Une méthode simple d'intubation poumon de souris

Summary

Le présent document décrit une méthode striaghforward et efficace de l'intubation des souris pour les mesures de la fonction pulmonaire ou l'instillation pulmonaire, qui permet aux souris de récupérer et être étudié à temps postérieurs. La procédure implique une source de lumière à fibre optique peu coûteux qui éclaire directement la trachée.

Abstract

Une procédure simple pour intuber souris pour les mesures de la fonction pulmonaire aurait plusieurs avantages dans les études longitudinales avec un nombre limité d'animaux ou coûteux. Une des raisons pour lesquelles cela n'est pas fait de façon plus routinière, c'est qu'il est relativement difficile, malgré l'existence de plusieurs études publiées qui décrivent les moyens pour y parvenir. Dans cet article, nous démontrons une procédure qui élimine l'un des obstacles majeurs associés à ce intubation, qui permet de visualiser la trachée pendant toute la durée de l'intubation. La méthode utilise une source de lumière à fibre optique 0,5 mm qui sert d'introduction pour diriger la canule d'intubation dans la trachée de souris. Nous montrons qu'il est possible d'utiliser cette procédure pour mesurer la mécanique du poumon chez les souris individuelles sur un parcours de temps d'au moins plusieurs semaines. La technique peut être mis en place avec relativement peu de frais et d'expertise, et il peut être systématiquement réalisé avec relativement peu de formation. Cela devrait make il possible pour tout laboratoire réalise ce intubation, ce qui permet des études longitudinales chez des souris individuelles, ce qui réduit le nombre de souris nécessaires et en augmentant la puissance statistique en utilisant chaque souris comme son propre témoin.

Introduction

En 1999, Brown et al. Publié un article décrivant une méthode pour l'intubation du poumon ¹ souris. Une telle technique a une utilité considérable en faisant fonction de répétition ou lavage broncho-alvéolaire pulmonaire chez la souris individuelles dans les études longitudinales ^2. Depuis que le papier d'origine, il ya eu plusieurs autres documents qui ont décrit les différentes approches à ^3-9 intubation souris. Bien que toutes ces méthodes peuvent être utilisées avec succès, ils exigent habituellement une formation considérable ou de coût. Un des principaux problèmes avec intubation par exemple, c'est que l'approche de la canule d'intubation se rapproche de la trachée attente d'insertion, la canule elle-même bloque la lumière et donc la visualisation de l'endroit où il doit aller. Ainsi, l'insertion devient aveugle au moment le plus critique. Dans cet article, nous montrons comment simple et peu coûteuse d'éliminer ce problème de visualisation, assurant ainsi une intubation réussie avec relativement peu de formation ouexpérience.

Protocol

1. Préparation de la procédure

Il faut d'abord obtenir et préparer les éléments suivants:

1. La canule. Pour l'intubation des souris g 20-35, nous utilisons un pouce 1 ou 1,5 de long, calibre 20 IV cathéter (BD Insylte, Sparks, MD ou Jelco Optiva, Carlsbad, CA). Un nouveau cathéter stérile peut être utilisé pour chaque souris, mais cathéters peut également être réutilisé après stérilisation par immersion dans de l'éthanol 70% pendant une nuit. Bien que ni le pharynx, ni trachée de la souris est stériles procédures propreté appropriées, y compris l'utilisation de gants stériles et des instruments, doivent être suivies.
2. Le câble à fibres optiques. Nous utilisons ≈ 70 cm de câble de 0,5 mm optique d'Edmund Optics, mais la longueur n'est pas critique. Il est important de s'assurer que la fibre a son bord lissé, car après avoir coupé le câble à la longueur avec une lame de rasoir, le bord gauche est relativement forte, et il ne prend pas beaucoup d'effort pour percer la paroi de la trachée. Cependant, il iest très facile à lisser ce bord en maintenant la fibre d'environ 2 cm de l'extrémité, puis faisant des petits cercles pendant quelques secondes avec les bords de la pointe de toucher un morceau de papier abrasif 1000 (voir la démonstration dans la vidéo et la figure 1 de Macdonald et al. ^10). L'autre extrémité est insérée à travers un bouchon de caoutchouc. Le plus simple est d'abord faire pousser une aiguille de calibre 18 à travers le bouchon, insérer la fibre optique à travers le trou d'aiguille, puis retirer l'aiguille. Le bouchon en caoutchouc est relié à une source de lumière halogène de 150 watts (par exemple NCL-150, Volpi USA, ou toute autre source de lumière ou même moins de 150 watts). Il est important de s'assurer d'utiliser un bouchon en caoutchouc de silicone (ou autre matériau résistant à la chaleur d'autres), depuis caoutchouc ordinaire ou en liège peut brûler lorsqu'il est situé si près de la source chaude lumière.

2. Exécution de l'intubation

1. Voir les figures 1 et 2. Insérez câble à fibre optique trâce à un court morceau de tuyau en caoutchouc de silicone (≈ 0,8 mm ID x 4 mm de diamètre, Cole-Palmer, EW-96410-13). Attachez ce tube en caoutchouc assez serré, tout en permettant au câble à fibre optique à régler. Insérer le tube de silicone sans jeu dans l'extrémité de la canule Luer fixe la position du câble à fibres optiques à l'intérieur de la canule. Ajuster la position du câble à fibres optiques de la sorte qu'il s'étend à travers la canule ≈ 4 mm en avant de la pointe de la canule.
2. Placez la souris anesthésiée sur un support vertical, suspendu par ses incisives supérieures (figure 3). La plupart des chercheurs trouver la meilleure visualisation avec la face ventrale de la souris se faisant face. Très tirez doucement sur la langue et tenir avec le pouce et l'index. Le doigt du milieu est placé entre le col et le support en plastique. Traction sur la languette avec le pouce et l'index est utilisé pour ouvrir la bouche, et de redresser le chemin intubation, l'angle de la tête est réglée avec le doigt du milieu derrière le coureprésenté sur la figure 3.
3. En utilisant le câble de fibre optique en tant que source de lumière et d'introduction, le pousser à travers les cordes vocales visualisées. Si les cordons ne sont pas visibles, tirez doucement sur la langue plus difficile avec le doigt du milieu comme support. Lorsqu'elle est insérée, faire avancer la canule ≈ 5 mm de plus. Puis, en faisant très attention de ne pas déplacer la canule, retirer le câble de fibre optique. Allongez la souris vers le bas et fixer la canule avec un morceau de ruban adhésif et de soutenir le moyeu de canule sur un morceau de pâte à modeler (pâte à modeler), comme le montre la figure 4.
4. La procédure de l'étape 3 ne peut pas être facilement enseigné ou même montré, car il s'agit d'une opération en solo. Cependant, par des ajustements subtils de la traction sur la languette et le soutien derrière la tête presque tous ceux qui tentent ce bientôt trouver la bonne façon de positionner la souris pour visualiser les cordes vocales.

Representative Results

Comme une évaluation de la méthode, nous avons utilisé quatre mâles âgés de 20 semaines BALB / c avec un poids moyen (± ET) de 27,7 ± 0,40 g. Ils ont été étudiés sur cinq semaines consécutives, où la résistance pulmonaire a été mesurée en utilisant un système tel que décrit précédemment ^11. Chaque souris a été anesthésiée avec de la kétamine (100 mg / g de poids) et de xylazine (15 mg / g de poids) dans une solution saline par injection IP. Ils ont ensuite été intubé comme décrit ci-dessus. S'il n'y a aucun doute que la canule est dans la trachée et l'œsophage pas, cela peut être validée à l'aide d'un petit miroir dentaire. Gardez le miroir dans un congélateur, et lorsque cela est nécessaire dans l'avant du moyeu Luer du cathéter. Si le cathéter est dans la trachée, l'air expiré sera former un condensat visible sur le miroir.

Après l'intubation, nous avons ensuite connecté la souris sur le ventilateur et la résistance pulmonaire mesurée Les souris ont été ventilés avec un taux de 2 Hz et le volume de marée de 0,2 ml et résistance des voies respiratoires tance a été mesurée par la méthode d'occlusion inspiratoire comme décrit précédemment ^11. La figure 5 montre 5 mesures hebdomadaires dans chacune des 4 souris. La reproductibilité est excellente, montrant que, au moins une semaine d'intervalle, il n'y a pas d'effet de la mesure précédente. Ceci est cohérent avec les évaluations hebdomadaires précédemment rapportés de la mécanique et des profils de cellules BAL dans chaque souris BALB / c avec une procédure plus difficile et potentiellement traumatisante ^2.

Figure 1. Éléments graphiques montrant utilisée pour l'intubation. Le câble à fibre optique est représenté inséré dans un bouchon de caoutchouc de silicone, avec un petit morceau de tube en caoutchouc de silicone lié à proximité de l'extrémité opposée. Un bouchon en caoutchouc de silicone est fixé à la source lumineuse comme le montre la figure 2.

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Figure 2. Image montrant un bouchon en caoutchouc relié à une source de lumière avec autre extrémité du câble à fibre optique inséré dans la canule d'intubation. Un support simple stand à tenir la souris lors de l'intubation est également indiqué sur la gauche.

Figure 3. Deux points de vue montrant la position de la souris préparé pour l'intubation.

Figure 4. Cette figure montre une souris intubé prêt pour la ventilation. La bande autour de la bouche permet de maintenir la canule de se déplacer. Un petit morceau de pâte à modeler (pâte à modeler) fournit un repos convenable pour fixer le moyeu de canule pour le raccordement au ventilateur.

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Figure 5. Résistance pulmonaire de chacun des 4 souris (de différentes couleurs) mesurée à intervalles de 5 semaines.

Figure 6. Montré est un enregistrement graphique de la pression des voies aériennes chez une souris intubé après des injections de 0,5, 0,75 et 1 ml. Chaque volume a été détenu pendant 20-40 sec, puis libéré avant cette inflation prochaine. Bien qu'il puisse y avoir une fuite très lente après la reprise de relaxation des contraintes, ce qui aurait un effet négligeable sur la ventilation normale ou l'évaluation des mesures dynamiques de la fonction pulmonaire. Cliquez ici pour agrandir la figure .

Discussion

La procédure décrite ici présente plusieurs avantages. D'abord l'appareil est simple et relativement peu coûteux .. La fabrication de l'appareil ne nécessite pas d'outils spéciaux ou de l'équipement coûteux. L'utilisation d'un cathéter introduit qui est également la source de lumière signifie que l'on ne perd jamais de vue l'ouverture de la trachée comme l'introducteur s'approche de l'ouverture trachéale. L'utilisation d'un dispositif d'introduction 0,5 mm permet également de minimiser le traumatisme qui pourrait se produire avec une insertion initiale d'une plus grande canule. Nous notons ici que d'une sonde optique similaire est disponible auprès d'un fournisseur commercial (Braintree scientifique, Boston, MA). Leur dispositif utilise une source lumineuse à piles et fibre optique.

Dans le présent travail, nous avons testé la procédure avec mesure répétée de la mécanique du poumon, mais l'intubation telle pourrait tout aussi bien être utilisé pour inculquer des produits chimiques ou des cellules dans les poumons, comme cela a été décrit pour la livraison répétée de LPS ^12. En outre, unrapport préalable à une procédure d'intubation plus primitif décrit la capacité de faire BAL répétée chez la souris individuelles ^2, et ce serait beaucoup plus simple réalisé avec l'approche nouvelle intubation.

Dans la pratique, la méthode décrite ici a été facile à enseigner aux stagiaires, étudiants et techniciens qui n'avaient jamais tenté de l'intubation. En fait, au cours des séances de formation en groupe, certains élèves deviennent suffisamment compétents pour ensuite enseigner quelques-uns des autres étudiants qui n'avaient pas encore essayé. Cette méthode a donc un avantage considérable car elle minimise le nombre de souris nécessaires à la pratique et devrait permettre un minimum de dommages dans les études répétées.

En faisant l'intubation, il ya plusieurs questions pratiques qui doivent être mentionnés. Il est important d'être aussi douce que possible avec la rétraction de la langue dans l'ouverture initiale de la bouche. Si forceps non protégés sont utilisés, il est facile de blesser la langue, et cela peut Lead à la mort de la souris. Dans le premier d'apprendre à faire de l'intubation, la chose la plus importante est l'utilisation du doigt derrière le cou pour ajuster l'angle de la tête pour permettre la visualisation de l'ouverture de la trachée. Une fois fait correctement, avec une traction suffisante sur la langue, les cordes vocales peut facilement être vu. C'est cette étape de visualisation initiale qui nécessite généralement le plus de temps, car une fois l'ouverture de la trachée est vu, il est relativement simple d'insérer le câble de fibre et un cathéter intraveineux. Initialement s'il ya un problème avec cette visualisation, le stagiaire est souvent pas en tirant sur la languette avec suffisamment de force. L'augmentation de cette attraction se redressent légèrement le chemin de la visualisation de sorte que les cordes vocales peuvent être vus. Hamacher, et al., Décrit un système unique de l'intubation avec ⁴ visualisation microscopique. Leur vidéo en ligne de ce intubation est excellent et très instructif, bien que les moyens de positionnement de la tête et du cou n'est pas tout à fait claire de la video et la figure. Bien que le système qu'ils décrivent semble fonctionner très efficacement, il faut un microscope dédié. L'utilisation du système et de la procédure que nous décrivons, des cordes vocales et d'ouverture trachéale peut être vu à l'œil nu. Dans notre description originale de cette méthode ^10, nous avons décrit une procédure pour ajouter un cône à la canule d'intubation. Ce cales coniques dans le pharynx étroit de la souris et empêche la canule d'être inséré trop profondément. Nous avons constaté que ce coin est utile pour enseigner aux élèves la procédure, car il est très facile d'insérer la canule de la carène ou au-delà, peut-être pénétrant à travers une paroi bronchique. Des instructions simples à fabriquer la cale peut être trouvé dans ce document. Cependant, une fois que quelqu'un apprend la procédure suffisamment bien et où positionner la canule, cette adaptation n'est plus nécessaire.

Enfin, il faut noter que nous avons seulement testé cette procédure avec la canule 20 g chez les souris jeunes adultes de quelques souches. Dans cette situation, nous avons validé que la trachée et les cordes vocales peuvent fournir une très bonne étanchéité autour de la canule avec des pressions de ventilation normales, c'est à dire il ya une fuite d'air minimale sur du poumon à la ventilation mécanique. La figure 6 montre les résultats d'une canule sur une souris C57BL / 6, où 3 bols d'air croissantes (0,5, 0,75 et 1 ml) ont été utilisés pour gonfler les poumons. Il est clair d'après cette figure que les fuites sont minimes pression à une pression des voies aériennes d'au moins 15 cmH ₂ O. Cependant, si l'on utilise essentiellement des souris jeunes ou plus âgés, ou des souris de souches ayant une anatomie différente du poumon, alors il serait sage de confirmer que les fuites sont minimes. S'il en existe, la procédure peut alors nécessiter l'utilisation d'une canule de taille différente.

En résumé, la procédure d'intubation décrire ici est peu coûteux à fabriquer et simple à utiliser, et il devrait permettre à la plupart des chercheurs et des techniciens de laboratoire pour apprendre rapidement à succèsintuber souris avec relativement peu d'expérience.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Intubation cannula	BD Insylte, Sparks, MD or Jelco Optiva, Carlsbad, CA		1-in.-long, 20-gauge intravenous (IV) catheter
Fiber-optic cable	Edmund Optics, Barrington, NJ	#NT02-542	Approximately 2-ft length of 0.5-mm optical fiber (Communication grade plastic fiber). The edge of the fiber end that is inserted into the trachea should be gently rounded by holding the fiber ≈2 cm from the end and then making small circles while dragging the tip for a few seconds on 1,000-grit emory paper.
Light Source	Volpi	NCL-150	Although we use a 150-W halogen light source, any equivalent light source, even with much lower wattage can be used.
Aluminum tube			One inch O.D., with 1/16 inch wall. This may need to be change to fit whichever light source is used.
Rubber stopper			A #4 rubber stopper fits the 1 inch tube.
Small silicone rubber tube	Cole-Palmer	EW-96410-13	A ≈1.5 cm piece of silicone rubber tubing (0.8 inner diameter, 4 mm outer diameter)
Angled support stand			Ours is constucted from plexiglass, but any material to which a thread or wire can be affixed to hold the mouse at an almost vertical angle can be use.