini sotto una cappa sterile.
- Preparare due diversi tipi di mezzi di comunicazione per le culture dei neuroni dell'ippocampo: (a) di media Neurobasal con B27 01:50, (b) piena media: media Neurobasal con B27 01:50, Glutamax 1:100, 1:100 e supplemento N2. Sterile filtrato i media e le conserva in incubatrice cella fino al momento dell'uso.
- Un giorno prima della dissezione, i coprioggetti sono preparati mettendo prima uno sterile 10 millimetri coprioggetto in ognipozzetto di una piastra da coltura cellulare 4-well. Successivamente, accuratamente rivesta ogni coprioggetto con 80-100 microlitri 0,1% poli-L-lisina e memorizzare i piatti in un incubatore per tutta la notte.
- Al giorno di dissezione e coltura cellulare, iniziare con i coprioggetti lavaggio per tre volte con 100 microlitri HBSS e trasferire 100 ul medio neurobasal ad ogni coprioggetto. Porre le capsule in un incubatore di equilibrio (per esempio durante la dissezione dei topi).
Dissection
Eseguiamo i nostri esperimenti con i topi in conformità con le linee guida dell'Unione Europea, come approvato dalla nostra cura degli animali e del Comitato Istituzionale uso.
- Rimuovere il cervello totale e sezionare la ippocampi bilateralmente.
- Rimuovere accuratamente eventuali meningi e tessuto diverso l'ippocampo e mettere un ippocampo ciascuno in una provetta ml 1,5 contenente 450 microlitri HBSS. Memorizzare il tessuto in ghiaccio fino è stato isolato un numero sufficiente di ippocampi.
- Aggiungere 50 microlitri 1% tripsina (Worthington) a ciascuna provetta e incubare a 37 ° C bagnomaria per 15 min. Agitare le provette di tanto in tanto. Per arrestare la reazione di digestione, aggiungere 50 microlitri tripsina inibitore 1% a ciascuna provetta e capovolgere la provetta diverse volte.
- Trasferire tutti i tessuti di un massimo di 5 ippocampi a uno da 15 ml tubo falcon evitando il trasferimento di liquido. Aggiungere B27-medium (a) ad un volume finale di 5 ml.
- Triturare il tessuto utilizzando un incendio lucidato pipetta Pasteur di vetro con attenzione pipettare su e giù. ATTENZIONE: Evitare bolle d'aria!
- Gira con 400 xg per 3 minuti, aspirare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 5 ml di B27-media (a).
- Triturare il tessuto una volta con la pipetta di vetro, e quindi due volte con l'aiuto di un microlitri punta di plastica filtro 1000. Eseguire questa come descritto nei punti 2.9 e 2.10.
- Dopo l'ultima centrifugazione, risospendere il pellet cellulare in 2 ml pieno medium (b) e triturare celle con un filtro di plastica microlitri punta 200. Per separare rimanenti grumi di cellule dalla cella singola sospensione, far grumi di cellule stabilirsi per 1-2 min.
- Contare le cellule e calcolare il numero totale di cellule necessarie per infezione virale. Per l'imaging TED utilizzare 25.000 cellule per 10 millimetri coprioggetto.
- Placcatura ulteriore 25.000 cellule non trasdotte esempio un comando è raccomandato a questo punto.
Infezione virale
- Trasferire la sospensione cellulare per infezione virale in un fresco 15 ml tubo falcon e centrifugare per 3 min a 400 x g.
- Aspirare il surnatante e sospendere nuovamente le cellule in 300 microlitri medio (b)
- Aggiungere una quantità appropriata di lentivirali TED particelle di vettore di espressione infettive e lasciare che il tubo falcon riposare a temperatura ambiente per 10 min.
- Riempire il tubo con il mezzo pieno (b) per il volume finale necessario per la placcatura (100 l per ogni 10 millimetri vetrino), aspirare il terreno dal COVerslip, e collocare immediatamente 100 ml sospensione cellulare su ogni vetrino.
- Porre le capsule in incubatrice fino a quando tutte le celle si sono stabiliti (circa 2 ore) e con attenzione riempire i piatti fino a quando essi contengono 2 ml di mezzo (b).
- Lasciate che i neuroni si sviluppano per almeno una settimana. Sostituire il 50% del mezzo ogni settimana.
3. Cultura e Viral-infezione di topo cellule gliali corticali
Preparazione
- Iniziare con la creazione basale media glia (miscela 1:1 di DMEM/F12 FCS al 10%, 5% HS, 1% di penicillina / streptomicina, 0,45% glucosio) e rivestimento di un pallone di coltura cellulare T75 con 4 ml di 0,5 ng / ml Poly -DL-ornitina bromidrato (porno) (diluito in soluzione di acido borico 150 mM, pH 8.35). Dopo incubazione a 37 ° C per 2 ore o durante la notte, lavare il matraccio di coltura cellulare per tre volte con HBSS e aggiungere 18 ml basale media glia contenente B27 1:50 e 10 ng / ml EGF. Equilibrare il pallone di coltura cellulare in incubatrice (fino a 3 ore).
- Eseguiamo i nostri esperimenti con i topi in conformità con le linee guida dell'Unione Europea, come approvato dalla nostra cura degli animali e del Comitato Istituzionale uso.
- Sezionare il cervello di un topo P5-P7 e rimuovere l'ippocampo e meningi da due emisferi come descritto in 2.5.
- Sezionare la corteccia frontale, tagliarla in tanti piccoli pezzi e raccoglierli in una provetta ml 1,5 contenente HBSS. Conservare la provetta in ghiaccio e procedere alla cultura parte delle cellule.
Coltura cellulare
- Trasferire tutti i tessuti dal tubo di un tubo di 15 ml falco usando un fuoco pipetta di vetro lucido.
- Aggiungere terreno base ad un volume finale di 5 ml e triturare il tessuto pipettando più volte su e giù con una pipetta di vetro lucido fuoco. Dopo centrifugazione a 300 xg per 3 minuti, aspirare il terreno, e risospendere il pellet cellulare in 5 ml di terreno di base.
- Ripetere il punto 3.5 due volte.
- Dopo il third centrifugazione, risospendere il pellet di cellule in 2 ml basale medio glia contenenti B27 (1:50) e 10 ng / ml di EGF.
- Titruate nuovamente e trasferire la sospensione cellulare al pallone di coltura cellulare preparata T75 e lasciate cellule crescono per 3-4 giorni.
Lavaggio delle cellule gliali (dopo 3-4 giorni di coltura):
- Lavare le cellule una volta con 10 ml di PBS e vigorosamente toccare o delicatamente colpire il pallone un paio di volte con la mano, tenendolo stretto nell'altra mano. Da questo passaggio e detriti cellulari raggruppamenti cellulari vengono rimossi dalla coltura.
- Aspirare il PBS e aggiungere mezzo fresco glia basale contenente B27 (1:50) e 10 ng / ml di EGF. Ulteriori coltivare la cultura per 5-7 giorni fino a quando le cellule raggiungono l'80% di confluenza.
Scissione, trasduzione e semina finale di cellule gliali:
- Cappotto 10 millimetri coprioggetto con 100 l poli-D-lisina (Soluzione: 0,1%, diluito 1/50 ad 20 mg / ml in PBS o HBSS) e incubareloro in un incubatore per tutta la notte. Lavare coprioggetto tre volte con HBSS e aggiungere 100 microlitri di medie glia basale. Equilibrare coprioggetto in incubatrice (3 ore).
- Lavare le cellule gliali due volte con 10 ml di PBS, aspirare il PBS e aggiungere 3 ml di tripsina (TrypLE, non diluito). Trypsinize cellule per un massimo di 1 min. ATTENZIONE: Evitare di tripsinizzazione. Normalmente più del 80% di tutte le cellule si staccano dopo 1 min e questo è sufficiente avere diversi milioni di cellule sane.
- Arrestare la reazione aggiungendo 10 ml basale medio glia, trasferire la sospensione cellulare in un tubo da 15 ml Falcon, centrifugare a 300 xg per 3 min. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 5 ml di mezzo glia basale.
- Ancora una volta, girare e aspirare, come descritto al punto 3.15, quindi risospendere le cellule in 5 ml basale medio Glia.
- Trasferire il numero necessario di cellule in una provetta da 1,5 ml. 10 4-2x10 4 cellule gliali sono sufficienti per un 10 millimetri coprioggetto. Solitamente, la sospensione volUME trasdurre cellule per un 4-ben piatto è inferiore a 200 ml. Aggiungere una quantità appropriata di particelle lentivirali TED vettore di espressione per le cellule e incubare a RT per 10 min. Poi riempire la sospensione con basale medio glia al volume seeding (100 microlitri per coprioggetto).
- Seed 100 microlitri di cellule infette per coprioggetto e incubare per circa 2 ore, quindi aggiungere mezzo glia basale contenente B27 01:50 e 10 ng / ml di EGF ad un volume finale di 2 ml.
- Per le condizioni di coltura ideali utilizzare le cellule per gli esperimenti sul 3-7 giorni dopo la placcatura.
4. Generazione e Cultura Reporter Cell Line
TED linee cellulari del reporter sono stati stabiliti sulla base delle HeLa, BHK21, HEK293 e SH-SY5Y. Qui forniamo il protocollo per le cellule HeLa, ma il protocollo può essere trasferita in qualsiasi altra linea di cellule pure.
Generazione della linea cellulare HeLa stabile
- Dividere un tipo di linea cellulare HeLa selvaggia e trasferimento 100.000 cells in un volume di 200 microlitri di una provetta da 1,5 ml.
- Aggiungere una quantità appropriata di particelle lentivirali TED vettore di espressione al tubo ed incubare la sospensione cellulare-virus per 10 minuti a RT. Poi seme le cellule in un volume totale di 2 ml di medium (DMEM, 10% FCS, 1% di penicillina / streptomicina) in un piatto di 30 mm ed incubare per 3 giorni.
- Dopo aver lavato una volta con PBS, aspirare a medio e aggiungere 500 microlitri tripsina (TrypLE, 2:3 in PBS). Incubare per ca. 3 min e poi fermare la reazione con l'aggiunta di 3 ml di mezzo. Trasferire la sospensione in una provetta da 15 falco e centrifugare a 400 xg per 3 min.
- Risospendere il pellet di cellule in 200 microlitri di medie e ancora infettare le cellule con particelle lentivirali come descritto in 4.2. Poi, le cellule di semi in un pallone di coltura T25 cellulare in 10 ml di mezzo.
- Crescere le cellule fino a quando una confluenza del 60-80% è raggiunto. Poi dividere la cultura.
TED linee cellulari giornalista
- TED linee cellulari del reporter possono mantenereed in qualsiasi mezzo standard, ad esempio DMEM contenente il 5% o 10% FCS e 1% di penicillina / streptomicina viene utilizzato.
- Targa un numero appropriato di cellule in un piatto 4 pozzetti sterili contenenti 10 millimetri coprioggetto (vedi sopra), ad esempio 10.000 a 20.000 cellule per vetrino coprioggetto.
- Crescere le cellule per almeno due giorni prima di usarli per TED imaging.
5. Preparazione per la Procedura vivo Imaging a un microscopio invertito
- Preriscaldare HEPES-Ringer a temperatura ambiente e aggiungere D-glucosio.
- Preriscaldare il ACSF (senza Ca 2 + e Mg 2 +) a temperatura ambiente e aggiungere D-glucosio. Aerare il ACSF con CARBOGEN per 5 minuti. Quindi aggiungere 1 M soluzioni stock di CaCl2 e MgCl2 a concentrazioni finali di 2 mm ciascuno.
- Avviare i microscopi di imaging dal vivo e tutti i programmi per computer.
- Iniziare perfusione su una camera di imaging "fittizio" ed equilibrare il sistema di tubi.
- Preriscaldare il riscaldatore soluzione in linea e la camera di imaging in fase microscopio. Fissare la camera di imaging in un inserto di riscaldamento.
- Equilibrare il sistema a 32-37 ° C prima di iniziare la procedura di caricamento del colorante. ATTENZIONE: Per evitare il flusso accidentale di liquido di perfusione nel sistema di microscopio che usiamo legami dei capelli attorno agli obiettivi e fogli di silicone elastomero (1mm) per proteggere il palco microscopio.
6. Dye Caricamento di entrambi i tipi delle cellule
- Risospendere 1 aliquota di Fluo5N-AM (vedi 1.3) in 100 ml soluzione di imaging preriscaldata (HEPES-Ringer o ACSF).
- Solubilizzare Fluo5N-AM nella soluzione di imaging (HEPES-Ringer o ACSF) in un sonicatore bagnomaria per 90 sec.
- Utilizzare un fresco 4 - o 24-ben 400 microlitri soluzione di imaging preriscaldata piatto e trasferimento in un pozzetto. Aggiungere la soluzione colorante allo stesso bene a venire a 500 pl di una soluzione 5 mM.
- Collocare il vetrino con le cellule (ad esempio10-18 mm di diametro) nel pozzo, le cellule verso l'alto.
- Incubare per un adeguato periodo di tempo in un incubatore per colture cella a 37 ° C (nel frattempo preparare impostazioni di imaging in fase microscopio). Tipici tempi di colorante di caricamento sono per i neuroni e cellule gliali 7-15 min e per linee cellulari 10-20 min.
CRUCIALE: Tempo Dye-caricamento e concentrazione di colorante dipendono dal tipo di cellula, densità cellulare, e le esigenze specifiche esperimento! Lunghi tempi di incubazione in presenza del colorante possono danneggiare le cellule, i neuroni soprattutto primarie e cellule gliali primarie e questo è fondamentale per la capacità di risposta a stimoli fisiologici. Volte a lunga incubazione (per esempio 30 min) sarà utile solo per ER esperimenti di localizzazione di calcio per studiare la distribuzione di calcio ER in piccole strutture cellulari, come ad esempio neuriti multa o spine. In alcuni esperimenti, una miscela di 1/3 di terreno di coltura con soluzione di imaging possono proteggere cellule durante Fluo5N-AMcarico.
- Immediatamente, trasferire il vetrino all'altro coltura cellulare e contenente soluzione di imaging (HEPES-Ringer o ACSF) e iniziare il montaggio delle cellule nella camera di imaging.
7. ER-calcio imaging cellulare dal vivo con un laser invertito microscopio confocale a scansione
- Utilizzare un pennello per applicare alto grasso per vuoto ad una camera di imaging. Il grasso è necessario per fissare il coprioggetto sul fondo della camera di perfusione. Usiamo camere di imaging self-made per 10-12 mm coprioggetto con un piccolo volume, permettendo così alte velocità di perfusione fino a cambio di buffer di 15 volte al minuto. Una camera di perfusione disponibile in commercio per 18 millimetri coprioggetto, può essere acquistato da Warner strumenti (RC-49FS). Tale camera permette inoltre stimolazione del campo di neuroni.
- Sollevare il vetrino con le cellule Fluo5N-caricati e aggiungere una piccola goccia di soluzione di imaging (50-100 ml) sulle cellule per mantenere le cellule ricoperte di soluzione di imaging.Girare il coprioggetto e montare le cellule nella camera di imaging. Per premere il vetrino nel silicio-colla, utilizzare un batuffolo di cotone (es. Q-tips).
- Asciugare tampone residuo dal fondo del vetrino di vetro con bastoncini di cotone. ATTENZIONE: Pulire delicatamente l'umidità residua quando si utilizza un obiettivo-olio con elevata apertura numerica per l'imaging ad alta risoluzione. Sale residuo viene rimossa meglio l'acqua. Striscio accidentale di grasso può essere rimosso con acetone o etanolo puro.
- Cambio della camera di imaging "fittizio" con la camera di imaging sperimentale. Lavare le cellule per 5-10 minuti con perfusione continua.
- Lavare le cellule per 5 - 10 minuti di perfusione continua.
- Per la selezione delle cellule utilizzare una quantità minima di illuminazione laser, alti tassi di scansione (2-4 Hz), immagini di piccole dimensioni, e un alto guadagno.
- ATTENZIONE: Per la selezione di celle Fluo5N-etichettati non utilizzare l'eccesso di illuminazione a luce diretta o con epifluorescent luce. Bright illuminazione di Fluo5N/Ca 2 + complessi provoca la perdita completa della fluorescenza ER-specifico entro 2-4 secondi (Figura 5).
- Impostare il microscopio secondo l'esperimento pianificato. Per l'orientamento, le impostazioni rappresentative per la rappresentazione con vettori diversi TED sono riportati in Tabella 1. Per la microscopia confocale a scansione laser invertito, usiamo un microscopio Olympus IX81 combinato con un sistema confocale FluoView 1000 che è dotato di laser a diodi (473 nm, 15 mW, 559 nm, 20 mW) e un sistema rivelatore spettrale.
- All'inizio del documento esperimento le cellule di interesse per alta risoluzione x, yz stack di immagini.
- Eseguire x, yt imaging per monitorare dinamiche di calcio ER nelle condizioni sperimentali specifiche. Impostazioni tipiche per il nostro sistema sono elencati nella Tabella 2.
- Monitorare i cambiamenti in calcio ER sotto perfusione continua con soluzione di imaging. Tassi di cambio di buffer tipici sono exemplarily: (a) il lavaggio cellulare e store-deplezione da SERCA blocco: 1,5 ml / min; (b) ATP / DHPG stimolazione: 3 ml / min.
- Acquisire le immagini digitali preferenzialmente con 12 bit (4096 livelli di grigio). Per l'imaging parallelo di Fluo5N/Ca 2 + e RFP, immagini a 8 bit (256 livelli di grigio) può salvare il sistema di troppo pieno di dati.
- Memorizzare le immagini in diretta delle cellule di serie temporali (x, yt) o pile di immagini 3D (x, yz) (per la distribuzione cellulare di Fluo5N/Ca 2 + complessi) in un formato compatibile con ImageJ (ad esempio TIFF).
8. Image Processing e Analisi dei Dati
- Aprire la serie di immagini nel programma ImageJ. In caso di multicolore di imaging, dividere i canali RGB quando gli viene chiesto di ImageJ.
- Identificare la propria regione (s) di interesse (ROI) da un attento esame delle pile di immagini (ad esempio, con l'aiuto di una intensità vs plot tempo)
- Utilizzare il plugin Time-Series Analizzatore di leggere l'intensità media dei pixel in un ROI (F crudo). Depending di proposito, disegnare ROI attorno o al pronto soccorso completa o piccole regioni del ER ER esempio dei dendriti delle cellule regioni periferiche. Includere anche 1-3 ROI in zone prive di cellule per la sottrazione del fondo.
- Calcolare la fluorescenza di fondo medio (F b) calcolando il valore di fluorescenza media del fondo ROI e sottrarre il valore di fondo F b dai valori grezzi F per ottenere il valore F roi.
- Calcolare F 0, che è la fluorescenza basale delle cellule, calcolando il valore medio di dieci a 30 valori di fluorescenza per ogni ROI in uno stato di riposo.
- Calcolare i background-corretti cambiamenti relativi a fluorescenza da Af / F 0 dalla formula:
- Variazioni relative presenti in fluorescenzance come traccia con Af / F 0 per l'asse Y e il tempo per l'asse X.
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Representative Results
Questo protocollo fornisce un approccio non distruttivo per l'imaging diretto di libera ER calcio. Bassa affinità sintetica Ca 2 + indicatori vengono rilasciati e intrappolati nel lume ER con l'aiuto di un ER mirati, attività enzimatica esterasi ricombinante. Migliorata caricamento delle Ca 2 + indicatore coloranti al pronto soccorso lume consente una rappresentazione diretta e veloce di ER calcio negozio dinamiche.
Tipi di cellule per TED
La fattibilità del metodo è stato dimostrato in linee cellulari BHK21, HEK293 34, HeLa 17, SH-SY5Y, astrociti in coltura 8,40 e neuroni ippocampali e corticali primarie 8,34,41. Nei nostri esperimenti, TED funziona bene quando TED costrutti vengono stabilmente espresse, preferenzialmente da auto-inattivanti vettori lentivirali 37,39 utilizzando un promotore relativamente debole (per esempio il promotore dell'ubiquitina) 35. Altri, promotori forti sono sotto inchiesta.
Riuscito TED carico con Fluo5N offre una colorazione chiara e luminosa del ER lumen, che è risparmiata dalla regione nucleare 34,41. Al afferma riposo, il 2 + etichetta complesso Fluo5N/Ca rappresenta la localizzazione di calcio quando vincolato da Fluo5N, quindi, rappresenta la distribuzione regionale di calcio libero nel lume ER. In figura 6, di immagini confocali Fluo5N/Ca 2 +-complessi ed etichette Tag-RFP-T2 di Red-CES2 sono presenti in cellule HeLa, astrociti e neuroni corticali ippocampali. Figura 6C rivela la fluorescenza Ca 2 + complesso indicatore nella cella corpo e neuriti dei neuroni dell'ippocampo. Ciò consente l'esame di Ca 2 + segnali in piuttosto piccoli processi (vedi anche 34,35).
L'esperienza è necessaria per distinguere l'etichetta tipica ER da un'etichetta citosolico che verrà osservato when caselle sono danneggiate o insalubri. Citosolici, esterasi endogene rilasciano inoltre Fluo5N, che porta ad una colorazione molto brillante del citosol e nucleo quando calcio è perdendo attraverso la membrana plasmatica. Colorazione citoplasmatica di Fluo5N/Ca 2 + è stato osservato anche quando le cellule TED-etichettati sono trattati con il ionomicina ionoforo, in presenza di calcio extracellulare (Figura 7).
L'imaging diretto di rilascio del calcio dal pronto soccorso
Una delle principali applicazioni del TED è la visualizzazione diretta di ER negozio esaurimento 17,34. Nella Figura 8, mostriamo un esperimento rappresentativo effettuato con neuroni dell'ippocampo, esprimendo Red-CES2. Neuroni con Red-CES2 arricchiscono elevate quantità di Fluo5N nella regione perinucleare (frecce in figura 8). Quando il SERCA bloccante CPA è applicato mediante perfusione, si osserva un rapido esaurimento del negozio calcio ER (Figura 8B). Ecco a voi lavalori grezzi (asse y) che si ottengono quando i neuroni sono oggetto di immagine con 12 bit. Condizioni di imaging sono elencati nella Tabella 2. Si noti l'enorme cambiamento nella densità media di fluorescenza per il ROI che si osserva quando TED è applicato ai neuroni. Per gli altri esperimenti che analizzano il rilascio di calcio ER nei neuroni che utilizzano TED, vorremmo fare riferimento a precedenti esperimenti, che erano già state discusse in dettaglio 8,34,35. In breve, TED in neuroni in vitro è usato per visualizzare l'archivio di calcio ER SERCA-sensibile in grande dettaglio da invertito confocale laser a scansione microscopia 8,34 ed è stato applicato con successo per l'imaging veloce (15 Hz) di mGluR1 / 5 indotta IiCR 34.
La Figura 9 mostra un tipico esperimento con il mouse astrociti corticali in vitro, stimolata da 200 mM ATP attraverso il sistema di perfusione a bassa risoluzione con obiettivo 20x acqua. Dopo l'infezione lentivirale, le cellule mostrati qui espressi Red-CES2, che è guidata da un promotore di ubiquitina. La velocità di scansione è stato ~ 2 Hz e di entrambi i canali (Fluo5N/Ca 2 + e proteina di fusione Red-CES2) sono stati contemporaneamente ripreso (in linea). All'inizio dell'esperimento le cellule gliali hanno mostrato una buona infezione con i costrutti di espressione e il buon carico con Fluo5N-AM. Il ROI che sono stati analizzati sono evidenziate in Figura 9A. Uno ROI è stato impostato per misurare la fluorescenza di fondo (bg), ROI 1-2 misurare la fluorescenza delle cellule complete, ROI 3 copre appena l'ER della cellula e ROI 4 è stato disegnato intorno al campo visivo completo. Poco dopo stimolazione con ATP fluorescenza del Fluo5N/Ca 2 + complessi bruscamente diminuite a causa di Ca 2 + libero dal pronto soccorso. Infine, l'ER è parzialmente riempito con calcio nuovo. Contemporaneamente, la fluorescenza del RFP diminuisce continuamente come conseguenza di lieve sbianca (Figura 9B, riquadro inferiore). Tracce che rappresentano cambiamenti di fl intensità mento (Figura 9C) punti a un importante svantaggio di TED. In molti esperimenti (non tutti) elevate quantità di Fluo5N-complessi vengono persi durante la stimolazione. Di conseguenza, i valori di fluorescenza non tornano al livello di intensità di fluorescenza iniziale.
La Figura 10 mostra una cellula BHK21 CES2-infetta ad alta risoluzione, etichettato da Fluo5N/Ca 2 + e stimolate con ATP. BHK21 cellule serviti come un sistema di celle a modello in anticipo per ER calcio analisi 31. Si noti che il rilascio di calcio ER e store-riempimento viene visualizzato in strutture fini dei tubuli ER. Le strutture erano state ripreso a bassa velocità (~ 0,2 Hz), con 512 x 512 pixel, Airy disco 1 impostazione per il foro stenopeico confocale, e con un obiettivo 63x olio.
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Figura 1. Panoramica di segnalazione del calcio ER. Rilascio di calcio ER è causato da canali "fuga", come la ER intramembrane poro complesso Sec61. I recettori accoppiati a proteine G (GPCR) stimolano la produzione di 3 IP, che poi provoca IP rilascio di calcio 3-indotta (IiCR). Rilascio del calcio ER viene rilevata da complessi STIM e induce negozio-azionato ingresso di calcio (SOCE) di canali ionici della famiglia Trp e / o canali del calcio Orai. Canali del calcio voltaggio-dipendenti (CA V) mediare veloce rilascio di calcio indotto da calcio (CICR) di recettori rianodinici (RyR) sia per l'interazione proteina diretta (muscolo scheletrico) o l'interazione fisiologica (cellule del muscolo cardiaco, neuroni). La perdita di ER calcio viene salvato dinamicamente l'azione della pompa SERCA (sarcoplasmatico-ATPasi del reticolo endoplasmatico calcio).
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Figura 2. Principio di mirati-esterasi indotta colorante di caricamento (TED). Sovraespressione mirato di un carbossilesterasi fornisce una elevata attività esterasi (CES2) al pronto soccorso. Il esterasi converte il acetoxymethylester colorante Fluo5N-AM per un colorante sensibile al calcio, fluorescente che rimane intrappolato in ER. Fluo5N ha una bassa affinità per ioni calcio. Pertanto, in condizioni di riposo, fluorescente Fluo5N/Ca 2 + complessi sono formate preferenzialmente in ER, in cui la concentrazione di calcio è circa 1.000 volte superiore nel citosol.
Figura 3. Rappresentante TED costrutti vettoriali CES2.: Versione nativa di topo CES2. CES2 OPT 43: La ERsegnale peptide è stato scambiato ed ora include un introne, mentre il motivo di ritenzione ER è stato cambiato al classico ritenzione KDEL-ER e recupero motivo delle proteine solubili ER. Un tag myc fornisce un epitopo per il rilevamento delle proteine mediante l'etichettatura immunofluorescenza indiretta e Western blot. Rosso-CES2 8,43: Una proteina fluorescente rossa venne aggiunto direttamente dietro il peptide segnale aminoterminale. Rosso LK CES2 43: Un linker glicina-serina è stato introdotto per stabilire una cerniera flessibile tra la RFP e l'elemento CES2.
Figura 4. Il flusso di lavoro per l'imaging di calcio ER diretta con TED. Sospensioni cellulari cellule primarie o linee cellulari vengono trasdotte con un virus che contiene un costrutto di espressione TED. Le cellule vengono poi seminate su coverslips. Quando si utilizza RFP-CES2 costrutti, cellule trasdotte possono essere identificate utilizzando la fluorescenza rossa. Colorante carico target-esterasi indotta viene eseguita incubando le cellule in una soluzione di imaging contenente un AM-accoppiata a bassa affinità Ca 2 + indicatore, come Fluo5N-AM o Mag-Fura2-AM. ER calcium imaging viene eseguita con un microscopio a scansione laser invertito (vedi protocollo) o qualsiasi altro dispositivo di imaging compatibile. Durante l'imaging dal vivo le cellule sono in perfusione continua con una soluzione di imaging come liquido cerebrospinale artificiale (ACSF). Stimolazione cellulare viene effettuata sia mediante perfusione o di pressione locale-eiezione.
Figura 5. Forte illuminazione epifluorescenza distrugge l'etichetta ER-specifico Fluo5N TED pochi secondi. Immagini rappresentative da un video, ripreso con un microscopio di imaging in posizione verticale. Qui, le cellule gliali espressing RFP-CES2 sono stati caricati con Fluo5N-AM. Prima la fluorescenza rossa di una cellula infettata è stato rivelato con una telecamera CCD. Successivamente, il segnale Fluo5N/Ca 2 + è stato illuminato con una sorgente luminosa a LED. Un primo evidente la localizzazione di ER Fluo5N/Ca 2 + complessi (frecce gialle) viene rapidamente distrutta da una forte illuminazione con una sorgente di luce a LED 470 e uno spostamento nella distribuzione fluorescenza diventa visibile nel settore nucleare (frecce gialle, 12,46 sec).
Figura 6. TED carico con Fluo5N-AM in diversi tipi di cellule del pannello superiore:. Cellule HeLa con stabile espressione RED-CES2 pannello centrale:. Astrociti corticali dopo trasduzione lentivirali con Red-CES2 pannello inferiore:. Neuroni dell'ippocampo con il rosso-CES2 a 8 DIV. Tutte le cellule sono state coltivate su vetrini e colorate con Fluo5N-am, come descritto nella sezione metodo. Il Fluo5N/Ca 2 + label rappresentano anche la localizzazione di calcio quando legato a Fluo5N. Scala grafica di 40 micron.
Figura 7. Fluo5N colorante nel citoplasma diventa visibile dopo il trattamento ionomicina. Cellule gliali sono stati infettati con Red-CES2, etichettati con Fluo5N-AM, e trattati con la thapsigargin SERCA-bloccante per esaurire calcio ER. Trattamento ionomicina indotto un forte afflusso di calcio extracellulare. (Pannello superiore) Le cellule mostrano un drastico aumento Fluo5N/Ca 2 fluorescenza +-mediata. (Pannello inferiore) L'immagine media di proiezione intensità del Fluo5N/Ca 2 +-label rivela un tipico etichettatura citosolica dal complesso calcio fluorescente Freccia blu:. Una cella etichettata brillantemente indica che questa cella ha elevate quantità di calcio in the citosol. Presumibilmente, questa cella è danneggiata freccia viola:. Cellule diventano vivaci etichettati nel citosol in seguito al trattamento ionomicina.
Figura 8. ER calcio negozio di esaurimento nei neuroni bloccando il SERCA. (A) neuroni dell'ippocampo (DIV 9) espresso Red-CES2 (A, rosso) ed etichettati come Fluo5N-AM (A, verde). Le frecce indicano due cellule analizzate. L'immagine (proiezione di massima intensità) è un elemento ritagliata di ascia, YZ-immagine che è stata acquisita all'inizio dell'esperimento. (B) le tracce grezze rappresentano l'ER calcio negozio di esaurimento dopo perfusione con 30 mM CPA. Qui 1.000 immagini sono state scattate con 1 Hz e 12 bit. I valori grezzi del media densità fluorescenza per ROI (asse Y) delle due celle sono mostrati in Atracciata nel tempo (rosso e traccia blu). I valori di fondo (traccia nera) rimangono costanti. AU = unità arbitrarie di valori di grigio rappresentano la densità di fluorescenza.
Figura 9. ER rilascio di calcio su ATP stimolazione delle cellule gliali. Cellule gliali sono stati infettati con il rosso-CES2 e caricato con il Ca 2 + indicatore Fluo5N-AM. Le cellule sono state stimolate con 200 mM ATP tramite perfusione per 10 sec. (A) Le cellule gliali che esprimono Red-CES2 (al centro) sono etichettati con Fluo5N-AM (a sinistra). Il ROI sono evidenziati. (B) immagini singole estratte dalla sequenza di time-lapse. (Pannello superiore) L'intensità di fluorescenza è elevato a 0 sec e 71 sec prima che le cellule reagiscono. Diminuisce bruscamente (80 sec) e raggiunge un minimo a 86 SEc, prima che rialza (160 sec) come calcio viene reimmessa nel ER. (pannello inferiore) intensità di fluorescenza delle RFP decresce lentamente e continuamente nel tempo a causa sbiancamento. (C) mostra tracce Fuso Af / F 0 valori per il ROI indicato in A. La fluorescenza, indicando la concentrazione di calcio, scende verso il basso dopo stimolazione ATP e recupera in parte. Clicca qui per ingrandire la figura .
La figura 10. L'imaging ad alta risoluzione di rilascio del calcio ATP indotta BHK21 cellule. Cellule sono stati caricati con Fluo5N-AM e ripreso in presenza di calcio extracellulare. (A) Serie di immagini che illustrano l'evoluzione Fluo5N/Ca 2 fluorescenza +-ATP-realizzati durante la stimolazione. (B) immagine media intensità di proiezione indica il ROI mostrati in C. (C) ATP rilascio di calcio indotto e la ricarica del negozio calcio ER è analizzato in piccoli sub-regioni del ER. Le tracce rappresentano variazioni di fluorescenza.
| Eccitazione laser [nm] | Gamma di rilevamento [nm] |
| TED con Red-CES2 costrutti vettoriali | |
| 473 (Fluo5N/Ca 2 +) | 507-545 |
| 559 (Tag-RFP-T2) | > 570 |
| TED con CES2 solo costrutti vettoriali | |
| 473 nm (Fluo5N/Ca 2 +) | > 507 |
Tabella 1. Impostazioni per il rivelatore spettrale.
| Esperimento | ER esaurimento con un rosso-CES2 | La stimolazione dei neuroni utilizzando un costrutto CES2 | Imaging ad alta risoluzione spaziale, CES2 |
| Obiettivo (NA) | 20x acqua (0.7) | 20x acqua (0.7) | Olio oil/63x 40x (≥ 1,3) |
| 473 nm Laser | |||
| Potenza | 1% | 1% | |
| HV A | 600-780 | 600-780 | 400-780 |
| Guadagno B | 0-1% | 1-2% | 0% |
| Offset | 0 | 0 | 0 |
| 559 nm Laser | |||
| potere | 1% | OptioNALC | optionalC |
| HV A | 600-780 | optionalC | optionalC |
| Guadagno B | 0-1% | optionalC | optionalC |
| Offset | 0 | optionalC | optionalC |
| Velocità di scansione | 1-2Hz | Free run | Free run |
| Dimensione immagine | 320x320 pixel | 240x240 pixel | 512x512 pixel |
| Tipo di scansione | In linea | Bidirezionale | Nyquistcriterion (2 pixel / elemento) |
| Stimolazione | 100-200 mM ATP :5-15 sec; 200-500 mM glutammato per 5-15 sec | 100-200 micron Agonista: 5-15 sec | |
| Pinhole | 2-5 dischi ventilati | 2-5 dischi ventilati | 1 disco arioso |
Tabella 2. Esempi di impostazioni del microscopio a seconda del tipo di esperimento A:. HV = corrente al rilevatore fotomoltiplicatore, B: guadagno = amplificazione del segnale PMT, C: optional: il canale è libero per l'uso con altri coloranti fluorescenti rossi (es. CMX-Ros per la visualizzazione del potenziale mitocondriale) o altre proteine fluorescenti rosse.
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Discussion
I vantaggi e gli svantaggi del metodo di TED sono state ampiamente discusse in recenti pubblicazioni 34,35. Rispetto ad altri metodi sopra descritti, TED elude il problema di interrompere e perfusione delle cellule. Inoltre, due aspetti hanno bisogno di essere sottolineato. Il principio di TED per ER calcium imaging richiede (1.) L'espressione mirata di un carbossilesterasi attiva nel lume ER con l'aiuto del TED costrutti vettoriali e (2.) Il rilascio efficiente e preferenziale di bassa affinità sintetici AM-esteri di coloranti calcio nel lume ER.
1. TED vettore costruisce
Figura 3 riassume lo sviluppo di TED costrutti vettoriali. TED è stato sviluppato sulla base di proteine della famiglia CES (EC 3.1.1.1). Queste proteine sono membri residenti in ER lumen. Per gli studi in vitro la somministrazione di proteine ricombinanti CES funziona meglio dopo espressione stabile delproteina o dopo l'infezione virale con livelli di espressione moderati. Al momento, non si sa se altre proteine con attività esterasi possono sostituire le proteine del CES per TED imaging. Non è raccomandato l'uso di trasfezione transiente di vettori TED per l'analisi dinamica di calcio ER perché le cellule sono meno reattivi dopo la procedura di trasfezione. Proteine CES bisogno di una corretta mira a ER lume e questa fase ha bisogno di un efficiente scissione del peptide segnale ER. Inoltre, la conservazione e il recupero delle proteine CES di ER lume è mediata dalla loro aminoterminale motivo KDEL-like. Questi meccanismi possono essere saturi quando elevati livelli di espressione sono prodotte da vettori TED dopo trasfezione transiente. Questo può causa una falsa localizzazione delle CES-proteine e sostiene la formazione di aggregati proteici.
2. Bassa affinità Ca 2 + Indicatori per TED
L'inconveniente principale di TED è dovuto alle limitazioni del dispocoloranti indicatori capaci per l'analisi non distruttiva di ER calcio. ER calcium imaging con TED richiede pigmenti indicatori con un elevato K D (cioè una bassa affinità) e una bassa fluorescenza in assenza di calcio. Sulla base della nostra esperienza Fluo5N-AM funziona meglio, ma questo indicatore colorante non è candeggina-resistente. La bassa affinità Ca 2 + indicatori Mag-Fura2-AM (K D ~ 25-50 micron) e 34 Mag-Fluo4 (K D ~ 20-25 mM) sono stati testati. Entrambi i coloranti sono ben caricati in strutture ER da TED, ma il rischio di produrre "segnali misti" dopo stimolazione del rilascio ER è elevato. Un "segnale misto" rappresenta in primo luogo un rapido incremento della fluorescenza nel citosol seguita dalla diminuzione della fluorescenza in ER. Per superare questo limite, approcci dirompenti per ER imaging del calcio possono aiutare 32,35. Mag-Fluo4 (K D ~ 20-25 micron) mostra una forte marchio TED-mediata del Golgi cisterne, che è meno pronunciato quando Fluo5N-Am Is usato.
Applicazioni e Prospettive
Qui ci concentriamo sulla scansione analisi confocale di ER calcio dinamico con TED laser inverso. Misurazioni TED possono anche essere adattati a qualsiasi sistema confocale standard o sistema a grande campo, con la fonte appropriata di eccitazione (laser, LED, lampade di metallo Halid, monocromatore), filtri e sistema di rilevazione di fluorescenza 6.
TED è particolarmente utile in quelle cellule che non esprimono sufficiente attività CES endogena in ER. Abbiamo osservato che per esempio le cellule BHK21 forniscono attività esterasi abbastanza endogena al pronto soccorso per liberare gli indicatori a bassa affinità. Nelle nostre mani, questo non è il caso di molte altre linee cellulari (HEK293, SH-SY5Y, HeLa, PC12), glia primaria e neuroni primari. Qui, il metodo TED consente un successo senza interruzioni colorante carico al pronto soccorso.
Future TED vettori potranno essere estesi sua applicazione dal ER lume dialtri compartimenti cellulari o microdomini cellulari. Il principio del metodo TED è indipendente dal colorante indicatore, e può quindi essere utilizzato con l'AM-estere di qualsiasi tintura, ad esempio per l'imaging di dinamiche pH intracellulare. Recentemente, il laboratorio di Luca D. Lavis descritto che il porcino esterasi epatiche ricombinante (PLE) CES1 forma una coppia esterasi-estere selettivo con cyclopropylester coloranti 42. Agenti Cyclopropylester sono risultati essere resistenti all'idrolisi da esterasi endogene e lo smascheramento selettivo dal ricombinante CES attività abilitato cella specifica molecola di targeting 42. Sarà interessante verificare se gli indicatori di calcio basandosi su quella nuova tecnica migliorerà la subcellulare specificità di targeting di indicatori sintetici.
TED funziona meglio in linee cellulari in cui le proteine TED sono stabilmente espressi. La creazione di una collezione dalle linee cellulari stabili TED sarebbe vantaggioso.
Transgenici modelli TED mouse sono anche uno dei principali obiettivi del nostro lavoro e questo permetterà TED nella preparazione dei tessuti specifici di specifici circuiti neuronali, muscoli scheletrici, cuore, o le preparazioni del sistema vascolare. Questo modello di topo contribuirà a trasferire l'analisi delle dinamiche di calcio ER dal livello cellulare al contesto più fisiologico dei tessuti.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni della Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) BL567/3-1 e la Friedrich-Baur-Stiftung. Vorremmo ringraziare Roger Y. Tsien, Howard Hughes Medical Institute laboratori presso l'Università della California, San Diego per averci fornito Tag-RFP-T2. Noi per fortuna riconosciamo David Baltimore, California Institute of Technology, Pasadena, e Didier Trono, Università di Ginevra, Ginevra, per averci fornito il lentiviral plasmidi FUGW e psPAX2/pMD2.G.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (S)-3,5-DHPG (Dihydroxyphenylglycine) | Tocris | 0805 | |
| 5';-ATP-Na2, ATP disodium salt hydrate | Sigma | A26209-1G | |
| B-27 supplement,50x | Invitrogen | 17504-044 | |
| Carbamoylcholine chloride (Charbachol) | Sigma | C4382-1g | |
| Cyclopiazonic acid (CPA) | Ascent scientific | Asc-300 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| DMEM with Glutamax | Invitrogen-Gibco | 31966-047 | |
| Dulbecco's PBS without Ca/Mg 1x | PAA | H15-002 | |
| Fetal calf serum | Invitrogen-Gibco | 10270-106 | |
| Fluo-5N-AM, 10 x 50 μg | Invitrogen | F14204 | |
| Glutamate | Ascent scientific | Asc-049 | |
| Glutamax | Invitrogen | 35050-038 | |
| Ham's F12 nutrients mixture | Invitrogen-Gibco | 21765-029 | |
| Hank's BSS(1x) without Ca,without Mg, with Phenol Red, HBSS | PAA Laboratories | H15-010 | |
| Horse serum | SHD3250YK | Linearis | |
| Ionomycin Ca2+ salt | Ascent scientific | Asc-116 | |
| murine EGF | PreproTech | 315-09 | |
| N2 supplement 100x | Invitrogen | 17502-048 | |
| Neurobasal medium | Invitrogen-Gibco | 21103-049 | |
| Pluronic F127, low UV absorbance,2g | Invitrogen | P6867 | |
| Poly-DL-ornithine hydrobromide PORN | Sigma | P8638 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma | P7280 | |
| Poly-L-Lysin | Sigma | P2636 | |
| Thapsigargin | Calbiochem | 586005-1mg | |
| TryLE Express | Invitrogen | 12605-028 | |
| Trypsin | Worthington | LS-003707 | |
| Trypsininhibitor from Glycine MAX (soybean) | Sigma | T6522 | |
| Materials | |||
| Confocal system: inverted laser scanning microscope: FV1000 with IX81 | Olympus | user-specific configuration | |
| Confocal system: laser combiner FV10 and diode lasers (405, 473, 559, 635) | Olympus | user-specific configuration | |
| Confocal system: scan head FV10-SPD with spectraldetector | Olympus | user-specific configuration | |
| Heater controller TC-344B | Warner Instruments | 64-0101 | to control in line solution heater |
| NIH ImageJ software | WS Rasband, ImageJ, US National Institutes of Health, http://rsb.info.nih.gov/ij/, 1997--2006 | ||
| Objective: UAPON20XW340 NA 0,7 WD 0,35 | Olympus | N2709100 | |
| Objective: UPLFLN40XO | Olympus | N1478700 | |
| Objective: UPLSAPO60XO/1.35, WD=0.15 | Olympus | N1480700 | |
| Perfusion chamber, inverse | custom-made | ||
| Perfusion chamber, RC-49FS | Warner Instruments | W4 64-1709 | |
| Perfusion tube: PT-49 | Warner Instruments | 64-1730 | for perfusion |
| Peristaltic pump MiniPlus 3 (4 channels) | Gilson | n.a. | perfusion pump |
| Single inline solution heater SH-27B | Warner Instruments | 64-0102 | controlled by heater controller |
| Suction tubes: ST3R | Warner Instruments | 64-1407 | for perfusion |
| Heating insert: Tempocontrol 37-2 digital 2-channel | Pecon | n.a. | |
References
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