Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Прямое изображение ЭР кальция с целевыми-эстеразы Индуцированные красителем (TED)

Published: May 7, 2013 doi: 10.3791/50317
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1, 3, 1
1Institute for Clinical Neurobiology, University of Wuerzburg, 2Department of Synapses - Circuits - Plasticity, Max Planck Institute of Neurobiology, Martinsried, 3Walter Brendel Centre of Experimental Medicine, Ludwig-Maximilians University of Munich

Summary

Целевые-эстеразы индуцированного красителем (TED) поддерживает анализ внутриклеточной динамики магазин кальций флуоресцентной визуализации. Метод основан на нацеливание рекомбинантного карбоксилэстеразы в эндоплазматический ретикулум (ER), где она улучшает местный разоблачении синтетический низким сродством Са

Abstract

Визуализация динамики кальция важно понимать роль кальция в физиологии клетки. Для изучения динамики кальция, синтетический флуоресцентного Са 2 + индикаторов стали популярными. Здесь показано, TED (= целевых-эстеразы индуцированного красителем), способ улучшить высвобождение Са 2 + индикатор красителей в просвете ER из различных типов клеток. На сегодняшний день TED был использован в клеточных линиях, глиальные клетки, и нейронов в пробирке. TED баз на эффективную, рекомбинантные адресности высокой активностью карбоксилэстеразы в просвете ER использованием векторной конструкции, которые выражают карбоксилэстеразы (CES). Последнее TED векторы содержат основной элемент CES2 слит с красным флуоресцентным белком, что позволяет одновременное двухцветные изображения. Динамика свободного кальция в ЭР в образ будут включены в один цвет, а соответствующие структуры ER отображается красным цветом. В начале процедуры клеток, трансдуцированных лентивирусов. Затем инфицированные клеткиRe высевали на покровные, наконец, позволить изображений живых клеток. Затем живые клетки инкубируют с ацетоксиметил эфир (AM-эфир) формы с низким сродством Са 2 + показателей, например Fluo5N-AM, Mag-Fluo4-AM или Mag-Fura2-AM. Эстеразы деятельности в расщепляет ER от гидрофобных боковых цепей от AM форме Са 2 + индикатор и гидрофильные флуоресцентного красителя / Ca 2 + образуется комплекс и захваченных в ЭР просвет. После загрузки краситель, клетки анализируют на перевернутой конфокальной лазерной сканирующей микроскопии. Клетки постоянно озарен Ringer-подобные решения и ER динамики кальция непосредственно визуализируется в заданный промежуток времени. Кальций освобождение от ER идентифицируется снижение интенсивности флуоресценции в регионах, представляющих интерес, в то время заправки из магазина кальция ER приводит к увеличению интенсивности флуоресценции. Наконец, изменение интенсивности флуоресценции во времени определяется путем расчета f / F 0.

Introduction

Чтобы решить физиологические реакции кальция ER, мы разработали новую стратегию для улучшения захвата синтетических красителей чувствительной к кальцию в ЭР. Метод позволяет напрямую, без прерывания мониторинга в реальном времени свободного кальция ER в присутствии внеклеточного кальция.

Функции и сигнализации ER Кальций

Кальций сигналы находятся в разных типах клеток, например мышечных клетках, нейроны и глиальные клетки и их функции в диапазоне от посреднических сокращения мышц к участию в синаптической передаче в обучении и памяти 1,2. Изменение концентрации свободного кальция высокой научный интерес, так как кальций участвует в регуляции транскрипции генов, пролиферацию клеток, возбудимость нейронов, гибель клеток и других клеточных сигнальных событий 1-7. Все эти сигналы сотовой кальция функционально связаны и способствуют внутриклеточного кальциямагазин динамики 8-10.

Общей особенностью всех кальций сигналов поток кальция между внеклеточным пространством, в цитозоль и органелл, в основном ER и митохондрии. Это вызывает динамическое изменение концентрации кальция в эти органеллы, которые воспринимаются различные компоненты сигнализации. В общем, концентрации кальция в ЭР в диапазоне от 100 до 800 мкМ, в цитозоле концентрации кальция близка к 100 нМ, и во внеклеточном пространстве концентрация составляет около 1-2 мм. Соответственно, существует высокая движущая сила химической кальция течь к цитозоле 2,9,10.

Наиболее широко исследованы ЭР-производных сигналов кальция зависит от стимуляции G-белками рецепторы (GPCR), которые затем активируют фосфолипазу С (PLC). PLC в свою очередь производит инозитол 1,4,5-трифосфата (IP 3) 1. После связывания IP 3 до своей RECeptor (IP 3-Rec, рис. 1) в ЭР-мембраны, ионы кальция высвобождаются из просвета ER. Исторически сложилось так, IP 3-опосредованное высвобождение кальция из ER был первым - даже хотя и косвенно - измеряется в ацинарных клеток поджелудочной железы по Streb и др. в 1983 году 11.. В этой публикации предложено в первый раз сигнальный каскад с участием ацетилхолина, фосфолипазы С и IP-3. Таким образом, высвобождения кальция обычно называют IP 3-индуцированный выброс кальция (IiCR) (рис. 1). Киназы-зависимую активацию фосфолипазы сг на рецептор тирозин киназ ссылки действие факторов роста и нейротрофических факторов ER кальциевой сигнализации после IP 3 высоты 12. В дополнение к IiCR, кальций высота может быть опосредовано ионотропную ввод кальций, например, с помощью напряжения закрытого кальциевых каналов (Са V), и последующего кальций-индуцированного высвобождения кальция (CICR) путем повторного рианодиновыхрецепторов (RyR). IiCR CICR и физиологически связаны с магазина управлением поступления кальция (SOCE). SOCE включает действие СТИМ (стромы взаимодействующих молекул), который предназначен для сигнализации выброс кальция, ER. СТИМ было показано, чтобы стимулировать внеклеточной входа кальция через переходный рецепторный потенциал каналов (ГТО) 13, Orai кальциевых каналов 14 и даже напряжения закрытого кальциевых каналов 15 (рис. 1). Потеря кальция ER динамически спасен действие Sarco-эндоплазматический ретикулум кальций АТФазы (SERCA), который активно насосы кальций обратно в ЭР. Блокирование SERCA с такими препаратами, как тапсигаргин представляет непрерывную потерю кальция ER в цитозольный отсека. Это кальций ER "утечка" вызвано ER внутримембранного пор комплексы, такие как Sec61 белкового комплекса 16,17 (рис. 1).

В 1998 году опубликовал Berridge модели, "нейрон в модели нейрона", whicч предполагает принцип физиологической роли ER в интеграции нейронов кальцием 5. Эта модель рассматривает существование непрерывной мембраны ER системы формирования внутриклеточных «образ» мембраны нейронов плазмы 5. Этот бинарный эукариотических мембранной системы как утверждали, было одним из основных условий для временной и пространственной интеграции быстрых и медленных кальциевых сигналов в нейронах. Кальций сигналы, возникающие или одновременно или последовательно в разных шипами или дендритов одного и того же нейрона присвоено сомы клетки или ядра через ER, где они суммируются 5,18. Затем их сумма может оказывать действие на возбудимость нейронов, регуляцию транскрипции гена или интеграции сигнальных каскадов. Таким образом, ER поддерживает интеграцию кальций сигналов. Одной из предпосылок этой концепции является непрерывность ER в одной ячейке, которая была претендуют несколько исследований и который был доказан, по крайней мере для сомато-Dendritic районов и короткого расстояния проекции аксональное 19-21. Есть ли ER непрерывности в течение долгих аксональное прогнозов является предметом дискуссий.

Стратегии для измерения расхода свободного кальция через мембрану ER

Кальций сигналы наиболее часто контролироваться в цитозоле 22,23. Таким образом, она не может быть легко выделено ли Са 2 + течет в цитозоль из внеклеточной или из внутриклеточных депо 6,24. Чтобы преодолеть это ограничение, методические стратегии для прямой визуализации кальция ER были разработаны. Таким образом, следующие стратегии используются: (1) ER-целевых генетически модифицированных белков-индикаторов 25-27 на основе белков низким сродством Са 2 + индикаторы используют биолюминесцентного белка GFP аэкворин или в комбинации с кальцием чувствительного белка.. Эти генетически модифицированные Ca 2 + индикаторы (GECIS) можетбыть направлены на ER с помощью сигнального пептида и активно хранится в ER помощью удержания и извлечения мотива. Общие ER Ca 2 + индикаторы базы по принципу Cameleon и Cameleon YC4.3 26,28; Cameleon раскол YC7.3ER 29 и Cameleon D1 30. (2) Прямая эстераза основе красителя АМ-эфира низкоаффинными Ca 2 + 31,32 показателей. AM-производных индикаторов красителей (Mag-Fura2-AM, Mag-Fluo4-AM или Fluo5N-AM) проходят биологические мембраны в липофильном, кальция-нечувствительными государства. Затем в цитозоле, а также в ЭР, эндогенные эстераз расщепляют на АМ-эфирной группы и отпустить Са 2 + индикатор, оставляя за определенное количество активного красителя в цитозоле и в ЭР. Таким образом, этот подход полезен в условиях высокой концентрации кальция в ЭР тех пор, пока концентрация цитозольного кальция остается значительно ниже дезащита предел низким сродством показателей, в частности, во время характерные сигналы кальция (например нМ до низкого мкМ). (3) AM-эфир нагрузки в сочетании с плазматической мембраной проницаемости 32. Любой оставшийся цитозольного Ca2 + индикатор удаляется плазматической мембраны проницаемости с небольшим количеством «мягкий» моющего средства (например, сапонин) в искусственной внутриклеточный буфера. Таким образом, внутриклеточных мембран можно стимулировать, например, с IP-3 внутриклеточной буфер, непосредственно через «поры» в плазматической мембране. (4) Диализ цитозоле при цельноклеточной конфигурации и одновременное измерение Са 2 + в просвете ER и цитозоле 32,33. Клетки сначала загружается с низким сродством Са 2 + индикатор (например, Mag-Fura2- AM, радиометрический, УФ-светом). Затем с помощью пипетки патч, оставшиеся цитosolic низким сродством Са 2 + индикатор диализу из цитозоле буфером, содержащим высокое сродство Са 2 + индикатор (например, Fluo-3, видимый свет). Такая стратегия позволяет одновременную запись и цитозольные ER полученных сигналов. (5) Целевые эстеразы-индуцированной красителем 8,34. Карбоксилэстеразы (CES) предназначен для просвете ER и обеспечивает высокую активность эстеразы для эффективного захвата АМ-форме сложного эфира с низким сродством Са 2 + показателей.

Целевые эстеразы-индуцированной красителем (TED)

Для повышения адресности с низким сродством Ca 2 + показатели ER просвет, Тед был разработан. TED требует избыточной экспрессии ER целевых мышь карбоксилэстеразы (CES2) (рис. 2), которая достигается с помощью экспрессионных конструкций. Клетки, экспрессирующие рекомбинантный CES-конструкцию инкубируют с АМ-сложноэфирной формы кальцияиндикатором красителя (Fluo5N-AM, рисунок 2). Затем в ER, краситель превращается в Са 2 + чувствительным, непроницаемой мембраны Са 2 + индикатор комплекс (Fluo5N/Ca 2 +) на высокую активность эстеразы, поэтому захвата красителя в высокой концентрации в просвете ER 8 , 34. Этот метод особенно полезен для исследования ER кальцием высвобождение через IiCR-путей, например, с помощью метаботропного, пуринергической или глутаматных рецепторов, 8,34 и визуализировать ER кальция истощения через "утечки каналы" непосредственно, например, после блокады SERCA 17 , 34. Нашему опыту низкоаффинными Ca 2 + индикатор Fluo5N-AM в настоящее время является лучшим индикатором доступны для использования с загрузкой стратегии TED красителя. Fluo5N-AM имеет низкий сродство к Са 2 + (константа диссоциации K D ~ 90 мкм, рисунок 2), почти не флуоресцентные в AM-форме, но обеспечивает высокую флуоресценцию излучения при Calciuм 8,34 обязательными. Fluo5N/Ca 2 + комплекс может возбуждаться с помощью стандартного источника света ~ 490 нм, что соответствует стандартным красители, такие как FITC, Alexa 488 или УЗФБ. Цитозольного сигнала кальций едва ли достичь концентрации в диапазоне низких мкМ и, следовательно, едва обнаружено Fluo5N в цитозоле 35.

Чтобы повысить производительность Тед, несколько рекомбинантных векторных конструкций были разработаны (рис. 3). Первоначально, Тед векторы на основе кодирующей последовательности CES2 (RefSeq инвентарным номером NM_145603, CES2c) и лучший TED производительности наблюдается при стабильной экспрессии конструкций ЕЭП. Новые векторы TED выразить одним из основных элементов CES2 слит с красной флуоресценции белков TagRFP-T2 36. Эти векторы имеют то преимущество, что они могут быть использованы для идентификации трансдуцированных клеток, а также использовать красную флуоресценцию в качестве внутреннего контроля для нормализации изменений в Fluo5N/Ca 2 + флуоресценции. Красной флуоресценции также дает возможность визуализировать структурные распределение ER и изменения в ER динамики при стимуляции условий.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Этот протокол представляет TED применяется к клеточных линиях, нейронах гиппокампа и кортикальных глиальных клеток. TED производительность лучше всего, когда TED векторов стабильно экспрессируются, например, путем лентивирусов векторов. Схематический обзор метода TED показано на рисунке 4.

1. Приготовление растворов

Следующие растворы должны быть подготовлены до начала и может храниться как указано. Мы вообще используем стерилизованных стеклянных и пластиковых материалов и автоклавного воды.

  1. Подготовьте ХЕПЕС Рингер (в мм): 125 NaCl, KCl 3, 25 HEPES, 2 MgSO 4 7H 2 O, 2 CaCl 2, 1,25 Na 2 PO 4 H 2 O, 10 glucose.H 2 O.. Бескальциевой ХЕПЕС Ringer состоит из (в мм): 127 NaCl, KCl 3, 25 HEPES, 2 MgSO 4 .7 H 2 O, 1,25 Na 2 PO 4 H 2 O, 10 glucose.H 2 O и 0,1 ЭГТА.. Без глюкозы этих Imaging Solutions можно бэлектронной хранили при 4 ° С. Необходимое количество D-глюкоза недавно добавленный перед использованием.
  2. Для анализа TED в нейронах гиппокампа искусственной спинномозговой жидкостью (ACSF) рекомендуется. ACSF состоит из (в мм): 127 NaCl, 23 NaHCO 3, 3 KCl, 2,5 NaHPO 4 H 2 O, D-25 glucose.H 2 O, 2 CaCl 2, MgCl 2 +2 0,7 H 2 0 в Ddh. 2 0.
  3. Подготовка Fluo5N-AM до концентрации 5 мМ. Чтобы помочь солюбилизации добавляют 8,9 мкл 20% Pluronic F-127 (в ДМСО, хранили при комнатной температуре в защищенном от влаги и света) до 50 мкг лиофилизированного Fluo5N-AM. Затем растворить Fluo5N-АМ посредством водяной бане ультразвуковой течение по крайней мере 2 мин. Магазин аликвоты 0,5 мкл при -20 ° С, в защищенном от света и влаги.
  4. Подготовка антагониста и агониста запасы по мере необходимости. Например: а) 10 мМ АТФ или АДФ (в H 2 O, метаботропный активации пуринергических рецепторы), б) 10 мМ карбахол в H 2 O (агонистымускариновых рецепторов ацетилхолина), в) 30 мМ циклопиазоновая кислоты (CPA) в ДМСО (блокатор SERCA), г) 50 мМ DHPG в PBS (метаботропный агонистов рецепторов глутамата для мГлуР я и мГлуР 5), д) 10 мМ глутамата в H 2 O, F) 1 мМ иономицин в ДМСО (ионофором), G) 5 мМ тапсигаргин в ДМСО (высокое сродство блокатор SERCA). Магазин аликвотах при -20 ° С.
  5. Лентивирусов векторов: Этот протокол включает в себя использование лентивирусов частиц выражение TED вектор. Их производство и хранение не является частью настоящего Протокола. Мы используем лентивирусных векторов второго поколения для передачи рекомбинантный карбоксилэстераз в клеточных линиях, глиальных клеток и нейронов. Наши лентивирусный баз системы на вектор экспрессии FUGW 37, и упаковка плазмид pCMVΔR8.91 или psPAX2 и pseudotyping плазмиды pMD2.G 38,39. ОСТОРОЖНО: считаем, что работа с рекомбинантной самостоятельно инактивации лентивирусных векторов требует тщательногорассмотрение руководящих указаний по биобезопасности. Во многих странах эти векторы классифицируются как биологической группы риска 2. Для получения дополнительной информации обратитесь к http://www.addgene.org/lentiviral/ .

2. Подготовка и вирусная инфекция нейронов гиппокампа мыши

  1. Вымойте покровные стекла в стеклянном блюде Петри диаметром 20 см (100 покровные за блюдо) 1x в 70% этаноле в течение приблизительно 30 мин. Наконец, добавьте 100%-ного этанола (ра) в течение 2 мин. Удалите остатки этанола и высушить покровные в стерильной капотом.
  2. Подготовьте два различных видов сред для культур нейронов гиппокампа: (а) нейробазальной среды с B27 1:50, (б) полное среда: нейробазальной среды с B27 1:50, 1:100 Glutamax, N2 добавка 1:100. Стерильные фильтрата средствах массовой информации и не храните их в клетке инкубатора до использования.
  3. За один день до вскрытия, покровные получают сначала путем размещения одного стерильные 10 мм покровным в каждоми 4-луночный планшет культуре клеток. После этого тщательно покрыть каждую покровное с 80-100 мкл 0,1% поли-L-лизин и хранения блюд в инкубаторе в течение ночи.
  4. В день вскрытия и клеточных культур, начинают со стиральной покровные три раза 100 мкл HBSS и передачи 100 мкл нейробазальной среду в каждую покровным. Поместите посуду в инкубатор для равновесия (например, во время вскрытия мышей).

Рассечение

Мы выполняем наши эксперименты с мышами в соответствии с правилами ЕС союза, утвержденный нашими Уходу за животными и использованию комитета.

  1. Удалить общего мозга и гиппокампе рассекать на двусторонней основе.
  2. Осторожно удалите мозговых оболочек и тканей, кроме гиппокампа и место одного гиппокампа каждая в 1,5 мл пробирку, содержащую 450 мкл HBSS. Хранить ткани на льду до достаточного количества гиппокампе не был выделен.
<р = класса "jove_step"> Клеточные культуры

  1. Добавить 50 мкл 1% трипсина (Worthington) в каждую пробирку и инкубировали их при 37 ° С на водяной бане в течение 15 мин. Встряхнуть трубы иногда. Для остановки реакции переваривания, добавляют 50 мкл 1% ингибитора трипсина в каждую пробирку и инвертировать трубки несколько раз.
  2. Передача всех тканей до 5 гиппокампе одному 15 мл сокола трубки избежать переноса жидкости. Добавить B27-среде (а) до конечного объема 5 мл.
  3. Растирают ткани с использованием огня полированной стеклянной пипетки Пастера тщательно пипетки вверх и вниз. ОСТОРОЖНО: избежать воздушных пузырей!
  4. Спина с 400 мкг в течение 3 мин, супернатант и ресуспендируют осадок клеток в 5 мл B27-среде (а).
  5. Растирают ткань вновь со стеклянной пипетки, а затем дважды с помощью 1000 мкл пластиковый кончик фильтра. Выполните это как описано в пунктах 2.9 и 2.10.
  6. После последнего центрифугирования ресуспендируют осадок клеток в 2 мл полной Mediuм (б) и растирают клеток с 200 мкл пластиковый кончик фильтра. Чтобы отделить оставшиеся сгустки клетку из одной клеточной суспензии, пусть скопления клеток поселиться в течение 1-2 мин.
  7. Граф клеток и рассчитать общее количество клеток, необходимых для вирусной инфекции. Для визуализации используют TED 25000 клеток на 10 мм покровным.
  8. Покрытие дополнительных 25000 Номера для приемными клетками в качестве контроля рекомендуется в этой точке.

Вирусные инфекции

  1. Передача клеточной суспензии на вирусную инфекцию в свежем 15 мл сокола трубки и центрифуги в течение 3 мин при 400 х г.
  2. Аспирируйте супернатант и ресуспендирования клеток в 300 мкл среды (б)
  3. Добавить соответствующее количество инфекционных лентивирусов частиц выражение TED вектор, и пусть трубки сокола стоять при комнатной температуре в течение 10 мин.
  4. Заполнение трубки с полной среде (б) до конечного объема необходимого для покрытия (100 мкл на каждые 10 мм покровным), аспирации среды из COVerslip, и сразу же поместите 100 мкл суспензии клеток на каждую покровным.
  5. Поместите посуду в инкубаторе, пока все клетки не расположились (около 2 ч) и внимательно заполнить посуду, пока они не содержат 2 мл среды (б).
  6. Пусть нейроны расти в течение по крайней мере одной недели. Замена 50% от среднего каждую неделю.

3. Культура и вирусно-инфекции мыши Кортикальная глиальных клеток

Подготовка

  1. Сначала готовят базальной среде глии (смесь 1:1 DMEM/F12, содержащей 10% FCS, 5% HS, 1% пенициллина / стрептомицина, 0,45% глюкозы) и нанесение покрытий на культуре клеток T75 колбу с 4 мл 0,5 нг / мл поли -DL-орнитина гидробромид (порно) (разводят в 150 мМ раствора борной кислоты, рН 8,35). После инкубации при 37 ° С в течение 2 часов или в течение ночи, промывают колбу культуры клеток три раза HBSS и добавляют 18 мл основной среды глии содержащий B27 1:50 и 10 нг / мл EGF. Равновесие колбу культуры клеток в инкубаторе (до 3 ч).
<р = класса "jove_step"> Вскрытие

  1. Мы выполняем наши эксперименты с мышами в соответствии с правилами ЕС союза, утвержденный нашими Уходу за животными и использованию комитета.
  2. Проанализируйте мозг одного P5-P7 мыши и удалить гиппокампе и мозговых оболочек в обоих полушариях, как описано в 2.5.
  3. Проанализируйте лобной коры, разрезать его на несколько небольших частей и собирать их в 1,5 мл пробирку, содержащую HBSS. Хранить пробирку на льду и перейти к части культуры клеток.

Клеточные культуры

  1. Передача всех тканей из трубки в 15 мл сокола трубки с помощью отожженной пипетки стекла.
  2. Добавить базальной среды до конечного объема 5 мл и растирают ткани с помощью пипетки несколько раз вверх и вниз с огнем полированные пипетки стекла. После центрифугирования при 300 х г в течение 3 мин, аспирации среды и ресуспендируют осадок клеток в 5 мл основной среды.
  3. Повторите шаг 3,5 раза.
  4. После Тхий центрифугирования ресуспендируют осадок клеток в 2 мл основной среды глии содержащий B27 (1:50) и 10 нг / мл EGF.
  5. Titruate еще раз и передачи клеточной суспензии на подготовленную T75 колбу культуры клеток и позволяют клеткам расти в течение 3-4 дней.

Стиральная глиальных клеток (через 3-4 дня в культуре):

  1. Вымойте клетки один раз 10 мл PBS и энергично нажмите или слегка ударить колбу несколько раз рукой, удерживая его крепко в другой руке. К этому мусор шаг клеток и их скоплений будут удалены из культуры.
  2. Аспирируйте PBS и добавляют свежий базальной среде глии содержащий B27 (1:50) и 10 нг / мл EGF. Далее развивать культуру в течение 5-7 дней пока клетки не достигают 80% слияния.

Разделение, трансдукция и окончательная посева глиальных клеток:

  1. Coat 10 мм покровные 100 мкл поли-D-лизином (Основной раствор: 0,1%, разбавленный 1/50 объявлений 20 мкг / мл в PBS или HBSS) и инкубируютих в термостате в течение ночи. Вымойте покровные три раза HBSS и добавить 100 мкл базальной среды глии. Равновесие покровные в инкубаторе (3 ч).
  2. Вымойте глиальные клетки в два раза с 10 мл PBS, аспирации PBS и добавьте 3 мл трипсина (TrypLE, неразбавленный). Trypsinize клетки до 1 мин. ОСТОРОЖНО: Избегайте чрезмерного трипсинизация. Обычно более 80% всей клетки отделяют после 1 мин и этого достаточно, чтобы иметь несколько миллионов здоровых клеток.
  3. Остановить реакцию добавлением 10 мл основной среды глии, передачи клеточной суспензии в 15 мл трубки сокола, центрифуги при 300 мкг в течение 3 мин. Аспирируйте супернатант и ресуспендируют осадок клеток в 5 мл основной среды глии.
  4. Опять же, спина и аспирации, как описано в шаге 3,15, то клетки ресуспендируют в 5 мл основной среды глии.
  5. Передача необходимого количества клеток в 1,5 мл трубки. 10 4-2x10 4 глиальные клетки являются достаточными для одной 10 мм покровным. Как правило, об подвескиUMe для трансдукции клеток для одного 4-хорошо блюдо составляет менее 200 мкл. Добавить соответствующее количество лентивирусов частиц TED вектора экспрессии в клетки и инкубируют их при комнатной температуре в течение 10 мин. Затем заполнить подвеска с базальной среды глии посева объема (100 мкл на покровное).
  6. Семенной 100 мкл инфицированных клеток на покровное и инкубировать в течение примерно 2 ч, затем добавляют базальной среде глии содержащий B27 1:50 и 10 нг / мл EGF до конечного объема 2 мл.
  7. Для идеальных условиях культивирования клетки использовать для экспериментов на 3-7 день после посева.

4. Генерация и культуры Репортер клеточной линии

TED линии репортер ячейки были созданы на основе HeLa, BHK21, HEK293 и SH-SY5Y. Здесь мы предлагаем протокол для клеток HeLa, но протокол может быть передан любой другой клеточной линии, а также.

Генерация стабильной клеточной линии HeLa

  1. Сплит дикий тип клеточной линии HeLa и передачи 100000 Cлоктей в объеме 200 мкл в 1,5 мл трубки.
  2. Добавить соответствующее количество лентивирусов частиц TED вектора экспрессии в пробирку и инкубируют клетки-вирусной суспензии в течение 10 мин при комнатной температуре. Затем семена клеток в общем объеме 2 мл среды (DMEM, 10% FCS, 1% пенициллина / стрептомицина) в 30 мм чашки и инкубируют в течение 3 дней.
  3. После промывания один раз ЗФР, аспирации раствора и добавьте 500 мкл трипсина (TrypLE, 2:03 в PBS). Выдержите в течение ок. 3 мин, а затем остановить реакцию добавлением 3 мл среды. Передача суспензии в 15 мл трубки сокола и центрифуге при 400 мкг в течение 3 мин.
  4. Ресуспендируют осадок клеток в 200 мкл среды и снова инфицировать клетки с лентивирусов частиц, как описано в 4.2. Затем семена клеток в культуре клеток T25 колбе в 10 мл среды.
  5. Рост клеток до слияния 60-80% пока не будет достигнута. Затем разделить культуру.

TED линии репортер клетки

  1. TED линии репортер ячейки можно сохранитьред в любой стандартной среде, например среде DMEM, содержащей 5% или 10% FCS и 1% пенициллина / стрептомицина используется.
  2. Пластина соответствующее количество клеток в 4-луночные чашки с стерильные 10 мм покровные стекла (см. выше), например, от 10000 до 20000 клеток на покровное.
  3. Рост клеток в течение по крайней мере двух дней, прежде чем использовать их для TED изображений.

5. Подготовка к процедуре Живая изображений на инвертированный микроскоп

    1. Prewarm HEPES-Рингера до комнатной температуры и добавляют D-глюкозы.
    2. Prewarm ACSF (без Са 2 + и Mg 2 +) до комнатной температуры и добавляют D-глюкозы. Проветривать ACSF с карбогена течение 5 минут. Затем добавляют 1 М исходных растворов CaCl 2, MgCl 2 до конечных концентраций 2 мМ каждого из них.
  2. Запустите живой микроскопы изображений и всех компьютерных программ.
  3. Начать перфузии на "пустышка" изображения камеры и уравновешивают трубки системы.
  4. Prewarm встроенный нагреватель решения и камерой изображений в столике микроскопа. Исправить изображения камеры в нагревательной вставкой.
  5. Уравновесить систему, чтобы 32-37 ° C, прежде чем начать процедуру загрузки красителя. ОСТОРОЖНО: Во избежание случайного потока перфузии раствора в микроскоп мы используем системы связи волос вокруг целей и эластомерных силиконовых листов (1 мм) для защиты столике микроскопа.

6. Красителем любого типа клеток

  1. Ресуспендируйте 1 аликвотой Fluo5N-AM (см. 1.3) в 100 мкл предварительно нагретого решение томография (HEPES-Рингера или ACSF).
  2. Растворения Fluo5N-AM в визуализации решения (ХЕПЕС Рингер или ACSF) в водяной бане ультразвуковую на 90 секунд.
  3. Использование свежей 4 - или 24-луночный планшет и передачи 400 мкл предварительно нагретого решение визуализации для одной скважиной. Добавить раствор красителя к тому же хорошо, чтобы прийти к 500 мкл 5 мкМ раствора.
  4. Аккуратно положите покровное с клетками (например,10-18 мм в диаметре) в скважине, клетки вверх.
  5. Выдержите в течение соответствующего периода времени в культуре клеток инкубаторе при температуре 37 ° C (тем временем подготовить визуализации настройки на столике микроскопа). Типичные красителя загрузкой пояс для нейронов и глиальных клеток 7-15 мин, а для клеточных линий 10-20 мин.

CRUCIAL: красителя время загрузки и концентрации красителя зависит от типа клеток, клеточной плотности, и эксперимент конкретным потребностям! Длительное время инкубации в присутствии красителя может повредить клетки, особенно первичные нейроны и глиальные клетки, первичные и это чрезвычайно важно для реагирования на физиологические стимулы. Долгосрочные времени инкубации (например, 30 мин) будет полезно только для экспериментов ER кальция локализации исследовать распределение ER кальция в небольших субклеточных структур, например, штраф невриты или шипами. В некоторых экспериментах, смесь 1/3 питательной среде с изображениями решение может помочь в защите клеток при Fluo5N-AMЗагрузка.

  1. Мгновенно, передавать покровное к другой культуре клеток лунку, содержащую изображения растворе (HEPES-Рингера или ACSF) и начать монтаж клеток в изображения камеры.

7. ER-кальций изображений живых клеток с перевернутой лазерной сканирующей конфокальной микроскопии

  1. Используйте кисть, чтобы применить высокотемпературную смазку вакуум изображения камеры. Смазки необходимо зафиксировать покровное на дно перфузии камеры. Мы используем самодельные камеры визуализации для 10-12 мм покровные с небольшим объемом, что позволяет высокая скорость перфузии до 15 раз буфером обмена в минуту. Коммерчески доступный перфузионной камере в течение 18 покровные мм, могут быть приобретены у Warner инструментов (RC-49FS). Эта камера также позволяет поля стимуляции нейронов.
  2. Возьмите покровное с Fluo5N нагруженных клеток и добавить небольшое падение визуализации растворе (50-100 мкл) на клетках держать клетки, покрытые раствором изображений.Поверните покровного вверх ногами и установите клеток в изображения камеры. Чтобы нажать на покровное в кремний-клея, используйте ватную палочку (например, ватные палочки).
  3. Вытрите остаточного буфера из нижней части покровного стекла с ватными палочками. ОСТОРОЖНО: Тщательно вытереть остаточной влажности при использовании масла-объективом с высокой числовой апертурой для изображений с высоким разрешением. Остаточная соль лучше всего удалять водой. Случайное мазок масла можно удалить ацетоном или чистого этанола.
  4. Биржа "пустышка" изображения камеры с экспериментальной камере изображений. Вымойте клетки в течение 5-10 мин непрерывной перфузии.
  5. Вымойте клетки в течение 5 - 10 мин непрерывной перфузии.
  6. Для выбора соты использовать минимальное количество лазерного излучения, высокий уровень сканирования (2-4 Гц), небольшой размер и высоким коэффициентом усиления.
  7. ВНИМАНИЕ: Для выбора Fluo5N-меченых клеток не используют избыток света или прямого освещения с epifluorescenT свет. Яркое освещение Fluo5N/Ca 2 + комплексов вызывает полную потерю ER-конкретные флуоресценции в течение 2-4 сек (рис. 5).
  8. Настройка микроскопа в соответствии с запланированным эксперимента. Для ориентации, представитель настройки для изображений с различными векторами TED приведены в таблице 1. Для перевернутой конфокальной лазерной сканирующей микроскопии, мы используем Olympus IX81 микроскопа в сочетании с Fluoview 1000 конфокальной системы, оснащенной диодных лазеров (473 нм, 15 мВт, 559 нм, 20 мВт) и спектральной системы детектора.
  9. В начале эксперимента документ интересующие клетки с высокой разрешающей х, стеки уг изображения.
  10. Выполните х, у, изображений для мониторинга динамики ER кальция в конкретных экспериментальных условиях. Типичные параметры нашей системы, приведены в таблице 2.
  11. Наблюдать за изменением ER кальция при непрерывной перфузии с изображениями решения. Типичная скорость буфер обмена являются электронныеxemplarily: (а) стиральные клетке и в магазине истощение SERCA блока: 1,5 мл / мин, (б) ATP / DHPG стимуляции: 3 мл / мин.
  12. Приобретайте цифровые изображения преимущественно с 12-разрядным (4096 серого значений). Для параллельной визуализации Fluo5N/Ca 2 + и RFP, 8-битных изображений (256 серых значений) может спасти вашу систему от переполнения данных.
  13. Хранить живых клеток во времени изображения (х, у,) или 3D-изображения стеки (X, YZ) (для сотовых распределение Fluo5N/Ca 2 + комплексы) в ImageJ совместимый формат (например, TIFF).

8. Обработки изображений и анализа данных

  1. Откройте изображение стека в программе ImageJ. В случае многоцветного изображения, разделите RGB каналов, отвечая на вопрос ImageJ.
  2. Определите ваш регион (ы) интереса (ROI) путем тщательного рассмотрения стеки (например, с помощью интенсивности в зависимости от времени участка)
  3. Используйте время-анализатор серии плагин для считывания средней интенсивности пикселя в ROI (F сырье). Dependinг на цели, нарисуйте вокруг трансформирования либо полная ER или небольших регионах ER ER например дендритов периферийных регионов клетки. Кроме того, включать 1-3 ROI в районах без клеток для вычитания фона.
  4. Рассчитайте среднее фоновой флуоресценции (F б) путем вычисления среднего значения флуоресценции фона ROI и вычитать F фонового значения B из F исходные значения, чтобы получить значение F ROI.
  5. Рассчитать F 0, что базальные флуоресценции клеток, путем вычисления среднего значения от десяти до 30 флуоресцентный значений для каждого ROI в состоянии покоя.
  6. Вычислить фона с коррекцией относительных изменений флуоресценции f / F 0 по формуле:

Уравнение 1

  1. Настоящий относительные изменения светитьсясть как след с f / F 0 на Y-оси, а время для X-оси.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Этот протокол обеспечивает без прерывания подход для прямой визуализации свободного кальция ER. Низкоаффинными синтетического Ca 2 + индикаторы выходят в свет и захваченных в просвете ER с помощью ER целевых, рекомбинантные активность фермента эстеразы. Улучшение загрузки Са 2 + индикатор красителей для ER просвет позволяет прямую и быструю визуализацию динамики ER кальция магазине.

Сотовый типов для TED

Возможностей использования этого метода была показана в клеточных линиях BHK21, HEK293 34, HeLa 17, SH-SY5Y, культурный астроциты 8,40 и первичной гиппокампе и коре нейроны 8,34,41. В наших экспериментах TED хорошо работает, когда TED конструкции стабильно экспрессируются, предпочтительно по себе инактивирующих лентивирусных векторов 37,39 использованием относительно слабый промотор (например, промотор убиквитина) 35. Другие, более сильные промоутеры находятся под следствием.

Успешная загрузка с TED Fluo5N предлагает четкое и яркое окрашивание ER просвета, который избавлен из ядерной области 34,41. В состоянии покоя государств, Fluo5N/Ca 2 + комплекс марка представляет локализация кальция при связывании Fluo5N, следовательно, оно представляет собой региональное распределение свободного кальция в просвете ER. На фиг.6 конфокальных изображений Fluo5N/Ca 2 +-комплексов и Tag-RFP-T2 этикетки красных CES2 приведены в клетках HeLa, корковый астроцитов и нейронов гиппокампа. 6С показывает флуоресцентного Са 2 + индикатор комплекс в клетке теле, а также нейритов нейронов гиппокампа. Это позволяет экспертизы Са 2 + сигналы в относительно небольших процессов (см. также 34,35).

Некоторые опыт необходимо различать типичные этикетки ER от цитозольной метку, которая будет наблюдаться WheN клетки повреждены или нездоровым. Цитозольного, эндогенные эстераз также выпуск Fluo5N, что приводит к очень яркие окрашивание цитоплазмы и ядра, когда кальций протекает через плазматическую мембрану. Цитозольного окрашивания Fluo5N/Ca 2 + наблюдается при TED-меченые клетки обрабатывают ионофора иономицин, в присутствии внеклеточный кальций (рис. 7).

Прямое изображение высвобождения кальция из ER

Одним из основных применений TED является прямой визуализации ER магазине истощения 17,34. На рисунке 8 мы покажем один представитель эксперимента, выполненного с нейронов гиппокампа, выражая красных CES2. Нейроны с красных CES2 обогатить большое количество Fluo5N в околоядерной региона (стрелки на рисунке 8). Когда SERCA блокатор CPA наносится посредством перфузии, быстрое истощение магазин кальция ER наблюдается (фиг.8В). Здесь мы представляемисходные значения (ось), которые получаются, когда нейроны полученную с 12-битным. Изображений условий, перечисленных в таблице 2. Обратите внимание на огромные изменения в средней флуоресценции плотность на ROI, что наблюдается при TED применяется к нейронам. Для других экспериментов анализа ER высвобождение кальция в нейронах использованием Тед, мы хотели бы обратиться к более ранних экспериментах, которые уже были подробно обсуждены 8,34,35. Короче говоря, в TED нейронов в пробирке используется для визуализации SERCA чувствительных ER кальция магазине весьма подробно перевернутой конфокальной лазерной сканирующей микроскопии 8,34 и была успешно применена для быстрой визуализации (15 Гц) из mGluR1 / 5 индуцированных IiCR 34.

9 показан типичный эксперимент с мышью кортикальных астроцитов в пробирке, стимулируется 200 мкМ АТФ путем перфузии системы с низким разрешением использовании 20x воды цели. После лентивирусный инфицирования клетки показано здесь выразил Красно-CES2, который приводится в действие промотор убиквитина. Скорость сканирования составляет ~ 2 Гц и оба канала (Fluo5N/Ca 2 + и красных CES2 слитый белок) одновременно в образ (в строке). В начале эксперимента глиальные клетки показали хорошую инфицирования экспрессионные конструкции и хорошую нагрузку с Fluo5N-AM. Трансформирования, которые были проанализированы, выделены на рисунке 9a. Один ROI был установлен для измерения фоновой флуоресценции (BG), ROI 1-2 измерения флуоресценции целых клеток, ROI 3 охватывает только ER ячейки и ROI 4 был разработан вокруг всей поля зрения. Вскоре после стимуляции АТФ флуоресценции Fluo5N/Ca 2 + комплексов резко упали из-за высвобождения Са 2 + из ЭР. Наконец, ER частично наполняется кальций снова. Одновременно флуоресценции RFP постепенно уменьшается вследствие небольшого отбеливания (фиг.9В, нижняя панель). Следы представляют изменения в fluoresc ENCE интенсивности (рис. 9) указывают на существенный недостаток TED. Во многих (не всех) экспериментов большое количество Fluo5N-комплексы теряются во время стимуляции. Как следствие, значения флуоресценции не возвращаются к исходному уровню интенсивности флуоресценции.

На рисунке 10 показано CES2-инфицированных BHK21 клетки с высоким разрешением, помечены Fluo5N/Ca 2 + и стимулировали АТФ. BHK21 клетки подают в качестве системы раннего ячеечной модели для анализа кальция ER 31. Обратите внимание, что ER выброс кальция, и в магазине заправки визуализируется в тонкие структуры канальцев ER. Структуры были отображаемого на замедленной скорости (~ 0,2 Гц), с 512 х 512 пикселей, Эйри диск 1 установка для конфокальной отверстие, и с 63x цель масло.

"/>
Рисунок 1. Обзор сигнализации кальция ER. ER высвобождение кальция вызвана "утечка" каналы, такие как ER пор внутримембранного Sec61 комплекса. G-белком рецепторы (GPCR) стимулировать IP 3 производства, который затем вызывает IP 3-индуцированный выброс кальция (IiCR). ER высвобождение кальция воспринимается СТИМ комплексов и индуцирует магазин управлением поступления кальция (SOCE) ионным каналам семьи заявкам и / или каналов Orai кальция. Напряжения закрытого кальциевых каналов (Ca V) посредником быстро кальций-индуцированного высвобождения кальция (CICR) рецепторами рианодиновыми (RyR) либо путем прямого взаимодействия белка (скелетные мышцы) или физиологического взаимодействия (клетки сердечной мышцы, нейроны). Потере кальция ER динамически спасен действие насоса SERCA (саркоплазматического-эндоплазматический ретикулум кальций АТФазы).

res.jpg "SRC =" / files/ftp_upload/50317/50317fig2.jpg "/>
Рисунок 2. Принцип целевого эстеразы-индуцированной красителем (TED). Целевые сверхэкспрессию карбоксилэстеразы обеспечивает высокую активность эстеразы (CES2) в ЭР. Эстеразы преобразует ацетоксиметилового красителя Fluo5N-АМ к кальций-чувствительный, флуоресцентный краситель, который остается в ловушке в ЭР. Fluo5N имеет низкое сродство к ионам кальция. Таким образом, в состоянии покоя, флуоресцентные Fluo5N/Ca 2 + комплексы преимущественно формируется в ER, где концентрация кальция составляет приблизительно 1000 раз выше, чем в цитозоле.

Рисунок 3
Рисунок 3. Представитель TED векторные конструкции CES2.: Родные версию мыши CES2. CES2 OPT 43: ERСигнальный пептид был обменен, и теперь включает интрон, а мотив ER удержания было изменено на классической KDEL-ER удержания и извлечения мотив растворимых белков ER. Myc тег обеспечивает эпитоп белка обнаружения непрямой иммунофлуоресценции маркировки и Вестерн-блоттинга. Красно-CES2 8,43: красный флуоресцентный белок был добавлен прямой за аминотерминальные сигнального пептида. Красный LK CES2 43: глицин-серин линкера была введена, чтобы установить гибкий шарнир между ППП и CES2 элемента.

Рисунок 4
Рисунок 4. Работа потока для прямого кальция ER визуализации с использованием TED. Клеточные суспензии первичных клеток или клеточных линий, трансдуцированных вирусом, содержащим конструкцию TED выражения. Затем клетки высевали на coversliPS. При использовании RFP-CES2 конструкций, трансдуцированных клеток могут быть идентифицированы с помощью красной флуоресценции. Target-эстеразы индуцированного красителем осуществляется путем инкубации клеток в растворе, содержащем изображений АМ-сочетании низкого сродства Са2 + индикатор, такой как Fluo5N-AM или Mag-Fura2-AM. ER кальций изображений выполняется с помощью инвертированного микроскопа лазерного сканирования (см. протокол) или любое другое совместимое устройство визуализации. Во время живого изображения клетки находятся в состоянии непрерывной перфузии с изображениями решения, такие как искусственное спинномозговой жидкости (ACSF). Стимуляции клеток осуществляется либо перфузии или местными давления выброса.

Рисунок 5
Рисунок 5. Сильные эпифлуоресцентной освещения разрушает ER-конкретные Fluo5N TED этикетке в течение нескольких секунд. Представитель изображения из видео, полученную с использованием прямого микроскопа изображений. Здесь, глиальные клетки выражениеэссинга RFP-CES2 были загружены Fluo5N-AM. Первая красной флуоресценции из инфицированной клетки было обнаружено с ПЗС-камерой. Впоследствии Fluo5N/Ca 2 + сигнал был освещен со светодиодным источником света. Начальная четкой локализации ЭР Fluo5N/Ca 2 + комплексы (желтые стрелки) быстро разрушается сильное освещение с 470 Светодиодный источник света и сдвиг в распределении флуоресценции становится видимым в ядерной области (желтые стрелки, 12,46 сек).

Рисунок 6
Рисунок 6. TED загрузки с Fluo5N-AM в различных типах клеток Верхняя панель:. HeLa клетки со стабильными RED-CES2 выражения Средняя панель:. Корковых астроциты после лентивирусный трансдукции красных CES2 Нижняя панель:. Нейронах гиппокампа с красно-CES2 на DIV 8. Все клетки культивировали на покровных стеклах и окрашивали Fluo5N-AM, как описано в методическом разделе. Fluo5N/Ca 2 + Этикетка также представляют локализации кальция при связывании с Fluo5N. Шкала бар 40 мкм.

Рисунок 7
Рисунок 7. Fluo5N краситель в цитозоле становится видимым через иономицином. Глиальные клетки были инфицированы красных CES2, меченные Fluo5N-AM и обрабатывали SERCA-блокатор тапсигаргин истощать ER кальция. Иономицином наблюдалось значительное приток внеклеточного кальция. (Верхняя панель) клетки показывают резкое увеличение Fluo5N/Ca 2 +-опосредованной флуоресценции. (Нижняя панель) средняя проекция изображения интенсивность Fluo5N/Ca 2 +-ярлык показывает типичную цитозольные маркировки флуоресцентными комплекс с кальцием, Синяя стрелка:. Ярко меченых клеток показывает, что эта клетка имеет большое количество кальция в гоэлектронной цитозоле. Предположительно, эта ячейка повреждена Фиолетовая стрелка:. Клетки становятся ярко помечены в цитозоле при обработке иономицин.

Рисунок 8
Рисунок 8. ER кальция истощения магазина в нейронах, блокируя SERCA. (A) нейронов гиппокампа (DIV 9) выражают красных CES2 (A, красный) и помечены Fluo5N-AM (A, зеленый). Стрелки указывают на два проанализированы клеток. Изображений (максимальная интенсивность проекции) является обрезаны элемент аи уг изображения, который был приобретен в начале эксперимента. (B) Сырье следы представляющая ER истощение магазин кальций после перфузии с 30 мкМ CPA. Здесь 1000 Снимки были сделаны с 1 Гц и 12-битной. Исходные значения средней флуоресценции плотность на ROI (Y-ось) двух ячеек показано на являютсяпостроены в течение долгого времени (красная и синяя кривая). Фоновых значений (черный след) остаются неизменными. AU = произвольных единицах серого значений, представляющих плотность флуоресценции.

Рисунок 9
Рисунок 9. ER высвобождение кальция на АТФ стимуляции глиальных клеток. Глиальные клетки были инфицированы красных CES2 и загружается с Са 2 + индикатор Fluo5N-AM. Клетки стимулировали 200 мкМ АТФ с помощью перфузии в течение 10 сек. (A) глиальных клеток, экспрессирующих красных CES2 (средний) помечены Fluo5N-AM (слева). Трансформирования выделены. (B) Единичные картинки извлекается из покадровой последовательности. (Верхняя панель) Интенсивность флуоресценции высокого 0 сек и 71 сек до клетки реагируют. Это резко падает (80 сек), и достигает минимума при 86 себеC, прежде чем она снова поднимается (160 сек), как кальций закачивается обратно в ER. (нижняя панель) интенсивности флуоресценции RFP уменьшается медленно и непрерывно с течением времени из-за отбеливания. (C) Время следы показывающие f / F 0 значения трансформирования указано в А. флуоресценции, с указанием концентрации кальция, падает после стимуляции АТФ и частично восстанавливается. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

Рисунок 10
Рисунок 10. Высокое разрешение изображения АТФ-индуцированного высвобождения кальция в ВНК21 клеток. Клетки были загружены Fluo5N-AM и отображаемого в присутствии внеклеточный кальций. (A) изображение серии, показывающий изменения в гриппаo5N/Ca 2 +-флуоресценции полученных при АТФ-стимуляции. (B) Среднее проекции изображения интенсивности указывает трансформирования показано на C (C) ATP индуцированный выброс кальция и заправки ER магазине кальция анализируется в небольших субрегионов ER. Следы представляют собой изменения в флуоресценции.

Лазерного возбуждения [Нм] Дальность обнаружения [Нм]
TED с красных CES2 векторных конструкций
473 (Fluo5N/Ca 2 +) 507-545
559 (Tag-RFP-T2) > 570
TED с CES2 только векторные конструкции
473 нм (Fluo5N/Ca 2 +) > 507

Таблица 1. Настройки для спектрального детектора.

Эксперимент ER истощения использованием красных CES2 Стимуляция нейронов использованием CES2 конструкции Высокое пространственное разрешение изображений, CES2
Цель (NA) 20x воде (0,7) 20x воде (0,7) 40x нефти oil/63x (≥ 1,3)
473 нм лазерный
Мощность 1% 1%
HV 600-780 600-780 400-780
Усиление B 0-1% 1-2% 0%
Смещение 0 0 0
559 нм лазерный
мощность 1% OptioNALC optionalC
HV 600-780 optionalC optionalC
Усиление B 0-1% optionalC optionalC
Смещение 0 optionalC optionalC
Скорость сканирования 1-2 Гц Бесплатный перспективе Бесплатный перспективе
Размер изображения 320x320 пикселей 240x240 пикселей 512x512 пикселей
Тип сканирования В соответствии Двунаправленный Nyquistcriterion (2 пикселя / элемент)
Стимуляция 100-200 мкМ АТФ :5-15 сек; 200-500 мкМ глутамата в течение 5-15 сек 100-200 мкм агонистов: 5-15 сек
Пинхол 2-5 просторные дисков 2-5 просторные дисков 1 воздушный дисков

Таблица 2. Примеры микроскопом настройки в зависимости от типа эксперимента:. HV = ток ФЭУ детектора, B: усиление = усиление сигнала ФЭУ, C: Дополнительно: канал свободен для использования с другими красными флуоресцентными красителями (например, CMX-РОС для визуализации потенциала митохондрий) или другие красные флуоресцентные белки.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Преимущества и недостатки метода TED широко обсуждалась в последних публикациях 34,35. По сравнению с другими методами, описанными выше, TED обходит проблему срыва и перфузии клеток. Кроме того, два аспекта необходимо уделять особое внимание. Принцип TED для ER кальций изображений требует (1). Направленную экспрессию активного карбоксилэстеразы в просвете ER с помощью TED векторные конструкции и (2). Эффективному и преференциальный выпуска с низким сродством синтетический АМ-эфиры кальций красителей в ER просвет.

1. TED векторных конструкций

Рисунок 3 приведены развитие TED векторных конструкций. Тед был разработан на основе белков семейства CES (ЕС 3.1.1.1). Эти белки проживающих членов в ЭР просвет. Ибо в лабораторных исследованиях рекомбинантный администрации CES белков лучше всего работает после стабильной экспрессиибелка или после вирусной инфекции с умеренным уровнем экспрессии. В настоящее время неизвестно, будет ли других белков с активностью эстеразы может заменить CES белков для TED изображений. Не рекомендуется использовать временной трансфекции векторов TED для динамического анализа кальция ER потому что клетки менее чувствительны после трансфекции процедуры. CES белки нуждаются в надлежащей ориентации в ЭР просвете и этот шаг нужно эффективное расщепление сигнального пептида ER. Кроме того, хранение и извлечение CES белков в ЭР просвете опосредовано их аминотерминальные KDEL-подобный мотив. Эти механизмы могут быть насыщенными, когда высокие уровни экспрессии получают путем векторы TED после кратковременной трансфекции. Это может приводит к ложной локализации CES-белков и способствует образованию белковых агрегатов.

2. Низкоаффинными Ca 2 + Индикаторы для TED

Наиболее важным недостатком TED вызвано ограничений безрезультатносостоянии индикаторных красителей для без прерывания анализа кальция ER. ER кальций изображений с TED требует индикатор красители с высокой K D (то есть низкое сродство) и низким флуоресценции в отсутствие кальция. Основываясь на нашем опыте Fluo5N-AM работает лучше всего, но это индикаторный краситель не отбеливатель устойчивостью. Низкоаффинными Ca 2 + индикаторы Mag-Fura2-AM (K D ~ 25-50 мкм) 34 и Mag-Fluo4 (K D ~ 20-25 мкм) были также проверены. Оба красителя хорошо загружен в ER структур Тедом, но возрастает риск получения "смешанные сигналы" при стимуляции выпуска ER высока. "Смешанные сигналы" представляет первый быстрый рост флуоресценции в цитозоле последующим снижением флуоресценции в ER. Чтобы преодолеть это ограничение, разрушительные подходы к визуализации кальция ER может помочь 32,35. Mag-Fluo4 (K D ~ 20-25 мкм) показывает сильную TED-опосредованного метку цистерн Гольджи, который является менее выраженным, когда Fluo5N-АМ яс использован.

Приложения и перспективы

Здесь мы сосредоточимся на обратной лазерной сканирующей конфокальной анализ ER кальция динамические с Тедом. TED измерения также могут быть адаптированы к любой стандартной конфокальной системы или широким полем системы с соответствующим источником возбуждения (лазер, LED, металл галогенных ламп, монохроматор), фильтры и флуоресценции системы обнаружения 6.

TED особенно полезна в тех клетках, которые не экспрессируют достаточной эндогенной активности CES в ЭР. Мы заметили, что, например, BHK21 клетки обеспечивают достаточный эндогенной активности эстеразы в ЭР выпустить низкие показатели близости. В наших руках, это не в случае со многими другими клеточными линиями (НЕК 293, SH-SY5Y, HeLa, PC12), первичное глии и первичных нейронов. Здесь, метод TED позволяет успешно без прерывания красителем в ЭР.

Будущие TED векторы могут степень его применения от ER просветадругих субклеточных отсеках или сотовую микродоменов. Принцип метода TED не зависит от индикаторный краситель, и поэтому может быть использован с АМ-эфир любой краситель, например для визуализации внутриклеточной динамики рН. В последнее время в лаборатории Люка D. Лависе описано, что рекомбинантные эстеразы печени свиньи (помощником) CES1 образует избирательный эстеразой эфира паре с красителями cyclopropylester 42. Cyclopropylester агенты оказались устойчивыми к гидролизу эндогенными эстераз и селективного разоблачения рекомбинантным активность CES включен соты молекула ориентации 42. Это будет интересно исследовать вопрос о том кальция на основе показателей, что новая методика позволит улучшить таргетинг субклеточную специфику синтетических показателей.

TED лучше всего работает в клеточных линиях, когда TED белки стабильно экспрессируются. Создание коллекции со стабильными клеточными линиями TED будет полезно.

Трансгенные мыши TED модели являются также основной целью нашей работы, и это позволит TED в конкретных препаратах ткани от конкретных нейронных цепей, скелетных мышцах, сердце, или готовые продукты из сосудистой системы. Эта модель мыши будет способствовать передаче анализа динамики ER кальция из клеточного уровня до более физиологических контексте ткани.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана грантами Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) и BL567/3-1 Friedrich-Баур-Stiftung. Мы хотели бы поблагодарить Роджера Y. Tsien, Медицинского института Говарда Хьюза лаборатории в Университете Калифорнии, Сан-Диего за предоставление нам Tag-RFP-T2. Мы признаем счастью Дэвид Балтимор, Калифорнийский технологический институт, Пасадена, и Дидье Trono, Женевский университет, Женева, за предоставление нам лентивирусный плазмид FUGW и psPAX2/pMD2.G.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(S)-3,5-DHPG (Dihydroxyphenylglycine) Tocris 0805
5';-ATP-Na2, ATP disodium salt hydrate Sigma A26209-1G
B-27 supplement,50x Invitrogen 17504-044
Carbamoylcholine chloride (Charbachol) Sigma C4382-1g
Cyclopiazonic acid (CPA) Ascent scientific Asc-300
Dimethylsulfoxide (DMSO) Sigma D2650
DMEM with Glutamax Invitrogen-Gibco 31966-047
Dulbecco's PBS without Ca/Mg 1x PAA H15-002
Fetal calf serum Invitrogen-Gibco 10270-106
Fluo-5N-AM, 10 x 50 μg Invitrogen F14204
Glutamate Ascent scientific Asc-049
Glutamax Invitrogen 35050-038
Ham's F12 nutrients mixture Invitrogen-Gibco 21765-029
Hank's BSS(1x) without Ca,without Mg, with Phenol Red, HBSS PAA Laboratories H15-010
Horse serum SHD3250YK Linearis
Ionomycin Ca2+ salt Ascent scientific Asc-116
murine EGF PreproTech 315-09
N2 supplement 100x Invitrogen 17502-048
Neurobasal medium Invitrogen-Gibco 21103-049
Pluronic F127, low UV absorbance,2g Invitrogen P6867
Poly-DL-ornithine hydrobromide PORN Sigma P8638
Poly-D-lysine hydrobromide Sigma P7280
Poly-L-Lysin Sigma P2636
Thapsigargin Calbiochem 586005-1mg
TryLE Express Invitrogen 12605-028
Trypsin Worthington LS-003707
Trypsininhibitor from Glycine MAX (soybean) Sigma T6522
Materials
Confocal system: inverted laser scanning microscope: FV1000 with IX81 Olympus user-specific configuration
Confocal system: laser combiner FV10 and diode lasers (405, 473, 559, 635) Olympus user-specific configuration
Confocal system: scan head FV10-SPD with spectraldetector Olympus user-specific configuration
Heater controller TC-344B Warner Instruments 64-0101 to control in line solution heater
NIH ImageJ software WS Rasband, ImageJ, US National Institutes of Health, http://rsb.info.nih.gov/ij/, 1997--2006
Objective: UAPON20XW340 NA 0,7 WD 0,35 Olympus N2709100
Objective: UPLFLN40XO Olympus N1478700
Objective: UPLSAPO60XO/1.35, WD=0.15 Olympus N1480700
Perfusion chamber, inverse custom-made
Perfusion chamber, RC-49FS Warner Instruments W4 64-1709
Perfusion tube: PT-49 Warner Instruments 64-1730 for perfusion
Peristaltic pump MiniPlus 3 (4 channels) Gilson n.a. perfusion pump
Single inline solution heater SH-27B Warner Instruments 64-0102 controlled by heater controller
Suction tubes: ST3R Warner Instruments 64-1407 for perfusion
Heating insert: Tempocontrol 37-2 digital 2-channel Pecon n.a.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Berridge, M. J., Bootman, M. D., Roderick, H. L. Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 4, 517-529 (2003).
  2. Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. The versatility and universality of calcium signalling. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 1, 11-21 (2000).
  3. Agulhon, C., et al. What is the role of astrocyte calcium in neurophysiology. Neuron. 59, 932-946 (2008).
  4. Augustine, G. J., Santamaria, F., Tanaka, K. Local calcium signaling in neurons. Neuron. 40, 331-346 (2003).
  5. Berridge, M. J. Neuronal calcium signaling. Neuron. 21, 13-26 (1998).
  6. Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging calcium in neurons. Neuron. 73, 862-885 (2012).
  7. Neher, E., Sakaba, T. Multiple roles of calcium ions in the regulation of neurotransmitter release. Neuron. 59, 861-872 (2008).
  8. Jaepel, J., Blum, R. Capturing ER calcium dynamics. European Journal of Cell Biology. 90, 613-619 (2011).
  9. Verkhratsky, A. Physiology and pathophysiology of the calcium store in the endoplasmic reticulum of neurons. Physiological Reviews. 85, 201-279 (2005).
  10. Burdakov, D., Petersen, O. H., Verkhratsky, A. Intraluminal calcium as a primary regulator of endoplasmic reticulum function. Cell Calcium. 38, 303-310 (2005).
  11. Streb, H., Irvine, R. F., Berridge, M. J., Schulz, I. Release of Ca2+ from a nonmitochondrial intracellular store in pancreatic acinar cells by inositol-1,4,5-trisphosphate. Nature. 306, 67-69 (1983).
  12. Choi, J. H., Ryu, S. H., Suh, P. G. On/off-regulation of phospholipase C-gamma 1-mediated signal transduction. Advances in Enzyme Regulation. 47, 104-116 (2007).
  13. Clapham, D. E. TRP channels as cellular sensors. Nature. 426, 517-524 (2003).
  14. Cahalan, M. D. STIMulating store-operated Ca(2+) entry. Nature Cell Biology. 11, 669-677 (2009).
  15. Soboloff, J., Madesh, M., Gill, D. L. Sensing cellular stress through STIM proteins. Nature Chemical Biology. 7, 488-492 (2011).
  16. Erdmann, F., et al. Interaction of calmodulin with Sec61alpha limits Ca2+ leakage from the endoplasmic reticulum. The EMBO Journal. 30, 17-31 (2011).
  17. Schäuble, N., et al. BiP-mediated closing of the Sec61 channel limits Ca(2+) leakage from the ER. The EMBO Journal. , (2012).
  18. Park, M. K., Choi, Y. M., Kang, Y. K., Petersen, O. H. The endoplasmic reticulum as an integrator of multiple dendritic events. The Neuroscientist : a review journal bringing neurobiology, neurology and psychiatry. 14, 68-77 (2008).
  19. Cooney, J. R., Hurlburt, J. L., Selig, D. K., Harris, K. M., Fiala, J. C. Endosomal compartments serve multiple hippocampal dendritic spines from a widespread rather than a local store of recycling membrane. The Journal of Neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 22, 2215-2224 (2002).
  20. Holbro, N., Grunditz, A., Oertner, T. G. Differential distribution of endoplasmic reticulum controls metabotropic signaling and plasticity at hippocampal synapses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 15055-15060 (2009).
  21. Terasaki, M., Slater, N. T., Fein, A., Schmidek, A., Reese, T. S. Continuous network of endoplasmic reticulum in cerebellar Purkinje neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 7510-7514 (1994).
  22. Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. Calcium imaging of cortical neurons using Fura-2 AM. J. Vis. Exp. (23), e1067 (2009).
  23. Lang, S., Schäuble, N., Cavalie, A., Zimmermann, R. Live cell calcium imaging combined with siRNA mediated gene silencing identifies Ca(2)(+) leak channels in the ER membrane and their regulatory mechanisms. J. Vis. Exp. (53), e2730 (2011).
  24. Rudolf, R., Mongillo, M., Rizzuto, R., Pozzan, T. Looking forward to seeing calcium. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 4, 579-586 (2003).
  25. Mank, M., Griesbeck, O. Genetically encoded calcium indicators. Chemical Reviews. 108, 1550-1564 (2008).
  26. Miyawaki, A., et al. Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin. Nature. 388, 882-887 (1997).
  27. Montero, M., et al. Monitoring dynamic changes in free Ca2+ concentration in the endoplasmic reticulum of intact cells. The EMBO Journal. 14, 5467-5475 (1995).
  28. Griesbeck, O., Baird, G. S., Campbell, R. E., Zacharias, D. A., Tsien, R. Y. Reducing the environmental sensitivity of yellow fluorescent protein. Mechanism and applications. The Journal of Biological Chemistry. 276, 29188-29194 (2001).
  29. Ishii, K., Hirose, K., Iino, M. Ca2+ shuttling between endoplasmic reticulum and mitochondria underlying Ca2+ oscillations. EMBO Reports. 7, 390-396 (2006).
  30. Palmer, A. E., Jin, C., Reed, J. C., Tsien, R. Y. Bcl-2-mediated alterations in endoplasmic reticulum Ca2+ analyzed with an improved genetically encoded fluorescent sensor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 17404-17409 (2004).
  31. Hofer, A. M., Machen, T. E. Technique for in situ measurement of calcium in intracellular inositol 1,4,5-trisphosphate-sensitive stores using the fluorescent indicator mag-fura-2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 2598-2602 (1993).
  32. Solovyova, N., Verkhratsky, A. Monitoring of free calcium in the neuronal endoplasmic reticulum: an overview of modern approaches. Journal of Neuroscience Methods. 122, 1-12 (2002).
  33. Solovyova, N., Veselovsky, N., Toescu, E. C., Verkhratsky, A. Ca(2+) dynamics in the lumen of the endoplasmic reticulum in sensory neurons: direct visualization of Ca(2+)-induced Ca(2+) release triggered by physiological Ca(2+) entry. The EMBO Journal. 21, 622-630 (2002).
  34. Rehberg, M., Lepier, A., Solchenberger, B., Osten, P., Blum, R. A new non-disruptive strategy to target calcium indicator dyes to the endoplasmic reticulum. Cell Calcium. 44, 386-399 (2008).
  35. Blum, R., Verkhratsky, A., Petersen, O. H. Calcium imaging of intracellular organelles: endoplasmic reticulum. 43, Humana Press. (2010).
  36. Shaner, N. C., et al. Improving the photostability of bright monomeric orange and red fluorescent proteins. Nature Methods. 5, 545-551 (2008).
  37. Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors. Science. 295, 868-872 (2002).
  38. Zufferey, R., et al. Self-inactivating lentivirus vector for safe and efficient in vivo gene delivery. Journal of Virology. 72, 9873-9880 (1998).
  39. Zufferey, R., Nagy, D., Mandel, R. J., Naldini, L., Trono, D. Multiply attenuated lentiviral vector achieves efficient gene delivery in vivo. Nature Biotechnology. 15, 871-875 (1997).
  40. Li, D., Herault, K., Oheim, M., Ropert, N. FM dyes enter via a store-operated calcium channel and modify calcium signaling of cultured astrocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 21960-21965 (2009).
  41. Blum, R., Petersen, O. H., Verkhratsky, A. Calcium measurement methods. Verkhratsky, A., Petersen, O. H. Vol. Neuromethods 43 (Springer protocols), Humana Press. 147-167 (2010).
  42. Tian, L., et al. Selective esterase-ester pair for targeting small molecules with cellular specificity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 4756-4761 (2012).
  43. Samtleben, S., Blum, R. Improved vectors for direct ER calcium imaging with targeted-estersase induced dye loading. , In preparation (2012).

Tags

Клеточной биологии выпуск 75 нейробиологии неврологии молекулярной биологии биохимии биомедицинской инженерии биотехнологии вирусологии медицины анатомии физиологии хирургии эндоплазматическая сеть ER сигнализации кальция кальций магазине Кальций изображений кальция показатель метаботропный сигнализации Калифорния Нейроны клетки мышь животной модели культура клеток индуцированных целевых эстераза красителем работы с изображениями
Прямое изображение ЭР кальция с целевыми-эстеразы Индуцированные красителем (TED)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Samtleben, S., Jaepel, J., Fecher,… More

Samtleben, S., Jaepel, J., Fecher, C., Andreska, T., Rehberg, M., Blum, R. Direct Imaging of ER Calcium with Targeted-Esterase Induced Dye Loading (TED). J. Vis. Exp. (75), e50317, doi:10.3791/50317 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter