Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Direkte Imaging av ER Kalsium med målrettet-Esterase Induced Dye Loading (TED)

Published: May 7, 2013 doi: 10.3791/50317
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1, 3, 1
1Institute for Clinical Neurobiology, University of Wuerzburg, 2Department of Synapses - Circuits - Plasticity, Max Planck Institute of Neurobiology, Martinsried, 3Walter Brendel Centre of Experimental Medicine, Ludwig-Maximilians University of Munich

Summary

Målrettet-esterase indusert dye lasting (TED) støtter analysen av intracellulære kalsium store dynamikken av fluorescens bildebehandling. Metoden baserer på målretting av en rekombinant karboksylesterase til endoplasmatiske retikulum (ER), hvor det forbedrer den lokale avsløring av syntetisk lav affinitet Ca

Abstract

Visualisering av kalsium dynamikken er viktig å forstå hvilken rolle kalsium i cellen fysiologi. For å undersøke kalsium dynamikk, har syntetiske fluorescerende Ca 2 + indikatorene blitt populært. Her har vi demonstrere TED (= målrettet esterase-indusert fargestoff lasting), en metode for å forbedre frigjøring av Ca 2 +-indikatoren fargestoffer i ER lumen av forskjellige celletyper. Til dags dato ble benyttet i TED-cellelinjer, gliaceller, nerveceller og in vitro. TED baser på effektiv, rekombinant målretting av høy karboksylesterase aktivitet til ER lumen bruker vektor-konstruksjoner som uttrykker karboksylesterase (CES). De siste TED vektorer inneholder et kjerneelement i CES2 smeltet sammen til en rød fluorescerende protein, og dermed muliggjør samtidig to-farge bildebehandling. Dynamikken i fritt kalsium i ER er avbildes i én farge, mens tilsvarende ER struktur vises i rødt. Ved begynnelsen av prosessen, brukes-celler transdusert med en lentivirus. Deretter de infiserte celler enre sådd på Dekkglass å endelig gjøre det mulig live-cell imaging. Deretter blir levende celler inkubert med acetoksymetyl ester (AM-ester) form av lav affinitet Ca 2 + indikatorer, for eksempel Fluo5N-AM, Mag-Fluo4-AM, eller Mag-Fura2-AM. Den esterase aktivitet i ER spalter off hydrofobe sidekjeder fra AM-formen av Ca 2 +-indikator og en hydrofil fluorescerende fargestoff / Ca 2 + kompleks dannes og fanget i ER lumen. Etter at fargestoff lasting, blir cellene analysert på en invertert konfokal laser scanning mikroskop. Celler er kontinuerlig perfused med Ringer-lignende løsninger og ER kalsium dynamikk er direkte visualisert ved time-lapse imaging. Kalsium frigjøring fra ER er identifisert ved en nedgang i fluorescens-intensitet i regioner av interesse, mens den påfylling av ER kalsium butikken gir en økning i fluorescensintensiteten. Til slutt, er endringen i fluorescerende intensitet over tid bestemmes ved beregning av A f / F 0.

Introduction

For å løse fysiologiske kalsium reaksjoner fra ER, har vi utviklet en ny strategi for å forbedre fangst av syntetiske kalsium sensitive fargestoffer inn i ER. Metoden gjør det mulig direkte, ikke-forstyrrende sanntids overvåking av fri ER kalsium i nærvær av ekstracellulært kalsium.

Funksjon og signalering av Akutten Kalsium

Kalsium signaler finnes i forskjellige celletyper, for eksempel muskel-celler, nevroner og gliaceller og deres funksjoner spenner fra formidling muskelkontraksjon til et engasjement i synaptiske transmisjon i læring og hukommelse 1,2. Endringer i fritt kalsium konsentrasjonen er av høy vitenskapelig interesse fordi kalsium er involvert i reguleringen av gentranskripsjon, celleproliferasjon, neuronal oppstemthet, celledød og andre cellesignalisering hendelser 1-7. Alle disse cellulære kalsium signalene er funksjonelt koblet til og bidra til intracellulær kalsiumbutikken dynamikk 8-10.

Et felles trekk blant alle kalsium-signaler er flyten av kalsium mellom det ekstracellulære rom, cytosol og organeller, hovedsakelig ER og mitokondrier. Dette fører til dynamiske endringer i kalsium-konsentrasjon innenfor disse organeller, som er avfølt av forskjellige signalveier komponenter. Generelt, kalsium konsentrasjon på akuttmottaket varierer mellom 100-800 mikrometer, i cytosol kalsium konsentrasjonen er nær 100 nM, og i det ekstracellulære rom konsentrasjonen er rundt 1-2 mm. Følgelig er det en høy kjemisk drivkraft for kalsium flyter mot cytosol 2,9,10.

De mest vanlig undersøkte ER-avledet kalsium signaler avhenger av stimuleringen av G-proteinkoblede reseptorer (GPCR), som deretter aktiverer fosfolipase C (PLC). PLC i sin tur produserer inositol 1,4,5-trisphosphate (IP 3) 1. Ved binding av IP 3 til rec sineptor (IP 3-Rec, en figur) i ER-membranen, er kalsium ioner frigjøres fra ER lumen. Historisk sett var IP 3-mediert kalsium utgivelse fra ER først - selv om indirekte - målt i acinøse bukspyttkjertelen celler ved Streb et al i 1983 11.. Denne publikasjonen foreslått for første gang et signal kaskade involverer acetylkolin, fosfolipase C, og IP 3. Denne måten av kalsium utgivelsen er vanligvis betegnes IP 3-indusert kalsium utgivelse (IiCR) (Figur 1). Kinase-avhengig aktivering av fosfolipase Cγ av reseptor tyrosin kinaser lenker virkningen av vekstfaktorer og neurotrophic faktorer til ER kalsium signalisering etter IP 3 høyde 12. I tillegg til IiCR, kan kalsium høyde være mediert ved ionotrope kalsiuminngangen, for eksempel via spenningsstyrte kalsiumkanaler Ca (V), og påfølgende kalsium-indusert kalsium-slipp (CICR) ved re ryanodineceptors (RyR). IiCR og CICR er fysiologisk knyttet til butikk-opererte kalsium oppføring (SOCE). SOCE inkluderer virkningen av STIM (stroma samspill molekylet), som er en sensor for ER kalsium utgivelse. Stim har vist seg å stimulere ekstracellulær kalsium posten gjennom transient receptor mulige kanaler (Trp), 13 Orai kalsiumkanaler 14 og til og med spenningsstyrte kalsiumkanaler 15 (figur 1). Tap av ER kalsium er dynamisk reddet av handlingen av Sarco-endoplasmic retikulum kalsium ATPase (SERCA), som aktivt pumper kalsium tilbake i ER. Blokkerer SERCA med rusmidler som thapsigargin avduker en kontinuerlig tap av ER kalsium til cytosolic kupé. Dette ER kalsium "lekkasjen" er forårsaket av ER intramembrane pore komplekser slik som Sec61 proteinkompleks 16,17 (figur 1).

I 1998 publiserte Berridge en modell, "nervecellen innenfor et nevron modell", hh antyder et prinsipp fysiologisk rolle ER i å integrere neuronal kalsium fem. Denne modellen betrakter eksistensen av en kontinuerlig ER membransystem danner en intracellulær "bilde" av den neuronale plasmamembranen 5.. Dette binære eukaryote membran system ble hevdet å være en grunnleggende forutsetning for temporal og romlig integrasjon av raske og langsomme kalsium signaler i nerveceller. Kalsium signaler som oppstår enten samtidig eller senere i forskjellige pigger eller dendritter av samme nervecellen er overdratt til cellens soma eller kjernen via akuttmottaket, hvor de blir summert opp 5,18. Deretter kan deres sum ha effekter på excitability av nervecellen, regulering av gentranskripsjon eller integrering av signalering kaskader. Således støtter ER integrering av kalsium-signaler. En forutsetning for dette konseptet er at kontinuiteten av ER i en enkelt celle, som er blitt krevd av flere studier, og som har vist seg i det minste for somato-dendritic områder og kort avstand aksonale anslag 19-21. Enten det er ER kontinuitet i lange aksonale anslag er et spørsmål om debatt.

Strategier for å måle strømmen av fritt kalsium over ER membranen

Kalsium signaler er oftest overvåket i cytosol 22,23. Derfor kan det ikke lett kan identifiseres enten Ca 2 + strømmer inn i cytosol fra ekstracellulære eller intracellulære fra butikker 6,24. For å overkomme denne begrensningen, har metodiske strategier for direkte ER kalsium bildebehandling blitt utviklet. Oppsummert er følgende strategier brukt: (1) ER-målrettet genmodifisert protein-indikatorer 25-27 Protein-baserte lav affinitet Ca 2 + indikatorer bruke selvlysende protein aequorin eller GFP i kombinasjon med en kalsium sensing protein.. Disse genmanipulerte Ca 2 + indikatorer (GECIs) kanvære rettet til ER ved hjelp av en signal peptid og er aktivt holdt i ER ved hjelp av en retensjon og gjenfinning motiv. Felles ER Ca 2 + indikatorer base på Cameleon prinsippet og er Cameleon YC4.3 26,28; Cameleon split YC7.3ER 29, og Cameleon D1 30. (2) Direkte esterase-basert dye lasting av AM-ester lav affinitet Ca 2 + indikatorer 31,32. AM-derivater av indikatoren fargestoffer (Mag-Fura2-AM, Mag-Fluo4-AM eller Fluo5N-AM) passere biologiske membraner i en lipofile, kalsium-ufølsom tilstand. Deretter, i cytosol, så vel som i ER, endogene esteraser spalter av AM-estergruppen og slipper Ca 2 + indikator, etterlater en viss mengde aktivt fargestoff i cytosol og i ER. Derfor er denne tilnærmingen nyttig under betingelser med en høy kalsiumkonsentrasjon i ER så lenge cytosolisk kalsium-konsentrasjonen forblir godt under debeskyttelse grensen for lav affinitet indikatorer, særlig i karakteristiske kalsium signaler (f.eks nM til lave mikrometer). (3) AM-ester lasting i kombinasjon med plasmamembranen permeabilization 32.. Enhver gjenværende cytosoliske Ca 2 + Indikatoren fjernes ved plasmamembranen permeabilization med små mengder av en "mild" vaskemiddel (f.eks saponin) i en kunstig intracellulær buffer. Således kan de intracellulære membraner bli stimulert, for eksempel med IP 3 i den intracellulære buffer, direkte gjennom "porer" i plasmamembranen. (4) Dialyse av cytosol 'under hel-celle-konfigurasjon og samtidige målinger av Ca 2 + i ER lumen og cytosol 32,33. En celle først lastes med en lav-affinitets Ca 2 +-indikator (f.eks Mag-Fura2- AM, proporsjonal, UV-lys). Etterpå, med hjelp av en patch pipette, eventuelle gjenværende cytosolic lav-affinitets Ca 2 + indikator dialyseres ut av cytosol med en buffer som inneholder et høy-affinitets Ca 2 +-indikator (f.eks Fluo-3, synlig lys). Denne strategien gjør det samtidig opptak av cytosolic og ER avledet signaler. (5) Målrettet-esterase-indusert dye lasting 8,34. En karboksylesterase (CES) er rettet til lumen av ER og gir en høy esterase aktivitet for effektiv fangst av AM-ester form av lav-affinitet Ca 2 + indikatorer.

Målrettet-esterase indusert dye lasting (TED)

For å bedre målretting av lav affinitet Ca 2 + indikatorer til ER lumen, ble TED utviklet. TED krever overuttrykte en ER målrettet mus karboksylesterase (CES2) (figur 2), som oppnås via ekspresjonskonstruksjoner. Celler som uttrykker et rekombinant CES-konstruktet blir inkubert med AM-esterform av et kalsium idikator fargestoff (Fluo5N-AM, figur 2). Deretter, i ER, er fargestoffet omdannet til Ca2 + sensitiv, ugjennomtrengelig membran Ca 2 + indikator kompleks (Fluo5N/Ca 2 +) med høy esterase aktivitet, derfor overlapping fargestoffet i en høy konsentrasjon i ER lumen 8 , 34. Metoden er spesielt nyttig å undersøke ER kalsium-release via IiCR-trasé for eksempel via metabotrope, purinergiske-eller glutamat reseptorer 8,34 og visualisere ER kalsium uttømming via "lekkasje kanaler" direkte, for eksempel etter blokade av SERCA 17 , 34. Til vår erfaring med lav affinitet Ca 2 + indikator Fluo5N-AM er i dag den beste tilgjengelige indikatoren for å bruke med TED fargestoff lasting strategi. Fluo5N-AM har lav affinitet for Ca 2 + (dissosiasjonskonstant K D ~ 90 mikrometer, figur 2), er nesten ikke-fluoriserende i sin AM-form, men gir høy fluorescensemisjon på Calcium binding 8,34. Den Fluo5N/Ca 2 + kompleks kan bli eksitert med en standard-lyskilde på ~ 490 nm, som tilsvarer vanlige fargestoffer slik som FITC, 488 Alexa, eller eGFP. Cytosolisk kalsium signaler neppe oppnå en konsentrasjon i det lave uM området og blir derfor knapt påvises ved Fluo5N i cytosol 35..

For å forbedre TED ytelse, ble flere rekombinante vektor konstruksjoner utviklet (figur 3). Opprinnelig er TED vektorer basert på koding sekvensen av CES2 (Refseq tiltredelse nummer NM_145603, CES2c) og beste TED ytelse observert med stabil uttrykk for CES konstruksjoner. Nye TED vektorer uttrykke et kjerneelement i CES2 smeltet til rød fluorescens protein TagRFP-T2 36. Disse vektorene har den fordelen at de kan brukes til å identifisere transduserte celler og å bruke den røde fluorescens som en intern kontroll for normalisering av endringer i Fluo5N/Ca 2 + fluorescens. Den røde fluorescens tilbyr også muligheten for å visualisere det strukturelle fordeling av ER og endringer i ER dynamikk henhold stimulering forhold.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Denne protokollen introduserer TED brukes på cellelinjer, hippocampus nevroner og kortikale gliaceller. TED ytelsen er best når TED vektorer er stabilt uttrykt, for eksempel ved lentiviral vektorer. En skjematisk oversikt over TED-metoden er vist i figur 4..

En. Utarbeidelse av løsninger

Følgende løsninger bør være forberedt før du starter og kan lagres som angitt. Vi bruker vanligvis steriliserte glass og plastmateriale og autoklavert vann.

  1. Forbered HEPES-Ringer (i mm): 125 NaCl, 3 KCl, 25 HEPES, 2 MgSo4 0,7 H 2 O, 2 2 CaCl, 1,25 NaH 2 PO 4 H 2 O, 10 glucose.H 2 O.. Kalsium-fri HEPES-Ringer består av (i mm): 127 NaCl, 3 KCl, 25 HEPES, 2 MgSo4 0,7 H 2 O, 1,25 NaH 2 PO 4 H 2 O, 10 glucose.H 2 O og 0,1 EGTA.. Uten glukose disse tenkelig løsninger kan be lagret ved 4 ° C. Den nødvendige mengden av D-glukose er ferskt tilsatt før bruk.
  2. For TED analyse i hippocampus nevroner, er kunstig cerebrospinalvæsken (ACSF) anbefales. ACSF består av (i mm): 127 NaCl, 23 3 NaHCO, 3 KCl, 2,5 NaHPO 4 H 2 O, 25 D-glucose.H 2 O, 2 CaCl 2, 2 MgCl 2 .7 H 2 0 i DDH. 2 0.
  3. Forbered Fluo5N-AM til en konsentrasjon på 5 mm. For å hjelpe solubilisering legge til 8,9 mL av 20% Pluronic F-127 (i DMSO, lagret ved romtemperatur, beskyttet mot fuktighet og lys) til 50 ug av lyofiliserte Fluo5N-AM. Deretter oppløseliggjøre Fluo5N-AM ved hjelp av et vann-bad sonikator i minst 2 min. Lagres alikvoter av en 0,5 mL ved -20 ° C, beskyttet mot lys og fuktighet.
  4. Forbered antagonist og agonist aksjer etter behov. For eksempel: a) 10 mM ATP og ADP (i H2O, metabotropisk aktivering av purinergiske reseptorer), b) 10 mM carbachol i H2O (agonistav muskarine acetylcholin reseptor), c) 30 mM cyclopiazonic syre (CPA) i DMSO (blokkering av SERCA), d) 50 mM DHPG i PBS (metabotropisk glutamat-reseptoragonist for mGluR I mGluR og 5), e) 10 mM glutamat i H 2 O, f) 1 mM ionomycin i DMSO (ionofor), g) 5 mM thapsigargin i DMSO (høy affinitet blokkering av SERCA). Oppbevar alikvoter ved -20 ° C.
  5. Lentiviral vektorer: Denne protokollen omfatter bruk av lentiviral TED uttrykk vektor partikler. Sin produksjon og lagring er ikke en del av denne protokollen. Vi bruker lentiviral vektorer av den andre generasjonen for overføring av rekombinant karboksylesterase til cellelinjer, gliaceller og nevroner. Våre lentiviral system baser på ekspresjonsvektoren 37 FUGW, og emballasje plasmider pCMVΔR8.91 eller psPAX2 og pseudotyping plasmid pMD2.G 38,39. Forsiktig: Tenk at arbeidet med rekombinant selv-inaktivere lentiviral vektorer krever forsiktighensynet til biologisk retningslinjer. I mange land er disse vektorer klassifisert som biologisk risiko gruppe 2. For mer informasjon, se http://www.addgene.org/lentiviral/ .

2. Forberedelse og virusinfeksjon av mus hippocampus nevroner

  1. Vask glass Dekkglass i et glass petriskål på 20 cm diameter (100 Dekkglass per parabol) 1x i 70% etanol i ca 30 min. Til slutt tilsettes 100% etanol (pa) i 2 min. Fjerne gjenværende etanol og tørk Dekkglass under en steril hette.
  2. Forbered to forskjellige typer medier for hippocampus nevroner kulturer: (a) Neurobasal medium med B27 01:50, (b) fullt medium: Neurobasal medium med B27 01:50, Glutamax 1:100, og N2 supplement 1:100. Sterile filtratet media og lagre dem i cellen inkubator før bruk.
  3. En dag før disseksjon, blir Dekkglass fremstilles ved først å plassere en steril 10 mm dekkglass i hvertgodt av en 4-brønn cellekultur parabolen. Etterpå nøye pels hver dekkglass med 80-100 mL 0,1% Poly-L-lysin og lagre retter i en inkubator over natten.
  4. På dagen for disseksjon og cellekultur, begynne med å vaske dekkglass tre ganger med 100 mL HBSS og overføre 100 mL Neurobasal medium til hver dekkglass. Plasser kopper og kar i en inkubator for likevekt (f.eks under disseksjon av mus).

Disseksjon

Vi utfører våre eksperimenter med mus i samsvar med EUs retningslinjer, som er godkjent av vår institusjonelle dyr omsorg og utnyttelse komiteen.

  1. Fjern den totale hjernen og dissekere hippocampi bilateralt.
  2. Fjern forsiktig eventuelle hjernehinnene og vev annet enn hippocampus og plasser en hippocampus hver i en 1,5 ml tube inneholder 450 mL HBSS. Oppbevar vevet på is inntil et tilstrekkelig antall hippocampi er blitt isolert.
<p class = "jove_step"> Cell kultur

  1. Tilsett 50 pl 1% trypsin (Worthington) til hvert rør og inkuberes dem i et 37 ° C vannbad i 15 min. Riste rørene innimellom. For å stoppe digereringsreaksjon, tilsett 50 pl 1% trypsin inhibitor til hvert rør og invertere røret flere ganger.
  2. Overfør all vev av opptil 5 hippocampi til en 15 ml Falcon rør unngår overføring av væske. Legg B27-medium (a) til et sluttvolum på 5 ml.
  3. Triturer vev ved hjelp av en brann polert Pasteur glass pipette ved forsiktig pipettering opp og ned. FORSIKTIG: Unngå luftbobler!
  4. Spinn med 400 xg i 3 min, aspirer supernatanten og cellepelleten suspenderes i 5 ml B27-medium (a).
  5. Triturer vevet en gang med glasset pipette, og deretter to ganger med hjelp av en 1000 mL kunststoffsilen spiss. Utføre dette som beskrevet i trinn 2.9 og 2,10.
  6. Etter den siste sentrifugering, cellepelleten suspenderes i 2 ml fullstendig medium (b) og triturate celler med en 200 mL plast filter tips. For å skille gjenværende celle klumper fra encellet suspensjon, la celle klumper slå seg ned i 1-2 min.
  7. Tell cellene og beregne det totale antall celler som kreves for viral infeksjon. For TED bildebehandling bruke 25 000 celler per 10 mm dekkglass.
  8. Plettering ytterligere 25.000 ikke-transduced celler som en kontroll er anbefalt på dette punktet.

Viral infeksjon

  1. Overfør cellesuspensjonen for virusinfeksjon i en frisk 15 ml Falcon rør og sentrifuger i 3 minutter ved 400 x g..
  2. Aspirer supernatanten og resuspender cellene i 300 mL medium (b)
  3. Tilsett en passende mengde av infeksiøse lentiviral TED ekspresjonsvektor partiklene og la Falcon rør stå ved romtemperatur i 10 min.
  4. Fyll opp røret med full medium (B) til det endelige volum som er nødvendig for plating (100 ul for hver 10 mm dekkglass), aspireres mediet fra coverslip, og umiddelbart plassere 100 ul celle suspensjon på hver dekkglass.
  5. Plasser kopper og kar i inkubatoren til alle cellene har slått seg ned (ca. 2 timer) og omhyggelig fylle opp rettene før de inneholder 2 ml medium (b).
  6. Let nevroner vokse i minst en uke. Erstatte 50% av mediet hver uke.

3. Kultur og Viral-smitte av mus Kortikale gliacellene

Forberedelse

  1. Start med å forberede basal glia medium (01:01 blanding av DMEM/F12 med 10% FCS, 5% HS, 1% penicillin / streptomycin, 0,45% glukose) og belegg av en T75 cellekultur kolbe med 4 ml 0,5 ng / ml Poly -DL-ornitin-hydrobromid (PORNO) (fortynnet i 150 mM borsyre oppløsning, pH 8.35). Etter inkubering ved 37 ° C i 2 timer eller over natten, vask cellekultur kolbe tre ganger med HBSS og tilsett 18 ml gliaceller basal medium inneholdende B27 01:50 og 10 ng / ml EGF. Ekvilibrere cellekultur kolbe i inkubatoren (opp til 3 t).
<p class = "jove_step"> Disseksjon

  1. Vi utfører våre eksperimenter med mus i samsvar med EUs retningslinjer, som er godkjent av vår institusjonelle dyr omsorg og utnyttelse komiteen.
  2. Dissekere hjernen til en P5-P7 mus og fjern hippocampus og hjernehinnene fra begge halvkuler som beskrevet i 2.5.
  3. Dissekere frontal cortex, klippe det opp i flere små biter og samle dem i en 1,5 ml tube inneholder HBSS. Oppbevar røret på is og fortsette til cellekultur del.

Cellekultur

  1. Overfør all vev fra røret til et 15 ml Falcon rør ved hjelp av en brann polert glass pipette.
  2. Legg basal medium til et sluttvolum på 5 ml og triturer vevet ved å pipettere flere ganger opp og ned med en brann polert glass pipette. Etter sentrifugering ved 300 x g i 3 min, aspireres mediet, og cellepelleten suspenderes i 5 ml basalmedium.
  3. Gjenta trinn 3.5 to ganger.
  4. Etter third sentrifugering, cellepelleten suspenderes i 2 ml medium inneholdende basal gliaceller B27 (01:50) og 10 ng / ml EGF.
  5. Titruate igjen og overføre cellen suspensjon til den klargjorte T75 cellekultur kolbe og la cellene vokse i 3-4 dager.

Vask av gliaceller (etter 3-4 dager i kultur):

  1. Vask cellene gang med 10 ml PBS og kraftig trykk eller forsiktig treffer flasken et par ganger med hånden din, mens du holder den fast i den andre hånden. Ved dette trinnet celleavfall og celle grupper blir fjernet fra kulturen.
  2. Aspirer PBS og legge friske basal glia medium som inneholder B27 (01:50) og 10 ng / ml EGF. Videre dyrke kulturen i 5-7 dager før cellene nå 80% confluency.

Splitting, transduksjon og siste såing av gliacellene:

  1. Coat 10 mm dekkglass med 100 pl Poly-D-lysin (Stamoppløsning: 0,1%, fortynnet 1/50 ad 20 pg / ml i PBS eller HBSS) og inkuberesdem i en inkubator over natten. Vask Dekkglass tre ganger med HBSS og tilsett 100 mL basal glia medium. Likevekt Dekkglass i inkubatoren (3 timer).
  2. Vask gliacellene to ganger med 10 ml PBS, aspirer PBS, og tilsett 3 ml trypsin (TrypLE, ufortynnet). Trypsinize celler i opptil 1 min. FORSIKTIG: Unngå over-trypsinization. Normalt mer enn 80% av alle cellene er frittliggende etter 1 min, og dette er tilstrekkelig til å ha flere millioner av friske celler.
  3. Stopp reaksjonen ved å tilsette 10 ml gliaceller basal medium, overfør cellesuspensjonen til en 15 ml Falcon-rør, sentrifuge ved 300 x g i 3 min. Aspirer supernatanten og cellepelleten suspenderes i 5 ml basal glia medium.
  4. Igjen, spinn og aspireres som beskrevet i trinn 3,15, deretter resuspender cellene i 5 ml basal medium Glia.
  5. Overfør det nødvendige antall celler til et 1,5 ml rør. 10 4-2x10 4 gliaceller er tilstrekkelig for en 10 mm dekkglass. Vanligvis suspensjonen volUME å transduce celler for en 4-vel-fatet er mindre enn 200 pl. Tilsett en passende mengde av lentiviral TED ekspresjonsvektor partikler på cellene og inkubere dem ved RT i 10 min. Deretter fylle opp suspensjonen med basal glia medium til seeding volum (100 mL per dekkglass).
  6. Seed 100 ul av infiserte celler pr dekkglass og inkuberes i omtrent 2 timer, og deretter legge gliaceller basal-medium inneholdende B27 01:50 og 10 ng / ml EGF i et sluttvolum på 2 ml.
  7. For ideelle kultur vilkår bruke celler for eksperimenter på dag 3-7 etter platekledning.

4. Generasjon og kultur Reporter Cell Linje

TED reporter cellelinjer ble etablert på grunnlag av HeLa, BHK21, HEK293 og SH-SY5Y. Her gir vi protokollen for Jakten celler, men protokollen kan overføres til noen annen cellelinje også.

Generasjon av stabil HeLa cellelinje

  1. Dele en villtype HeLa cellelinje og overføre 100.000 calen i et volum på 200 ul til et 1,5 ml rør.
  2. Tilsett en passende mengde av lentiviral TED ekspresjonsvektor partikler til røret og inkuber celle-virus-suspensjon i 10 minutter ved RT. Deretter frø cellene i et totalt volum på 2 ml medium (DMEM, 10% FCS, 1% penicillin / streptomycin) i 30 mm fatet og inkuber i 3 dager.
  3. Etter å ha vasket en gang med PBS, aspirere medium og tilsett 500 mL trypsin (TrypLE, 02:03 i PBS). Inkuber i ca. 3 min og deretter stoppe reaksjonen ved tilsetning av 3 ml medium. Overfør suspensjonen inn i et 15 ml Falcon rør og sentrifuger ved 400 x g i 3 min.
  4. Resuspender cellepelleten i 200 ul medium og igjen infisere cellene med lentiviral partikler som beskrevet i 4.2. Deretter frø celler i en cellekultur T25 kolbe i 10 ml medium.
  5. Dyrk celler inntil en konfluens på 60-80% er nådd. Deretter delt kulturen.

TED reporter cellelinjer

  1. TED reporter cellelinjer kan opprettholdeed i en hvilken som helst standard medium, f.eks DMEM inneholdende 5% eller 10% FCS og 1% penicillin / streptomycin benyttes.
  2. Plate et passende antall celler i et 4-vel tallerken med sterile 10 mm dekkglass (se ovenfor), for eksempel 10 000 til 20 000 celler per dekkglass.
  3. Vokse celler i minst to dager før du bruker dem for TED bildebehandling.

5. Forberedelse til Live Imaging Prosedyre ved en Inverted Microscope

    1. Prewarm HEPES-Ringers opp til romtemperatur og tilsett D-glukose.
    2. Prewarm ACSF (uten Ca 2 + og Mg2 +) til romtemperatur og tilsett D-glukose. Lufte ACSF med carbogen i 5 minutter. Så 1 M forrådsoppløsninger av CaCl 2 og MgCl2 til sluttkonsentrasjoner på 2 mM hver.
  2. Starter live bildebehandling mikroskoper og alle dataprogrammer.
  3. Begynn perfusjon på en "dummy"-avbildning kammer og stabilisere rør-system.
  4. Prewarm den innebygde løsningen varmeapparatet og bildebehandling kammeret i mikroskopet scenen. Fest bildebehandling kammeret i en oppvarming innsatsen.
  5. Stabilisere systemet til 32-37 ° C før du starter fargestoff lasting prosedyren. FORSIKTIG: For å unngå utilsiktet flyt av perfusjon løsning i mikroskopet systemet vi bruker hår bånd rundt mål og elastiske silikon ark (1mm) for å beskytte mikroskop scenen.

6. Dye Loading av enten Celletype

  1. Gjensuspender en porsjon av Fluo5N-AM (se 1.3) i 100 mL prewarmed tenkelig løsning (HEPES-Ringer eller ACSF).
  2. Oppløse Fluo5N-AM i tenkelig løsning (HEPES-Ringer eller ACSF) i et vannbad sonicator for 90 sek.
  3. Bruk ny 4 - eller 24-brønns plate og overføring 400 pl forvarmet tenkelig løsning til en brønn. Tilsett fargeløsning til samme brønn for å komme til 500 mL av en 5 mM oppløsning.
  4. Forsiktig plassere et dekkglass med celler (f.eks10-18 mm i diameter) i brønnen, celler vendt opp.
  5. Inkuber i en passende tidsperiode i en cellekultur inkubator ved 37 ° C (i mellomtiden forberede tenkelig innstillinger for mikroskopets stadium). Typiske dye-lasting ganger er for nevroner og gliaceller 7-15 min og for cellelinjer 10-20 min.

AVGJØRENDE: Dye-lasting tid og fargestoff konsentrasjon avhenger av celletype, celle tetthet, og eksperimentere-spesifikke behov! Lange inkubasjonstider i nærvær av fargestoffet kan skade cellene, spesielt primære neuroner og glialceller primære og dette er kritisk for respons til fysiologiske stimuli. Long-inkubasjonstidene (f.eks 30 min) vil kun være nyttig for ER kalsium lokalisering eksperimenter for å undersøke fordelingen av ER kalsium i små subcellular strukturer, f.eks fin neurites eller pigger. I noen eksperimenter, kan en blanding av 1/3 vekstmedium med tenkelig løsning bidrar til å beskytte celler under Fluo5N-AMlasting.

  1. Øyeblikkelig, overføre dekkglass til en annen celle kultur godt inneholder tenkelig løsning (HEPES-Ringer eller ACSF) og begynne montering cellene inn i bildebehandling kammeret.

7. ER-kalsium Live-Cell Imaging med en Inverted Laser Scanning Confocal Microscope

  1. Bruk en pensel til å søke høyt vakuum fett til en avbildning kammer. Smørefettet er nødvendig for å fiksere dekkglass på bunnen av kammeret perfusjon. Vi bruker selvlagde bildebehandling kamre for 10-12 mm Dekkglass med et lite volum, og dermed gir høy perfusjon hastigheter opp til 15 ganger buffer utveksling per minutt. En kommersielt tilgjengelig perfusjon kammer for 18 mm dekkglass, kan kjøpes fra Warner instrumenter (RC-49FS). Dette kammeret gjør det også felt stimulering av nerveceller.
  2. Plukk opp dekkglass med Fluo5N-lastet celler og legge en liten dråpe tenkelig løsning (50-100 ul) på cellene for å holde cellene dekket med tenkelig løsning.Snu dekkglass opp ned og monter cellene inn i bildebehandling kammeret. Å trykke på dekkglass inn i silisium-lim, bruk en bomullspinne (f.eks Q-tips).
  3. Tørk bort rester buffer fra bunnen av glasset dekkglass med bomullspinner. FORSIKTIG: Tørk forsiktig bort restfuktighet ved bruk av en olje-objektiv med høy numerisk apertur for høyoppløselig avbildning. Restoljen salt fjernes best ved vann. Utilsiktet smøre av fett kan fjernes med aceton eller ren etanol.
  4. Utveksling av "dummy" tenkelig kammer med den eksperimentelle bildebehandling kammeret. Vask cellene for 5-10 min ved kontinuerlig perfusjon.
  5. Vask cellene i 5 - 10 min ved kontinuerlig perfusjon.
  6. For celleutvalget bruke minimalt med laser belysning, høye skannefrekvenser (2-4 Hz), et lite bilde størrelse, og en høy gevinst.
  7. FORSIKTIG: For valg av Fluo5N-merkede celler ikke bruker overkant av lys eller direkte belysning med epifluorescent lys. Bright belysning av Fluo5N/Ca 2 + kompleksene fører til fullstendig tap av ER-spesifikk fluorescens i løpet av 2-4 sek (figur 5).
  8. Sett opp mikroskopet i henhold til det planlagte forsøket. For orientering, er representative innstillinger for bildebehandling med ulike TED vektorer gitt i tabell 1. For invertert laser scanning konfokalmikroskopi, bruker vi en Olympus IX81 mikroskop kombinert med en Fluoview 1000 confocal system som er utstyrt med diode lasere (473 nm, 15 mW, 559 nm, 20 mW) og en spektral detektor system.
  9. Ved begynnelsen av eksperimentet dokument cellene av interesse ved høyoppløselig x, YZ bildestakker.
  10. Utfør x, yt bildebehandling å overvåke ER kalsium dynamikk under de spesielle eksperimentelle forhold. Typiske innstillinger for systemet vårt er listet opp i tabell 2.
  11. Overvåke endringer i ER kalsium under kontinuerlig perfusjon med tenkelig løsning. Typiske buffer valutakurser er exemplarily: (a) celle vask og butikk-uttømming av SERCA blokk: 1,5 ml / min, (b) ATP / DHPG stimulering: 3 ml / min.
  12. Tilegne seg digitale bilder fortrinnsvis med 12-bit (4096 gråverdier). For parallelt avbildning av Fluo5N/Ca 2 + og RFP, 8-bits bilder (256 gråverdier) kan redde systemet fra data overløp.
  13. Oppbevar leve celle tidsserier bilder (x, yt) eller 3D bildestakker (x, yz) (for mobil distribusjon av Fluo5N/Ca 2 + komplekser) i en ImageJ kompatibelt format (f.eks tiff).

8. Bildebehandling og dataanalyse

  1. Åpne bildet stabelen i ImageJ programmet. Ved flerfarget bildebehandling, dele RGB-kanalene når du blir spurt etter ImageJ.
  2. Identifiser din region (s) av interesse (ROI) av en grundig undersøkelse av de bildestakker (f.eks med hjelp av en intensitet vs tid tomten)
  3. Bruk Time-Series Analyzer plugin for å lese ut den gjennomsnittlige pikselintensiteten i en ROI (F raw). Depending med vilje, tegne ROIs rundt enten hele ER eller små områder av ER f.eks ER av dendritter av perifere celle regioner. Også omfatte 1-3 ROI i områder uten celler for bakgrunn subtraksjon.
  4. Beregne gjennomsnittlig bakgrunnsfluorescens (F b) ved å beregne gjennomsnittlig fluorescens verdien av bakgrunnen ROI og trekke bakgrunnen verdien F b fra F rå verdier for å få F avkastning verdi.
  5. Beregn F 0, som er den basale fluorescens i cellene, ved å beregne middelverdien av ti til 30 fluorescerende verdier for hver ROI i en hviletilstand.
  6. Beregn background-korrigerte relative endringer i fluorescens av Af / F 0 ved formelen:

Ligning 1

  1. Presentere relative endringer i fluorescensnce som et spor med Af / F 0 for y-aksen og tid for X-aksen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denne protokollen gir en ikke-forstyrrende tilnærming for direkte avbildning av gratis ER kalsium. Lav-affinitets syntetisk Ca 2 + indikatorer frigjøres og fanget i ER lumen ved hjelp av en ER målrettet, rekombinant esterase enzymaktivitet. Forbedret lasting av Ca 2 + indikatoren fargestoffer til ER lumen gjør en direkte og rask avbildning av ER kalsium butikken dynamikk.

Celletyper for TED

Gjennomførbarheten av metoden har blitt vist i cellelinjer BHK21, HEK293 34, 17 Hela, SH-SY5Y, dyrkede astrocytes 8,40 og primære hippocampus og kortikale nevroner 8,34,41. I våre forsøk, fungerer TED godt når TED konstruksjoner er stabilt uttrykt, fortrinnsvis ved selv-inaktivere lentiviral vektorer 37,39 ved hjelp av en relativt svak promoter (f.eks ubiquitin promoter) 35. Andre, sterkere arrangører er under etterforskning.

Vellykket TED lasting med Fluo5N tilbyr en klar og skarp farging av ER lumen, som er spart ut av det kjernefysiske regionen 34,41. Ved hvile stater, representerer Fluo5N/Ca 2 + kompleks etiketten lokalisering av kalsium når bundet av Fluo5N dermed representerer den regionale fordelingen av fritt kalsium i ER lumen. I figur 6, confocal bilder av Fluo5N/Ca 2 +-komplekser og Tag-RFP-T2 etiketter av Red-CES2 er vist i Jakten celler, kortikale astrocytes og hippocampus nevroner. Figur 6C avslører fluorescerende Ca 2 + indikator kompleks i cellen kroppen samt neurites av hippocampus nevroner. Dette muliggjør undersøkelse av Ca 2 +-signaler i ganske små prosesser (se også 34,35).

Noen erfaring er nødvendig for å skille den typiske ER etikett fra en cytosoliske etikett som vil bli observert When celler blir skadet eller usunn. Cytosolic, endogene esterasene også slipper Fluo5N, noe som fører til en svært lyse flekker av cytosol og kjernen når kalsium lekker gjennom plasmamembranen. Cytosoliske farging av Fluo5N/Ca 2 +, er også observert når TED-merkede celler ble behandlet etter ionofor ionomycin, i nærvær av ekstracellulært kalsium (Figur 7).

Direkte avbildning av kalsium utgivelse fra ER

En stor anvendelse av TED er den direkte visualisering av ER butikken uttømming 17,34. I Figur 8 viser vi én representant eksperiment utført med hippocampus nevroner, uttrykker Red-CES2. Nerveceller med Red-CES2 berike høye mengder Fluo5N i oppklaring rundt kjernen regionen (piler i Figur 8). Når SERCA blocker CPA påføres ved perfusjon, er en rask uttømming av ER kalsium butikken observert (Figur 8B). Her presenterer vi derå verdier (y-akse) som er innhentet ved nevroner er avbildes med 12-bits. Imaging forholdene er oppført i Tabell 2.. Legg merke til den enorme endringen i gjennomsnittlig fluorescens tetthet per ROI som er sett ved TED brukes på nerveceller. For andre eksperimenter analysere ER kalsium utgivelse i nerveceller ved hjelp TED, ønsker vi å referere til tidligere forsøk, som allerede hadde vært diskutert i detalj 8,34,35. I korte trekk er TED i nevroner in vitro brukes til å visualisere SERCA-sensitive ER kalsium butikk i stor detalj av invertert confocal laser scanning mikroskopi 8,34 og ble vellykket anvendt for rask bildebehandling (15 Hz) av mGluR1 / 5 indusert IiCR 34.

Fig. 9 viser et typisk forsøk med mus kortikale astrocytter in vitro stimulert med 200 uM ATP via perfusjon system ved lav oppløsning, ved hjelp av et 20x objektiv vann. Etter lentiviral infeksjon, cellene vist her uttrykt Red-CES2, som er drevet av en promoter ubiquitin. Skanning hastighet var ~ 2 Hz og begge kanaler (Fluo5N/Ca 2 + og Red-CES2 fusion protein) ble samtidig avbildes (på linje). I begynnelsen av eksperimentet gliacellene viste god infeksjon med uttrykket konstruerer og god lasting med Fluo5N-AM. Den ROIs som ble analysert er uthevet i figur 9A. En ROI ble satt til å måle bakgrunnsfluorescens (bg), ROI 1-2 måle fluorescens av komplette celler, dekker ROI tre bare ER av cellen og ROI fire ble trukket rundt hele synsfeltet. Kort tid etter stimulering med ATP fluorescens av Fluo5N/Ca 2 + komplekser brått falt ned på grunn av Ca 2 + utgivelsen fra ER. Til slutt blir den ER delvis gjenfylt med kalsium på nytt. Samtidig minsker fluorescensen av RFP kontinuerlig som følge av svak bleking (figur 9B, nedre panel). Spor som representerer endringer i fluorescerende het intensitet (figur 9C) peker på en viktig ulempe med TED. I mange (ikke alle) eksperimenter høye mengder Fluo5N-komplekser tapt under stimulering. Som en konsekvens, vil fluorescens-verdier ikke komme tilbake til det opprinnelige nivå fluorescensintensiteten.

Fig. 10 viser et CES2-infisert BHK21 celle med høy oppløsning, merket ved Fluo5N/Ca 2 + og stimulert med ATP. BHK21 celler fungerte som en tidlig modell celle system for ER kalsium analyse 31. Merk at ER kalsium release og butikk-påfylling er visualisert i fine strukturer av ER tubuli. Strukturene hadde blitt avbildet ved lav hastighet (~ 0,2 Hz), med 512 x 512 piksler, Airy disc 1 innstilling for confocal pinhole, og med en 63x olje objektiv.

"/>
Figur 1. Oversikt over ER kalsium signalering. ER kalsium utgivelsen er forårsaket av "lekkasje" kanaler som ER intramembrane pore kompleks Sec61. G-protein koblede reseptorer (GPCR) stimulere IP 3 produksjonen, som deretter fører IP 3-indusert kalsium utgivelse (IiCR). ER kalsium utgivelsen er registrert av STIM komplekser og induserer butikk-opererte kalsium oppføring (SOCE) av ionekanaler i Trp familie og / eller Orai kalsium kanaler. Spenningsstyrte kalsium kanaler (Ca V) megle rask kalsium-indusert kalsium utgivelse (CICR) ved ryanodine reseptorer (RyR) enten ved direkte protein interaksjon (skjelettmuskulatur) eller fysiologisk interaksjon (hjertemuskel celler, nevroner). Tapet av ER kalsium er dynamisk reddet av handlingen av SERCA pumpe (sarcoplasmic-endoplasmic retikulum kalsium ATPase).

res.jpg "src =" / files/ftp_upload/50317/50317fig2.jpg "/>
Figur 2. Prinsippet om målrettede-esterase indusert dye lasting (TED). Målrettet overuttrykte en karboksylesterase gir en høy esterase aktivitet (CES2) på akuttmottaket. Esterase konverterer acetoxymethylester dye Fluo5N-AM til en kalsium-sensitive, fluorescerende fargestoff som forblir fanget i ER. Fluo5N har en lav affinitet til kalsiumioner. Derfor, i henhold til hvile på, er fluorescerende Fluo5N/Ca 2 + komplekser fortrinnsvis dannet på akuttmottaket, der kalsium konsentrasjonen er ca 1000 ganger høyere enn i cytosol.

Figur 3
Figur 3. Representative TED vektor konstruerer CES2.: Native versjon av mus CES2. CES2 OPT 43: ERsignal peptid ble utvekslet og inkluderer nå en intron, mens ER oppbevaring motiv ble endret til den klassiske KDEL-ER oppbevaring og gjenfinning motiv av løselige ER proteiner. En myc tag gir en epitope for protein deteksjon ved indirekte immunfluorescens merking og Western blot analyse. Red-CES2 8,43: En rød fluorescerende protein ble lagt rett bak amino-signal peptid. Rød LK CES2 43: En glysin-serin-linkeren har blitt introdusert for å etablere et fleksibelt hengsel mellom RFP og CES2 element.

Figur 4
Figur 4. Arbeidsflyt for direkte ER kalsium avbildning ved hjelp av TED. Cell suspensjoner av primære celler eller cellelinjer er transduced med et virus som inneholder en TED uttrykk konstruksjon. Cellene blir deretter sådd på coverslips. Ved bruk av RFP-CES2 konstruerer, transduserte celler kan identifiseres ved hjelp av den røde fluorescens. Target-esterase indusert dye lasting er utført av ruger cellene i en tenkelig løsning som inneholder en AM-kombinert med lav affinitet Ca 2 + indikator, for eksempel Fluo5N-AM eller Mag-Fura2-AM. ER kalsium bildebehandling er utført med en invertert laser scanning mikroskop (se protokoll) eller annen kompatibel imaging-enhet. Under live bildebehandling cellene er under kontinuerlig perfusjon med en tenkelig løsning som kunstig cerebrospinalvæsken (ACSF). Cell stimulering utføres enten ved perfusjon eller ved lokalt trykk-utkastelse.

Figur 5
Figur 5. Sterk epifluorescence belysning ødelegger ER-spesifikke Fluo5N TED etiketten i løpet av sekunder. Representative bilder fra en video, bilde av med en oppreist bildebehandling mikroskop. Her gliaceller uttressing RFP-CES2 ble lastet med Fluo5N-AM. Først den røde fluorescens av en infisert celle ble avslørt med en CCD-kamera. Deretter ble Fluo5N/Ca 2 + signal belyst med en LED-lyskilde. En innledende klar ER lokalisering av Fluo5N/Ca 2 + komplekser (gule piler) er raskt ødelagt av sterk belysning med 470 LED lyskilde og et skifte i fluorescens fordeling blir synlig i det kjernefysiske området (gule piler, 12.46 sek).

Figur 6
Figur 6. TED lasting med Fluo5N-AM i ulike celletyper Øvre panel:. Jakten celler med stabil RED-CES2 uttrykk midtre panelet:. Cortical astrocytes etter lentiviral transduksjon med Red-CES2 Nedre Panel:. Hippocampus nevroner med RED-CES2 på DIV åtte. Alle celler ble dyrket på Dekkglass og farget med Fluo5N-AM som beskrevet i metode delen. Den Fluo5N/Ca 2 + etiketten representerer også lokalisering av kalsium når bundet til Fluo5N. Skalalinje 40 mikrometer.

Figur 7
Figur 7. Fluo5N fargestoff i cytosol blir synlig etter ionomycin behandling. Glial celler ble infisert med Red-CES2, merket med Fluo5N-AM, og behandlet med SERCA-blocker thapsigargin å utarme ER kalsium. Ionomycin behandling induserte en sterk tilstrømning av ekstracellulært kalsium. (Øvre panel) Cells viser en drastisk økning i Fluo5N/Ca 2 +-mediert fluorescens. (Nedre panel) Den gjennomsnittlige intensitet projeksjon bilde av Fluo5N/Ca 2 +-label avslører en typisk cytosolic merking av fluorescerende kalsium kompleks Blå pil:. Et lyst merket celle indikerer at disse cellene har store mengder kalsium i the cytosol. Antagelig er denne cellen skadet Purple pil:. Celler blir lyst merket i cytosol på ionomycin behandling.

Figur 8
Figur 8. ER kalsium butikken uttømming i nerveceller ved å blokkere SERCA. (A) hippocampus nevroner (DIV 9) uttrykte Red-CES2 (A, red) og er merket med Fluo5N-AM (A, grønn). Pilene peker på to analyserte celler. Bildet (maksimum intensitet projeksjon) er en beskåret element av øks, YZ-bilde som er fremkommet ved begynnelsen av eksperimentet (B). Rå spor som representerer ER kalsium butikken uttømming etter perfusjon med 30 pM CPA. Her tusen bildene ble tatt med 1 Hz og 12-bit. Den rå verdier av den midlere fluorescens tetthet pr ROI (y-akse) av de to celler vist på A liggerplottes over tid (rød og blå strek). Bakgrunnstallene verdier (svart kurve) holdes konstant. AU = vilkårlige enheter av gråverdier representerer fluorescens tetthet.

Figur 9
Figur 9. ER kalsium utgivelse på ATP stimulering av gliaceller. Glial celler ble infisert med Red-CES2 og lastet med Ca 2 + indikator Fluo5N-AM. Celler ble stimulert med 200 mikrometer ATP via perfusjon i 10 sek. (A) Glial celler uttrykker Red-CES2 (i midten) er merket med Fluo5N-AM (til venstre). Den ROIs er uthevet. (B) Enkelt bildene hentet fra time-lapse sekvens. (Øvre panel) Den fluorescensintensitet er høy på 0 sek og 71 sek før cellene reagerer. Det faller brått (80 sek) og når et minimum ved 86 SEC, før den igjen stiger (160 sek) som kalsium pumpet tilbake inn i ER. (nedre panel) Fluorescensintensitet av RFP avtar langsomt og kontinuerlig over tid på grunn av bleking. (C) Tid viser spor A f / f 0 verdier for den ROIs angitt i A. fluorescens, som indikerer kalsium konsentrasjonen, faller ned etter ATP stimulering og delvis gjenoppretter. Klikk her for å se større figur .

Figur 10
Figur 10. Høy oppløsning av ATP-indusert kalsium-frigjøring i BHK21-celler. Celler ble lastet med Fluo5N-AM og avbildes i nærvær av ekstracellulært kalsium. (A) bildeserie som viser forandringer i Fluo5N/Ca 2 +-avledet fluorescens under ATP-stimulering. (B) Gjennomsnittlig intensitet projiseringsbildet indikerer ROIs vist i C. (C) ATP indusert kalsium release og påfylling av ER kalsium butikken er analysert i små underregionene i ER. Sporene representerer endringer i fluorescensen.

Eksitasjon laser [nm] Detection range [nm]
TED med Red-CES2 vektor konstruerer
473 (Fluo5N/Ca 2 +) 507-545
559 (Tag-RFP-T2) > 570
TED med CES2 bare vektor konstruerer
473 nm (Fluo5N/Ca 2 +) > 507

Tabell 1. Innstillinger for spektral detektoren.

Eksperiment ER uttømming med en rød-CES2 Stimulering av nerveceller ved hjelp av en CES2 konstruksjon Høy romlig oppløsning bildebehandling, CES2
Objektiv (NA) 20x vann (0,7) 20x vann (0,7) 40x oil/63x olje (≥ 1,3)
473 nm Laser
Makt 1% 1%
HV A 600-780 600-780 400-780
Gain B 0-1% 1-2% 0%
Offset 0 0 0
559 nm Laser
makt 1% tilleNALC optionalC
HV A 600-780 optionalC optionalC
Gain B 0-1% optionalC optionalC
Offset 0 optionalC optionalC
Skannehastighet 1-2Hz Free run Free run
Bildestørrelse 320x320 pixel 240x240 pixel 512x512 pixel
Skanning typen I tråd Toveis Nyquistcriterion (2 piksler / element)
Stimulering 100-200 mM ATP :5-15 sek, 200-500 mikrometer glutamat for 5-15 sek 100-200 mikrometer Agonist: 5-15 sek
Pinhole 2-5 luftige plater 2-5 luftige plater En luftig plate

Tabell 2. Eksempler på mikroskop innstillinger i henhold til den type eksperiment A:. HV = strøm til fotomultiplikator-detektor, B: Forsterkning = amplifisering av PMT-signal, C: Alternativ: kanal er ledig for bruk sammen med andre røde fluorescerende fargestoffer (f.eks CMX-Ros for å visualisere den mitokondrielle potensial) eller andre røde fluorescerende proteiner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Fordelene og ulempene ved TED metoden har vært diskutert mye i nyere publikasjoner 34,35. Sammenlignet med andre fremgangsmåter som er beskrevet ovenfor, omgår TED problemet med å forstyrre og perfusing cellene. Videre to aspekter må vektlegges. Prinsippet for TED for ER kalsium avbildning krever (1). Den målrettede ekspresjon av et aktivt karboksylesterase i ER lumen ved hjelp av TED vektor konstruksjoner og (2). Den effektive og preferensiell frigjøring av lav-affinitet syntetiske AM-esterne kalsium fargestoffer i ER lumen.

En. TED vektor konstruerer

Figur 3 oppsummerer utviklingen av TED vektor konstruksjoner. TED ble utviklet på grunnlag av CES familie proteiner (EC 3.1.1.1). Disse proteinene er bosatt medlemmer i ER lumen. For in vitro studerer rekombinant administrasjon av CES proteiner som fungerer best etter stabilt uttrykk forprotein eller etter virusinfeksjon med moderate uttrykk nivåer. I dag er det ukjent om andre proteiner med esterase aktivitet kan erstatte CES proteiner for TED bildebehandling. Det er ikke anbefalt å bruke transient transfeksjon av TED vektorer for dynamisk ER kalsium analysen fordi cellene er mindre mottakelig etter transfeksjon prosedyren. CES proteiner trenger riktig målgruppe til ER lumen og dette trinnet trenger en effektiv spalting av ER signal peptid. I tillegg er retensjon og gjenfinning av CES proteiner i ER lumen mediert av deres amino-terminale KDEL-lignende motiv. Disse mekanismene kan være mettet ved høye uttrykk nivåer er produsert av TED vektorer etter transient transfeksjon. Dette kan årsaker en falsk lokalisering av CES-proteiner og støtter dannelsen av protein-aggregater.

2. Low-affinitet Ca 2 + Indikatorer for TED

Den viktigste ulempen med TED skyldes begrensninger i tilgjstand indikator fargestoffer for ikke-forstyrrende analyse av ER kalsium. ER kalsium avbildning med TED krever indikator fargestoffer med en høy K-D (noe som betyr en lav affinitet) og en lav fluorescens i fravær av kalsium. Basere på vår erfaring Fluo5N-AM fungerer best, men denne indikatoren dye er ikke blekemiddel-resistente. Den lave affinitet Ca 2 + indikatorer Mag-Fura2-AM (K D ~ 25-50 mm) 34 og Mag-Fluo4 (K D ~ 20-25 mikrometer) ble også testet. Begge fargestoffer er godt lastet inn ER strukturer ved TED, men risikoen for å produsere "blandede signaler" ved stimulering av ER utgivelsen er høy. En "mixed signal" representerer først en rask økning av fluorescens i cytosol etterfulgt av reduksjon av fluorescens på akuttmottaket. For å overkomme denne begrensningen, kan disruptive tilnærminger for ER kalsium bildebehandling hjelpe 32,35. Mag-Fluo4 (K D ~ 20-25 mm) viser en sterk TED-mediert etiketten på Golgi cisternae, som er mindre uttalt når Fluo5N-AM jegs brukes.

Programmer og perspektiver

Her fokuserer vi på inverse laserskanning confocal analyse av ER kalsium dynamisk med TED. TED målinger kan også tilpasses enhver standard konfokal system eller bredt felt system med riktig eksitasjon kilde (laser, LED, metall Halid lamper, monochromator), filtre og fluorescens deteksjon system 6.

TED er spesielt nyttig i de celler som ikke uttrykker endogent CES tilstrekkelig aktivitet i ER. Vi observerte at f.eks BHK21 celler gi nok endogen esterase aktivitet på akuttmottaket for å frigjøre lave affinitet indikatorer. I våre hender, er dette ikke tilfelle med mange andre cellelinjer (HEK293, SH-SY5Y, HeLa, PC12), primære gliaceller, og primære nevroner. Her gjør at TED metoden en vellykket ikke-forstyrrende fargestoff lasting til ER.

Fremtidige TED vektorer kan grad sin søknad fra ER lumen tilandre subcellular avdelinger eller mobilnettet mikroområder. Prinsippet for TED metode er uavhengig av indikatoren fargestoff, og kan derfor brukes med AM-ester av hvilken som helst fargestoff, for eksempel for avbildning av intracellulære pH-dynamikk. Nylig beskrev laboratoriet av Luke D. Lavis at rekombinant svin leveren esterase (PLE) CES1 danner en selektiv esterase-ester par med cyclopropylester fargestoffer 42. Cyclopropylester agenter ble funnet å være motstandsdyktig mot hydrolyse av endogene esterases og den selektive avsløring av rekombinant CES aktivitet aktivert celle spesifikt molekyl targeting 42. Det vil være interessant å undersøke om kalsium indikatorer basere på den nye teknikken vil forbedre subcellular målretting spesifisitet av syntetiske indikatorer.

TED fungerer best i cellelinjer når TED proteiner er stabilt uttrykt. Etableringen av en samling med stabile TED cellelinjer ville være fordelaktig.

Transgene TED mus modeller er også et viktig mål for vårt arbeid, og dette vil gjøre det mulig TED i bestemte vevspreparater fra bestemte nevrale kretser, skjelettmuskulatur, hjerte, eller forberedelser av karsystemet. Denne musen modellen vil bidra til å overføre analyse av ER kalsium dynamikk fra cellenivå til mer fysiologisk vev sammenheng.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Dette arbeidet har vært støttet med tilskudd av Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) BL567/3-1 og Friedrich-Baur-Stiftung. Vi ønsker å takke Roger Y. Tsien, Howard Hughes Medical Institute Laboratories ved University of California, San Diego for å gi oss Tag-RFP-T2. Vi heldigvis erkjenner David Baltimore, California Institute of Technology, Pasadena, og Didier Trono, Universitetet i Genève, Genève, for å gi oss den lentiviral plasmider FUGW, og psPAX2/pMD2.G.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(S)-3,5-DHPG (Dihydroxyphenylglycine) Tocris 0805
5';-ATP-Na2, ATP disodium salt hydrate Sigma A26209-1G
B-27 supplement,50x Invitrogen 17504-044
Carbamoylcholine chloride (Charbachol) Sigma C4382-1g
Cyclopiazonic acid (CPA) Ascent scientific Asc-300
Dimethylsulfoxide (DMSO) Sigma D2650
DMEM with Glutamax Invitrogen-Gibco 31966-047
Dulbecco's PBS without Ca/Mg 1x PAA H15-002
Fetal calf serum Invitrogen-Gibco 10270-106
Fluo-5N-AM, 10 x 50 μg Invitrogen F14204
Glutamate Ascent scientific Asc-049
Glutamax Invitrogen 35050-038
Ham's F12 nutrients mixture Invitrogen-Gibco 21765-029
Hank's BSS(1x) without Ca,without Mg, with Phenol Red, HBSS PAA Laboratories H15-010
Horse serum SHD3250YK Linearis
Ionomycin Ca2+ salt Ascent scientific Asc-116
murine EGF PreproTech 315-09
N2 supplement 100x Invitrogen 17502-048
Neurobasal medium Invitrogen-Gibco 21103-049
Pluronic F127, low UV absorbance,2g Invitrogen P6867
Poly-DL-ornithine hydrobromide PORN Sigma P8638
Poly-D-lysine hydrobromide Sigma P7280
Poly-L-Lysin Sigma P2636
Thapsigargin Calbiochem 586005-1mg
TryLE Express Invitrogen 12605-028
Trypsin Worthington LS-003707
Trypsininhibitor from Glycine MAX (soybean) Sigma T6522
Materials
Confocal system: inverted laser scanning microscope: FV1000 with IX81 Olympus user-specific configuration
Confocal system: laser combiner FV10 and diode lasers (405, 473, 559, 635) Olympus user-specific configuration
Confocal system: scan head FV10-SPD with spectraldetector Olympus user-specific configuration
Heater controller TC-344B Warner Instruments 64-0101 to control in line solution heater
NIH ImageJ software WS Rasband, ImageJ, US National Institutes of Health, http://rsb.info.nih.gov/ij/, 1997--2006
Objective: UAPON20XW340 NA 0,7 WD 0,35 Olympus N2709100
Objective: UPLFLN40XO Olympus N1478700
Objective: UPLSAPO60XO/1.35, WD=0.15 Olympus N1480700
Perfusion chamber, inverse custom-made
Perfusion chamber, RC-49FS Warner Instruments W4 64-1709
Perfusion tube: PT-49 Warner Instruments 64-1730 for perfusion
Peristaltic pump MiniPlus 3 (4 channels) Gilson n.a. perfusion pump
Single inline solution heater SH-27B Warner Instruments 64-0102 controlled by heater controller
Suction tubes: ST3R Warner Instruments 64-1407 for perfusion
Heating insert: Tempocontrol 37-2 digital 2-channel Pecon n.a.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Berridge, M. J., Bootman, M. D., Roderick, H. L. Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 4, 517-529 (2003).
  2. Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. The versatility and universality of calcium signalling. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 1, 11-21 (2000).
  3. Agulhon, C., et al. What is the role of astrocyte calcium in neurophysiology. Neuron. 59, 932-946 (2008).
  4. Augustine, G. J., Santamaria, F., Tanaka, K. Local calcium signaling in neurons. Neuron. 40, 331-346 (2003).
  5. Berridge, M. J. Neuronal calcium signaling. Neuron. 21, 13-26 (1998).
  6. Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging calcium in neurons. Neuron. 73, 862-885 (2012).
  7. Neher, E., Sakaba, T. Multiple roles of calcium ions in the regulation of neurotransmitter release. Neuron. 59, 861-872 (2008).
  8. Jaepel, J., Blum, R. Capturing ER calcium dynamics. European Journal of Cell Biology. 90, 613-619 (2011).
  9. Verkhratsky, A. Physiology and pathophysiology of the calcium store in the endoplasmic reticulum of neurons. Physiological Reviews. 85, 201-279 (2005).
  10. Burdakov, D., Petersen, O. H., Verkhratsky, A. Intraluminal calcium as a primary regulator of endoplasmic reticulum function. Cell Calcium. 38, 303-310 (2005).
  11. Streb, H., Irvine, R. F., Berridge, M. J., Schulz, I. Release of Ca2+ from a nonmitochondrial intracellular store in pancreatic acinar cells by inositol-1,4,5-trisphosphate. Nature. 306, 67-69 (1983).
  12. Choi, J. H., Ryu, S. H., Suh, P. G. On/off-regulation of phospholipase C-gamma 1-mediated signal transduction. Advances in Enzyme Regulation. 47, 104-116 (2007).
  13. Clapham, D. E. TRP channels as cellular sensors. Nature. 426, 517-524 (2003).
  14. Cahalan, M. D. STIMulating store-operated Ca(2+) entry. Nature Cell Biology. 11, 669-677 (2009).
  15. Soboloff, J., Madesh, M., Gill, D. L. Sensing cellular stress through STIM proteins. Nature Chemical Biology. 7, 488-492 (2011).
  16. Erdmann, F., et al. Interaction of calmodulin with Sec61alpha limits Ca2+ leakage from the endoplasmic reticulum. The EMBO Journal. 30, 17-31 (2011).
  17. Schäuble, N., et al. BiP-mediated closing of the Sec61 channel limits Ca(2+) leakage from the ER. The EMBO Journal. , (2012).
  18. Park, M. K., Choi, Y. M., Kang, Y. K., Petersen, O. H. The endoplasmic reticulum as an integrator of multiple dendritic events. The Neuroscientist : a review journal bringing neurobiology, neurology and psychiatry. 14, 68-77 (2008).
  19. Cooney, J. R., Hurlburt, J. L., Selig, D. K., Harris, K. M., Fiala, J. C. Endosomal compartments serve multiple hippocampal dendritic spines from a widespread rather than a local store of recycling membrane. The Journal of Neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 22, 2215-2224 (2002).
  20. Holbro, N., Grunditz, A., Oertner, T. G. Differential distribution of endoplasmic reticulum controls metabotropic signaling and plasticity at hippocampal synapses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 15055-15060 (2009).
  21. Terasaki, M., Slater, N. T., Fein, A., Schmidek, A., Reese, T. S. Continuous network of endoplasmic reticulum in cerebellar Purkinje neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 7510-7514 (1994).
  22. Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. Calcium imaging of cortical neurons using Fura-2 AM. J. Vis. Exp. (23), e1067 (2009).
  23. Lang, S., Schäuble, N., Cavalie, A., Zimmermann, R. Live cell calcium imaging combined with siRNA mediated gene silencing identifies Ca(2)(+) leak channels in the ER membrane and their regulatory mechanisms. J. Vis. Exp. (53), e2730 (2011).
  24. Rudolf, R., Mongillo, M., Rizzuto, R., Pozzan, T. Looking forward to seeing calcium. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 4, 579-586 (2003).
  25. Mank, M., Griesbeck, O. Genetically encoded calcium indicators. Chemical Reviews. 108, 1550-1564 (2008).
  26. Miyawaki, A., et al. Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin. Nature. 388, 882-887 (1997).
  27. Montero, M., et al. Monitoring dynamic changes in free Ca2+ concentration in the endoplasmic reticulum of intact cells. The EMBO Journal. 14, 5467-5475 (1995).
  28. Griesbeck, O., Baird, G. S., Campbell, R. E., Zacharias, D. A., Tsien, R. Y. Reducing the environmental sensitivity of yellow fluorescent protein. Mechanism and applications. The Journal of Biological Chemistry. 276, 29188-29194 (2001).
  29. Ishii, K., Hirose, K., Iino, M. Ca2+ shuttling between endoplasmic reticulum and mitochondria underlying Ca2+ oscillations. EMBO Reports. 7, 390-396 (2006).
  30. Palmer, A. E., Jin, C., Reed, J. C., Tsien, R. Y. Bcl-2-mediated alterations in endoplasmic reticulum Ca2+ analyzed with an improved genetically encoded fluorescent sensor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 17404-17409 (2004).
  31. Hofer, A. M., Machen, T. E. Technique for in situ measurement of calcium in intracellular inositol 1,4,5-trisphosphate-sensitive stores using the fluorescent indicator mag-fura-2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 2598-2602 (1993).
  32. Solovyova, N., Verkhratsky, A. Monitoring of free calcium in the neuronal endoplasmic reticulum: an overview of modern approaches. Journal of Neuroscience Methods. 122, 1-12 (2002).
  33. Solovyova, N., Veselovsky, N., Toescu, E. C., Verkhratsky, A. Ca(2+) dynamics in the lumen of the endoplasmic reticulum in sensory neurons: direct visualization of Ca(2+)-induced Ca(2+) release triggered by physiological Ca(2+) entry. The EMBO Journal. 21, 622-630 (2002).
  34. Rehberg, M., Lepier, A., Solchenberger, B., Osten, P., Blum, R. A new non-disruptive strategy to target calcium indicator dyes to the endoplasmic reticulum. Cell Calcium. 44, 386-399 (2008).
  35. Blum, R., Verkhratsky, A., Petersen, O. H. Calcium imaging of intracellular organelles: endoplasmic reticulum. 43, Humana Press. (2010).
  36. Shaner, N. C., et al. Improving the photostability of bright monomeric orange and red fluorescent proteins. Nature Methods. 5, 545-551 (2008).
  37. Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors. Science. 295, 868-872 (2002).
  38. Zufferey, R., et al. Self-inactivating lentivirus vector for safe and efficient in vivo gene delivery. Journal of Virology. 72, 9873-9880 (1998).
  39. Zufferey, R., Nagy, D., Mandel, R. J., Naldini, L., Trono, D. Multiply attenuated lentiviral vector achieves efficient gene delivery in vivo. Nature Biotechnology. 15, 871-875 (1997).
  40. Li, D., Herault, K., Oheim, M., Ropert, N. FM dyes enter via a store-operated calcium channel and modify calcium signaling of cultured astrocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 21960-21965 (2009).
  41. Blum, R., Petersen, O. H., Verkhratsky, A. Calcium measurement methods. Verkhratsky, A., Petersen, O. H. Vol. Neuromethods 43 (Springer protocols), Humana Press. 147-167 (2010).
  42. Tian, L., et al. Selective esterase-ester pair for targeting small molecules with cellular specificity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 4756-4761 (2012).
  43. Samtleben, S., Blum, R. Improved vectors for direct ER calcium imaging with targeted-estersase induced dye loading. , In preparation (2012).

Tags

Cellular Biology nevrobiologi Neuroscience molekylær biologi biokjemi Biomedical Engineering bioteknologi virologi medisin anatomi fysiologi kirurgi endoplasmatiske retikulum ER kalsium signalisering kalsium butikken kalsium bildebehandling kalsium indikator metabotrope signalering Ca Nerveceller celler mus dyr modell cellekultur målrettet esterase indusert dye lasting bildebehandling
Direkte Imaging av ER Kalsium med målrettet-Esterase Induced Dye Loading (TED)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Samtleben, S., Jaepel, J., Fecher,… More

Samtleben, S., Jaepel, J., Fecher, C., Andreska, T., Rehberg, M., Blum, R. Direct Imaging of ER Calcium with Targeted-Esterase Induced Dye Loading (TED). J. Vis. Exp. (75), e50317, doi:10.3791/50317 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter