Summary
在本协议中，我们展示了一个高效和具有成本效益的小型蛋白质纯化方法，它允许重组蛋白的纯化结合独特的可裂解GST标签和一个小His标签。
Abstract
在酶学测定法的关键蛋白质的体外生化特性的必要的高浓度的感兴趣的纯化蛋白。蛋白质纯化方案应结合效率，简单性和成本效益1。在这里，我们描述了GST-他的方法作为一种新的小型的亲和纯化系统的重组蛋白，根据N-末端谷胱甘肽琼脂糖标签（GST）的2,3和C-末端10xHis标签4，它们都稠合到感兴趣的蛋白质。后者构建体被用于产生杆状病毒的Sf9对感染细胞中的蛋白质表达5的感染。消费税是用来确保净化效率相当长的标记（29 kDa的）。然而，它可能影响到蛋白质的生理特性。因此，它使用的是断前酶6随后裂解的蛋白。为了确保最大的纯度和去除切割的商品及服务税，我们新增的基础上，比较小His标签的第二亲和纯化步骤。重要的是，我们的技术是基于两个不同的标记侧翼的蛋白质，这是一个有效的工具来除去降解的蛋白质，因此两端，丰富了全长蛋白。这里提出的方法不需要昂贵的仪器设置，诸如FPLC。此外，我们成立氯化镁和ATP清洗以去除热休克蛋白杂质和核酸酶处理，取消污染核酸。总之，两个不同的标记侧翼的组合的N-和C-末端和切割过的标签1的功能，担保感兴趣的高度纯化的和全长蛋白质的回收率。
Introduction
重组蛋白质的纯化是至关重要的，以解决在生物化学的基本问题。蛋白纯化的常规方法类似的离子交换层析和大小排阻层析依赖于目标蛋白的物理性质，例如它的等电点和电荷或大小，分别。后者蛋白质特性是由多种蛋白质，这增加了相当大的常规蛋白质纯化策略污染蛋白的机会共享。这个问题可能会被规避与使用多个纯化柱，这是耗时的。在同一时间，后者的色谱方法需要昂贵的实验装置。亲和标记纯化大力增加目标特异性，因为在大多数的情况下，标签将是唯一的目标蛋白。在最近的研究中，标志或HA-亲和纯化，得到了广泛的使用。
而相比之下，现有的拍摄其中单个标签用于ombinant蛋白质纯化的协议，我们建立两个标签的独特组合。我们的方法是融合GST标签的在N-末端和His-标签在感兴趣的蛋白质的C-末端，用于量和所需蛋白质的纯度之间的最佳比例。的GST是一个长标记（29 kDa）的，这是对纯化的谷胱甘肽琼脂糖珠高效。此外，使用GST保证我们的方法1的成本效益。裂解掉的GST与断前酶（具有识别序列LeuGluValLeuPheGln / GlyPro，导致增加了只有两个氨基酸）的可能性，具有许多优点，例如，这样的策略可避免的生理功能的蛋白质，由于变构阻改变。小的His-tag融合至其它蛋白质末端提供在第二纯化步骤中通过洗涤掉裂解的GST，以及降解的蛋白质和其他增加蛋白质纯度污染物。此外，从GST切换到他的净化步骤柱（TALON树脂）时，协议不需要一个透析步骤。在这样的净化过程常见的污染物是热休克蛋白（HSP）。加入一种培养步骤含MgCl 2和ATP的允许移除这些污染物（ 图1）。
快速蛋白液相色谱（FPLC）和高效液相色谱法（HPLC）是依赖于昂贵的仪器来产生高收益感兴趣的纯化蛋白质的常用技术。我们在座的批次纯化方案，相反，是手动的，不需要昂贵的仪器设置。高产量的蛋白质可以通过扩大的协议达成。在同一时间，用批量纯化方案中，洗脱体积可以提高蛋白质浓度，这是不符合FPLC或HPLC给予调整。
ntent“>此外，在批次GST-他的纯化方案，一个大小范围的〜10-300 kDa的蛋白可被纯化。其中最大的优点是通过以下事实给出，人们可以同时净化几种蛋白质举例来说，两个野生型及其突变体蛋白。所提出的协议的成功完全依赖于目的蛋白质的表达水平和溶解度。Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1。生产重组杆状病毒的
使用Invitrogen的BAC-到-BAC杆状病毒表达系统主要是根据制造商的协议，只有轻微的修改所产生的杆状病毒：
- 修改后pFastBac1矢量（Gibco公司，生活）是创建一个包含GST和他-标签（ 图2）。一个的pET-52b中（+）载体（Novagen）中的多克隆位点（MCS），含有10xHis-标签，插入一个pFastBac1载体的MCS，生成pFastBac1 - 链霉素-10xHis。在PET-52B（+）的MCS序列进行PCR的XbaI和BLPI限制性位点之间的扩增，增加一个BglⅡ限制性位点的5'末端和一个HindIII限制性位点，在3'末端。将PCR产物然后BamHI和pFastBac1的HindIII限制性位点之间克隆，用BamHⅠ和BglⅡ限制性序列的相容性。因为目的是产生一个pFastBac1允许的表达重组蛋白与链霉亲和10xHis-标签中，PET-52B（+）的BamHI限制性位点中没有使用的MCS序列。此外，XbaI限制性位点没有被使用，以避免已经在pFastBac1的MCS和这些同的pET-52b的MCS插入（+）的位点之间发生的限制性位点的冗余。与断前蛋白酶识别位点（LeuGluValLeuPheGln / GlyPro）的GST编码序列插入到pFastBac1-链球菌，10xHis。从质粒pGEX-6P-2（GE Healthcare公司）的GST cDNA序列的PCR扩增用含有NcoI和KpnI限制性位点的引物，5'和3'末端，分别为。 NcoI位点允许添加一个起始密码子，但也是一个丙氨酸的消费税。然后将PCR产物克隆入pFastBac1 - 链霉素-10xHis的NcoⅠ和KpnⅠ限制位点之间，从而导致删除该链霉亲和标签。由此得到的新的融合载体被命名为pFastBac1-GST-10xHis。
- 克隆的cDNA编码公关关注到GST（N端）和His标签（C端）之间的pFastBac-GST-10xHis矢量otein。小心地取出该cDNA的终止密码子，以允许融合的C-末端His-标签。
- 转化大肠大肠杆菌 DH10Bac感受态用重组的pFastBac（在步骤1.2中获得），以产生杆状病毒质粒。允许菌落过夜，在37℃和几个小时在含有Bluo-gal和IPTG（10微克/毫升四环素，50微克/毫升卡那霉素，7微克/毫升庆大霉素，100微克/毫升Bluo-选择平板上生长在30℃下加仑，40微克/毫升IPTG）。
- 挑选和重新划2白色菌落（步骤1.3）在选择平板上，以确认白色表型。
- 接种2毫升的LB含10微克/毫升四环素，50微克/毫升卡那霉素，10微克/毫升的庆大霉素与步骤1.4两个白色菌落，并让他们在搅拌下于37℃生长过夜（250转）
- 为了净化杆粒DNA，沉淀从步骤1.5的细菌，悬浮细胞在300微升的溶液I并加入300微升的溶液II（自Qiagen大量制备试剂盒）。孵育5分钟，在室温下，加入300微升的3M KOAc pH为5.5，并培育在冰上10分钟。离心样品在4℃，最高速度为10分钟。加入800μl异丙醇的上清，孵育冰上10分钟。离心样品15分钟，在4℃，用500μl的70％乙醇洗涤沉淀。让沉淀干燥并在40微升的Tris-EDTA（pH8.0）中在无菌条件下重悬的。该杆粒DNA应保存在4°C。
- 如制造商的方案所述生成杆状病毒。杆状病毒可存放于4℃避光。
2。重组蛋白的表达
- 为了选择最有效的杆状病毒的净化和监测什么时候到达蛋白表达的高峰期，执行迷你感染测定一个s如下：感染2×10 7的Sf9的感染细胞培养在27℃的Grace的媒体（补充了10％FBS和1％P / S）与133微升杆状病毒（1/150）。收集1.5毫升分装，在0，24，48，和72小时后的感染。沉淀细胞并分析感兴趣使用抗标签抗体的蛋白免疫印迹的表达水平。
- 使用最有效的杆状病毒从步骤2.1感染每毫升含1.0×10 6个Sf9细胞在500毫升的介质与1/150病毒和媒体之间的比例的微调。让感染的细胞生长在悬浮液中在27℃和收获细胞时的最大蛋白表达（如上面步骤2.1中确定的）就达到了。沉淀的细胞可以被储存在-80℃直到进一步的使用。
3。可溶性细胞裂解液的制备
以下所有孵育步骤都在4℃下轻微转动。
- 裂解S表达的目的蛋白质在约20毫升的GST结合缓冲液（150 mM氯化钠，1mM EDTA中，0.05％的Triton-X-100，1mM的DTT中PBS1X为250mM的NaCl的最终浓度，以及蛋白酶抑制剂F9细胞混合物（Roche），在冰水浴，DOUNCE的20倍溶液用Dounce匀浆，超声处理3次每次30秒（70％产量），并再次DOUNCE 20倍。
- （可选）。孵育的总细胞裂解物用1mM的MgCl 2和BENZONASE 7核酸酶（2.5单位/毫升）处理30分钟，在4℃以除去DNA或RNA污染。
- 离心机在18,000 rpm离心30分钟，在4°C。保留上清液。
- （可选）。离心取上清液再30分钟18000转，4℃得到一个明确的可溶性裂解物。通过0.2或0.45微米的过滤器传递上清液，以避免堵塞。
4。蛋白对GST结合珠
- 孵育可溶性细胞裂解物用1ml GST珠（预洗涤2次10毫升GST的结合缓冲液）1小时，在4℃下轻轻转动。
评论：培养时间需要根据蛋白质的稳定性和结合效率进行优化。
- 以700rpm的转速快速旋转并除去含有未结合蛋白的上清液（这可以保持用于进一步分析）。与GST洗涤缓冲液洗涤的GST-结合蛋白（ 图3B，泳道1）（GST结合缓冲液用350mM的NaCl的终浓度）。
- 重复步骤4.2倍。在最后一次洗涤，去除尽可能多的上清液越好。
- 1小时孵育用5mM ATP和15mM的MgCl 2的有孔玻璃珠（10毫升GST结合缓冲液）于4℃，以避免热休克蛋白8的非特异性结合。与GST洗涤缓冲液清洗珠三次。
5。商品及服务税的断前卵裂
- 离心GST珠，除去上清液，用P5 BUF洗GST珠FER（50mM的NaHPO 4 pH值为7.0，500 mM氯化钠，10％甘油，0.05％的Triton-X-100，5mM的咪唑）。
- 从3小时到过夜，4℃孵育在小五缓冲区中的GST-珠断前酶（除以消费税珠在100微升的组分，并添加4-8单位的酶（2-4微升）稀释于100微升的P5缓冲区）。
评论：需要断前步骤的孵育时间以根据分子量以及该蛋白质的稳定性得到优化。如果降级观察，这个孵化时间可以在一夜之间被减少到最低限度2小时代替。
- 快速离心并收集上清液。加入100微升P5后重复此步骤两次 缓冲区的珠子，集中所有分数（ 图3B，泳道2）。
注释：剩余珠可用于裂解效率分析（ 图3B
6。蛋白质结合，以TALON金属亲和树脂
- 除以从上面的洗脱分为3个部分1毫升，用100微升爪金属亲和树脂干珠（预洗两次，P5缓冲液）下旋转1小时孵化每个。
评论：分度洗脱几部分增加结合/洗涤效率。
- 用P30缓冲液（含30 mM咪唑的最终浓度P5缓冲液）洗涤树脂5分钟。
- 重复步骤6.2倍，集中在珠在单管。最后一次洗涤之前，除去尽可能多的上清液越好。
评论：这对应于TALON绑定样品（ 图3B，泳道4）。
7。纯化的蛋白质的洗脱
- 下孵育与P5旋转蛋白结合TALON树脂5分钟00缓冲液（含500mM咪唑的最终浓度P5缓冲液）。使用缓冲液和1:1 V / V的珠之间的比（例如，如果你采取了200微升的干珠，你将不得不加入200μlP500的）。重复此步骤两次，并分别保持各洗脱组分（命名为洗脱1（E1），洗脱2（E2）和洗脱3（E3）， 图3B，泳道5-7）。
注释：剩余珠可用于洗脱效率（ 图3B，泳道8）的分析。通常情况下，蛋白质的60-80％被洗脱总共。
- 通过与在SDS-PAGE和染色用考马斯亮蓝（ 图3B）或SYPRO蛋白染色进行可视化的标准BSA浓度装载约20-40微升的每个级分的分析你纯化的蛋白的数量和质量。
评论：感兴趣的蛋白质也可以被救援人员到场检测ughout用抗-GST和抗His抗体（ 图3C）的纯化方法。
8。纯化的蛋白质的存储
- 在4℃下透析针对适当的存储缓冲器中的纯化的蛋白质（ 例如，20毫摩尔Tris乙酸盐pH 8.0，200mM的醋酸钾，10％甘油，1mM EDTA，0.5mM的DTT）在透析过程中，检查纯化的蛋白质的沉淀是重要的。我们通常在搅拌下旋转透析2倍1小时，4℃。
- 使纯化的蛋白质（10-20微升）的小等分试样并冷冻在干冰上30分钟。储存分装于-80°C和避免许多解冻/冻结周期。
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Representative Results
为了说明GST-HIS纯化方案的效率，我们纯化Rec14，一个S。 32.9 kDa的酵母蛋白质。该Rec14 cDNA克隆在我们修改pFastBac1向量允许GST和他-标签的添加在N-和C-末端，分别为（ 图1A）。重组杆状病毒，然后准备并用于感染SF9感染的细胞用于蛋白质表达。可溶性细胞裂解物与GST珠和束缚蛋白裂解与断前蛋白酶的消费税洗脱。所得Rec14-His蛋白是亲和纯化TALON树脂和束缚的蛋白质用含有500mM咪唑的TALON缓冲液中。纯化Rec14-他透析中存储缓冲器并储存在-80℃（ 图1B）。
从昆虫细胞的可溶性和总细胞裂解物感染Rec14重组杆状病毒，或模拟感染的控制，由COOM分析assie蓝染色，使我们能够证实GST-Rec14-His蛋白的表达（ 图3A）。在纯化过程中，许多样品进行了分析，以遵循该方法的效率。这些样品通过考马斯亮蓝染色（ 图3B）的分析显示，在纯化的第一步，GST-Rec14被正确地绑定到GST珠，与〜60kDa的表观分子量是由于该融合Rec14的（32.9 kDa）的与GST（29 kDa的）（泳道1）。的GST的断前切割后，GST-免费Rec14 - 他大约37 kDa的（泳道2）迁移，同时在切割的GST可以可视化的GST珠（泳道3，约25 kDa的）。尽管免GST Rec14一部分仍然保持结合到GST珠（泳道3），在显着富集Rec14 - 他达到了（泳道2，用考马斯蓝染色无污染物可见）。这个步骤可以通过增加蛋白质的孵育时间与断前得到提高。的Rec14，他绑定到魔爪分析珠（步骤7.1之后，泳道4）相比，GST纯化步骤（泳道2）后洗脱的蛋白质，表明Rec14 - 他的大部分被绑定到TALON珠。洗涤几次后，Rec14 - 他的洗脱和收集。三洗脱已执行。该分析揭示了高纯度Rec14-HIS（无污染物通过考马斯染色可见，泳道5〜7），以及Rec14 - 他的第一次洗脱的最大浓度。洗脱组分（泳道5-7）中的TALON珠相比洗脱后（泳道8）示出的洗脱效率，因为只有少数Rec14 - 他可以被检测为结合在珠子。
在图3B中使用的样品进行Western印迹分析用抗-GST和抗His抗体以遵循Rec14整个手术过程中（ 图3C）。的抗-GST印迹表明，一些GST-Rec14与单独的GST，存在于从GST纯化步骤（泳道2）将洗脱的蛋白质，和日在污染物的His-标签的亲和纯化步骤中除去。此印迹允许我们还监测了GST已被有效地从Rec14由断前处理和His标签纯化步骤（泳道4-8）中除去。的抗His印迹旨在检测Rec14。因此，我们可以证实，GST-Rec14，他和Rec14，他并没有完全断裂，并从GST珠（泳道11）中删除。此外，在高浓度下，Rec14似乎聚集（泳道13）。总之，呈现的结果证明了GST-他净化为S的净化效率酵母 Rec14。
图1。商品及服务税，他两步亲和纯化方法的纲要。A. GST-Rec14，他构建克隆到的pFastBac（BaculovirGST-Rec14，他对我们表达载体）B.两步亲和纯化的可溶性的Sf9细胞裂解液：GST结合，其次是消费税的断前乳沟，TALON结合，并用咪唑点击这里查看大图 。
图2。 pFastBac1-GST-10xHis的示意图 。 GST（绿色），断前蛋白酶位点（浅蓝色），多克隆位点（红色），和10-His标签（深蓝）被示出。在较低的情况下，从PET-52B发起的核苷酸序列（+）。 点击这里查看大图 。
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图3。商品及服务税，他Rec14一个净化示范结果 。总蛋白级分（泳道2和3）和可溶性细胞裂解物（泳道4和5）从模拟处理Sf9细胞的考马斯染色（泳道2和4）或感染了GST-Rec14 - 他杆状病毒（泳道3和5）。 Rec14-His和GST具有约32.9 kDa的和29 kDa的分子量分别与GST-Rec14-His融合蛋白具有大约61.9 kDa的分子量。B.考马斯亮蓝染色证实的蛋白质纯化方法的每个步骤（用于馏分经与抗GST（泳道1〜8）和抗His（泳道9〜16）抗体的纯化过程的详细解释见程序）C. Western blot检测。upload/50320/50320fig3large.jpg“目标=”_blank“>点击这里查看大图。
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Discussion
这里提出的GST-他的纯化方案，适用于范围广泛的重组蛋白大小的净化：成功纯化李 RAD51（41kDa），piBRCA2（120kDa），PALB2（130kDa），和一个不稳定的大分子量的蛋白质婴儿利什曼原虫 ： 李 BRCA2（125kDa）6,9。此外，与此协议纯化蛋白生化活性6。这种方法的成功完全取决于所需蛋白质的表达，溶解性和稳定性。
在其他宿主中的表达的分子生物学载体，如大肠杆菌大肠杆菌或酵母，可以用广泛使用的GST和他的标签很容易修改。这凸显了目前技术最为分子生物学实验室的适用性和成本效益。各种优势影响了我们的决定在细菌或哺乳动物细胞recombinan选择感染细胞吨蛋白表达和纯化。举例来说，翻译后修饰，例如甲基化，磷酸化和泛素化可影响蛋白质10的酶的功能。因此，要研究的蛋白质的生理特性，有利的是使用一个系统，它允许为翻译后修饰，例如Sf9感染的细胞。使用的Sf9过的哺乳动物细胞的另一个优点，举例来说，是经济的性质，如在感染细胞系统需要相当少的细胞和不昂贵的转染方法相比，哺乳动物系统。
该方法的简单性将帮助研究人员获得的蛋白质或蛋白质复合物中与标准的实验室设备，这有利于以最小的设备在实验室高度纯化的形式。
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Acknowledgments
我们感谢安妮 - 玛丽·迪翁 - 科特的讨论导致了该方法的开发。 JK和RB是FQNRT博士学位的学者，米-MG是凡尼尔CIHR学者，和J.-YM是一个FRSQ高级研究员。这项工作是由自然科学和工程研究理事会JY资金支持。 M。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| E.Coli DH10Bac (competent) | Invitrogen | ||
| Bac-to-Bac Baculovirus Expression System | Invitrogen | ||
| Maxi Prep Kit | Qiagen | 12163 | Solution I and II |
| Ultra Pure Bluo-Gal | Gibco (Life) | 15519028 | |
| IPTG | Gibco (Life) | 15529019 | |
| Sf9 infected cells | ATCC | CRL-1711 | |
| PreScission enzyme | GE Healthcare | 27084301 | |
| Grace's infected medium supplemented | Gibco (Life) | 11605-094 | |
| Fetal Bovine Serum characterized | Hyclone | SH30396.03 | |
| P/S (Penicillin-Streptomycin) | Gibco (Life) | 15070-063 | |
| Glutathione Sepharose resin | GE bioscience | 17075605 | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | 11873580001 | |
| Talon resin | Clontech | 635504 | |
| Imidazole | BioShop | 288324 | |
| Gentamicin | Gibco (Life) | 15710064 | |
| Polyclonal GST-antibody | Production in house | ||
| Monoclonal 6X-His-antibody | Clontech | 631212 | |
| EQUIPMENT | |||
| Dounce homogenizer (tight) | Wheaton | 357546 | |
| Sonicator (Fisher dismembrator) | Fisher | Model 150 | |
| Dialysis bag (50 mm) | Fisher Scientific | 2115217 | |
References
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