Un sencillo método de intubación ratón de pulmón

Summary

Este artículo describe un método striaghforward y eficiente de intubación de ratones para las mediciones de la función pulmonar o la instilación pulmonar, que permite a los ratones para recuperar y se estudió en tiempos posteriores. El procedimiento consiste en una fuente de luz de fibra óptica de bajo costo que ilumina directamente la tráquea.

Abstract

Un procedimiento sencillo para intubar ratones para las mediciones de la función pulmonar tendría varias ventajas en estudios longitudinales con un número limitado de animales o caro. Una de las razones por las que esto no se hace de forma más rutinaria es que es relativamente difícil, a pesar de existir varios estudios publicados que describen la manera de lograrlo. En este trabajo se demuestra un procedimiento que elimina uno de los principales obstáculos asociados con este intubación, que de visualizar la tráquea durante todo el tiempo de intubación. El enfoque utiliza una fuente de 0,5 mm de luz de fibra óptica que sirve como un introductor para dirigir la cánula de intubación en la tráquea ratón. Se demuestra que es posible utilizar este procedimiento para medir la mecánica pulmonar en ratones individuales durante un transcurso de tiempo de al menos varias semanas. La técnica se puede configurar con relativamente poco gasto y experiencia, y que pueden ser rutinariamente a cabo con relativamente poca formación. Esto debería MAKE Es posible para cualquier laboratorio para llevar a cabo de forma rutinaria este intubación, lo que permite estudios longitudinales en ratones individuales, minimizando de este modo el número de ratones necesarios y aumentar el poder estadístico mediante el uso de cada ratón como su propio control.

Introduction

En 1999, Brown et al. Publicado un artículo que describe un método para la intubación de la pulmón de ratón ^1. Dicha técnica tiene una utilidad considerable en hacer la función de repetición pulmonar o lavado broncoalveolar de ratones individuales en estudios longitudinales ^2. Dado que el papel original, ha habido varios otros papeles que han descrito diferentes enfoques para la intubación ratón ^3-9. Aunque todos estos métodos se pueden utilizar con éxito, por lo general requieren una formación considerable o coste. Uno de los principales problemas con la intubación es tal que cuando se acerca la cánula de intubación se acerca a la inserción tráquea pendiente, la propia cánula bloquea la luz y por lo tanto la visualización de donde tiene que ir. Por lo tanto, la inserción queda ciego en el momento más crítico. En este trabajo se muestra cómo eliminar sencilla y económica a este problema de visualización, lo que garantiza la intubación exitosa con relativamente poca formación oexperiencia.

Protocol

1. Preparación para el procedimiento

Primero hay que obtener y preparar los siguientes elementos:

1. La cánula. Para la intubación de 20-35 g ratones, se utiliza un 1 o 1,5 pulgadas de largo, calibre 20, catéter IV (BD Insylte, Sparks, MD o Optiva Jelco, Carlsbad, CA). Un catéter estéril nuevo se puede utilizar para cada ratón, pero catéteres también se pueden reutilizar después de la esterilización por inmersión en etanol al 70% durante la noche. Aunque ni la faringe ni tráquea del ratón es estéril procedimientos de limpieza adecuados, incluido el uso de guantes estériles e instrumentos, deben ser seguidas.
2. El cable de fibra óptica. Utilizamos ≈ 70 cm de cable de 0,5 mm Salida de Edmund Optics, pero la longitud no es crítica. Es importante asegurarse de que la fibra tiene su borde alisado, ya que después de cortar el cable a la longitud con una navaja de afeitar, el borde se deja relativamente agudo, y no se necesita mucho esfuerzo para perforar la pared traqueal. Sin embargo, is muy fácil para suavizar este borde sujetando la fibra de alrededor de 2 cm desde el extremo y luego hacer pequeños círculos durante unos segundos con los bordes de la punta tocando un trozo de papel de lija de grano 1.000 (véase la demostración en el vídeo y la Figura 1 de los Macdonald, et al. ^10). El otro extremo se inserta a través de un tapón de goma. Esto se logra más fácilmente por primera empujando una aguja de calibre 18-a través del tapón, la inserción de la fibra óptica a través del orificio de aguja, a continuación, retirar la aguja. El tapón de goma está conectado a una fuente de luz halógena de 150 vatios (por ejemplo NCL-150, Volpi EE.UU., o cualquier otra fuente de luz o, incluso menos de 150 vatios). Es importante asegurarse de utilizar un tapón de goma de silicona (o otro material resistente al calor), ya que el corcho o caucho ordinario puede quemar cuando se encuentra tan cerca de la fuente de luz caliente.

2. Realización de la intubación

1. Véanse las Figuras 1 y 2. Inserte cable de fibra óptica tediante un pequeño trozo de tubo de goma de silicona (≈ 0,8 mm x 4 mm OD, Cole-Palmer, EW-96410-13). Ate este tubo de goma bastante fuerte, al tiempo que permite el cable de fibra óptica para ajustar. Inserción del tubo de silicona cómodamente en el extremo de la cánula Luer fija la posición del cable de fibra óptica del interior de la cánula. Ajustar la posición del cable de fibra óptica para que se extienda a través de la cánula ≈ 4 mm por delante de la punta de la cánula.
2. Coloque el ratón anestesiado en un soporte vertical, suspendida por sus incisivos superiores (Figura 3). La mayoría de los investigadores a encontrar la mejor visualización con el lado ventral del ratón frente a sí mismos. Muy suavemente tire de la lengua y sostenga con el pulgar y el índice. El dedo medio se coloca entre el cuello y el soporte de plástico. La tracción sobre la lengüeta con el dedo índice y el pulgar se utiliza para abrir la boca, y para enderezar el camino intubación, el ángulo de la cabeza se ajusta con el dedo medio detrás del cuellose muestra en la Figura 3.
3. Con el cable de fibra óptica como fuente de luz y el introductor, empújelo a través de las cuerdas vocales visualizadas. Si los cables no están visibles, tire suavemente más duro en la lengua con el dedo medio como apoyo. Una vez introducido, avanzar la cánula ≈ 5 mm más allá. Luego, con mucho cuidado de no mover la cánula, retire el cable de fibra óptica. Lie el ratón hacia abajo y asegurar la cánula con un trozo de cinta y compatible con el cubo de la cánula en un trozo de plastilina (arcilla de modelado), como se muestra en la Figura 4.
4. El procedimiento del paso 3 no puede ser fácilmente enseñado o incluso demostrado, ya que es una operación en solitario. Sin embargo, por los ajustes sutiles de la tracción en la lengua y el apoyo detrás de la cabeza de casi todos los que tratan esto pronto encontrar la manera correcta de colocar el ratón para visualizar las cuerdas vocales.

Representative Results

Como una evaluación del método, hemos utilizado cuatro 20 semanas de edad BALB / c macho ratones con peso promedio (± SEM) de 27,7 ± 0,40 g. Se estudiaron en cinco semanas consecutivas, donde la resistencia pulmonar se midió utilizando un sistema como se ha descrito previamente ^11. Cada ratón se anestesió con ketamina (100 mg / g BW) y xilazina (15 mg / g de peso corporal) en solución salina mediante inyección IP. Ellos fueron intubados entonces como se describe anteriormente. Si hay alguna duda sobre si la cánula está en la tráquea y el esófago no, esto puede ser validado utilizando un espejo dental pequeño. Mantener el espejo en un congelador, y cuando sea necesario en lugar delantera del cubo Luer del catéter. Si el catéter está en la tráquea, el aire exhalado será formar un condensado visible en el espejo.

Después de la intubación, se conectan entonces a los ratones para el ventilador y la resistencia pulmonar medido Los ratones fueron ventilados con una tasa de 2 Hz y volumen corriente de 0,2 ml, y resistencia respiratoria tancia se midió por el método de oclusión inspiratoria como se ha descrito previamente ^11. Figura 5 muestra 5 mediciones semanales en cada uno de los 4 ratones. La reproducibilidad es excelente, mostrando que, al menos a intervalos semanales, no hay efecto de la medición anterior. Esto es consistente con informes anteriores evaluaciones semanales de la mecánica y los perfiles de BAL células individuales en ratones BALB / c con un procedimiento más difícil y potencialmente traumático ^2.

Figura 1. Elementos de imagen que muestran utilizado para la intubación. El cable de fibra óptica se muestra insertado en un tapón de caucho de silicona, con un pequeño trozo de tubo de goma de silicona atado cerca del extremo opuesto. Un tapón de caucho de silicona está unida a la fuente de luz como se muestra en la Figura 2.

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Figura 2. Imagen que muestra el tapón de goma conectado a una fuente de luz con otro extremo del cable de fibra óptica se inserta a través de la cánula de intubación. Un soporte simple soporte para sujetar el ratón durante la intubación también se muestra a la izquierda.

Figura 3. Dos perspectivas que muestran la posición del ratón preparado para la intubación.

Figura 4. Esta figura muestra un ratón intubado listo para la ventilación. La cinta alrededor de la boca ayuda a mantener la cánula se mueva. Un pequeño trozo de plastilina (arcilla de modelar) proporciona un descanso conveniente para asegurar el cubo de la cánula para la conexión al ventilador.

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Figura 5. La resistencia pulmonar de cada uno de 4 ratones (en diferentes colores) medida a 5 intervalos semanales.

Figura 6. Se muestra un registro gráfico de la presión de las vías respiratorias en un ratón intubado después de las inyecciones de 0,5, 0,75 y 1 ml. Cada volumen se mantuvo durante 20-40 segundos, y luego liberado antes de entonces la inflación siguiente. Aunque puede haber una fuga muy lento después de la recuperación de relajación de la tensión, esto tendría un efecto insignificante sobre la ventilación normal o la evaluación de la dinámica de medición de la función pulmonar. Haga clic aquí para ampliar la cifra .

Discussion

El procedimiento descrito aquí tiene varias ventajas. En primer lugar el aparato es sencillo y relativamente barato .. La fabricación del aparato no requiere ninguna herramienta especial o equipo costoso. El uso de un catéter que presenta también es la fuente de luz significa que uno nunca pierde de vista la apertura de la tráquea como el introductor se acerca a la apertura de la tráquea. El uso de un introductor de 0,5 mm también sirve para minimizar el trauma que podría ocurrir con una inserción inicial de una cánula más grande. Observamos aquí que una sonda óptica similar está disponible de un proveedor comercial (Braintree Scientific, Braintree, MA). Su dispositivo utiliza una fuente de alimentación de la batería de luz y fibra óptica.

En el presente trabajo, hemos probado con el procedimiento de repetición de la medición de la mecánica pulmonar, pero la intubación tal podría fácilmente ser usado para infundir químicos o células en el pulmón, como se ha descrito para la entrega repetida de LPS ^12. Además, unainforme previo con un procedimiento de intubación más primitivo describe la capacidad de hacer BAL repetida en ratones individuales ^2, y esto sería mucho más logra simplemente con el enfoque de intubación nuevo.

En la práctica, el método descrito aquí ha sido fácil de enseñar a los becarios, estudiantes y técnicos que nunca habían intentado intubación. De hecho, durante las sesiones de formación en grupo, algunos de los estudiantes se convierten en lo suficientemente competente para enseñar a continuación, algunos de los otros estudiantes que aún no la había probado. Este método por lo tanto tiene una ventaja considerable ya que minimiza el número de ratones necesarios para la práctica y debe permitir un daño mínimo en estudios repetidos.

Al hacer la intubación, hay varias cuestiones prácticas que deben ser mencionados. Es importante ser tan suave como sea posible con la retracción de la lengua en la apertura inicial de la boca. Si se utilizan pinzas sin protección es fácil de lesionar la lengua, y esto puede LEAd a la muerte del ratón. En primera aprendizaje de cómo hacer la intubación, lo más importante es el uso del dedo detrás del cuello para ajustar el ángulo de la cabeza para permitir la visualización de la apertura de la tráquea. Cuando se hace correctamente, con una tracción suficiente en la lengua, las cuerdas vocales puede ser visto fácilmente. Este es el paso inicial de visualización que usualmente requiere más tiempo, ya que una vez que la apertura de la tráquea se ve, es relativamente fácil de insertar el cable de fibra y el catéter intravenoso. Inicialmente si hay un problema con esta visualización, el aprendiz a menudo no se tira de la lengüeta con la suficiente fuerza. El aumento de esta fuerza ligeramente enderezará la ruta de visualización para las cuerdas vocales puede ser visto. Hamacher, et al., Se describe un sistema de intubación único con ⁴ visualización microscópica. Su vídeo en línea de este intubación es excelente y muy instructivo, aunque los medios de posicionamiento de la cabeza y el cuello no está del todo claro a partir de la video y figura. Si bien el sistema que describe parece funcionar muy eficientemente, se requiere un microscopio dedicado. Usando el sistema y procedimiento se describe, las cuerdas vocales y apertura de la tráquea puede ser visto a simple vista. En nuestra descripción original de este método ^10, se describe un procedimiento para añadir un cono de la cánula de intubación. Esto cuñas cónicas en la faringe ratón estrecho e impide que la cánula que se inserta demasiado profundamente. Hemos encontrado que esta cuña es útil en la enseñanza a los estudiantes el procedimiento, ya que es muy fácil de insertar la cánula a la carina o más allá de, posiblemente, penetrando a través de una pared de vía respiratoria. Instrucciones simples para fabricar la cuña se puede encontrar en ese documento. Sin embargo, una vez que alguien aprende el procedimiento suficientemente bien y dónde colocar la cánula, esta adaptación ya no es necesaria.

Por último, hay que señalar que sólo hemos probado este procedimiento con la cánula 20 g en los ratones adultos jóvenes de unas pocas cepas. En esta situación, se ha validado que la tráquea y las cuerdas vocales puede proporcionar un sellado muy bueno alrededor de la cánula con presiones de ventilación normales, es decir, hay un mínimo de fugas de aire fuera de los pulmones con ventilación mecánica. Figura 6 muestra los resultados de canulación en un sobre ratón C57BL / 6, donde 3 bolos crecientes de aire (0,5, 0,75, y ml 1) se utiliza para inflar los pulmones. Es evidente a partir de esta figura que fugas de presión son mínimas a una presión de vía aérea de al menos 15 cm de H ₂ O. Sin embargo, si se utiliza sustancialmente ratones jóvenes o mayores, o ratones de cepas con una anatomía pulmonar diferente, entonces sería prudente para confirmar que no hay fugas mínimas. Si los hay, entonces el procedimiento puede requerir el uso de una cánula de tamaño diferente.

En resumen, el procedimiento de intubación describir aquí es barato de fabricar y fácil de usar, y debe permitir la mayoría de los investigadores y los técnicos de laboratorio para aprender rápidamente con éxitointubar ratones con relativamente poca experiencia.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Intubation cannula	BD Insylte, Sparks, MD or Jelco Optiva, Carlsbad, CA		1-in.-long, 20-gauge intravenous (IV) catheter
Fiber-optic cable	Edmund Optics, Barrington, NJ	#NT02-542	Approximately 2-ft length of 0.5-mm optical fiber (Communication grade plastic fiber). The edge of the fiber end that is inserted into the trachea should be gently rounded by holding the fiber ≈2 cm from the end and then making small circles while dragging the tip for a few seconds on 1,000-grit emory paper.
Light Source	Volpi	NCL-150	Although we use a 150-W halogen light source, any equivalent light source, even with much lower wattage can be used.
Aluminum tube			One inch O.D., with 1/16 inch wall. This may need to be change to fit whichever light source is used.
Rubber stopper			A #4 rubber stopper fits the 1 inch tube.
Small silicone rubber tube	Cole-Palmer	EW-96410-13	A ≈1.5 cm piece of silicone rubber tubing (0.8 inner diameter, 4 mm outer diameter)
Angled support stand			Ours is constucted from plexiglass, but any material to which a thread or wire can be affixed to hold the mouse at an almost vertical angle can be use.