Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Spesifikasjonen av Telencephalic glutamatergic Neurons fra menneskelige pluripotente stamceller

Published: April 14, 2013 doi: 10.3791/50321
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1,3
1Department of Neuroscience, The University of Connecticut Health Center, 2Department of Genetics and Developmental Biology, The University of Connecticut Health Center, 3Stem Cell Institute, The University of Connecticut Health Center

Summary

Denne prosedyren gir telencephalic nevroner ved å gå gjennom sjekkpunkter som er lik de som ble observert i løpet av menneskelig utvikling. Cellene tillates å spontant skille, er utsatt for forhold som presse dem mot den nevrale avstamning, er isolert, og er belagt på dekkglass for å tillate terminal differensiering og modning.

Abstract

Her har en trinnvis prosedyre for effektivt å generere telencephalic glutamatergic nevroner fra menneskelige pluripotente stamceller (PSCs) blitt beskrevet. Differensieringen prosessen initiert ved å bryte menneskelige PSCs inn klumper som runder opp til å danne aggregater når cellene er plassert i en suspensjon kultur. Aggregatene dyrkes så i hESC medium fra dag 1-4 for å tillate spontan differensiering. I løpet av denne tid, vil cellene har evne til å bli en av de tre bakterie lag. Fra dager 5-8, blir cellene plassert i et nevralt induksjon middels å presse dem inn i den nevrale avstamning. Rundt dag 8, blir cellene tillatt å feste på 6 brønners plater og skille hvorav tid neuroepithelial celler form. Disse neuroepithelial celler kan isoleres ved dag 17. Cellene kan deretter holdes så neurospheres før de er klare til å bli belagt på dekkglass. Ved hjelp av en enkel medium uten caudalizing faktorer, neuroepithelial celler er specified til telencephalic forløpere, som deretter kan ytterligere differensiert i dorsal telencephalic forfedre og glutamatergic nevroner effektivt. Samlet gir systemet vårt et verktøy for å generere menneskelige glutamatergic nevroner for forskere å studere utviklingen av disse nevronene og sykdommer som påvirker dem.

Introduction

Menneskelige pluripotente stamceller (PSCs), inkludert både menneskelige embryonale stamceller (hESCs) og indusert pluripotent stamceller (iPSCs), har kapasitet til å generere hver celletype i kroppen, inkludert nerveceller 1-3. Rettet differensiering av ulike nevrale subtyper fra menneskelige PSCs har nøkkelen for anvendelse av disse cellene i regenerativ medisin. Den generasjonen av funksjonelle nevrale subtyper under utvikling er en kompleks prosess som involverer induksjon av nevrale avstamning, spesifikasjonen av regionale stamfedre langs Rostro-caudal aksen, og differensiering av post-mitotiske Nevron typer fra de regionale forfedre 4,5. Starten i 2001, har flere systemer er etablert for å generere nevrale avstamning fra hESCs, som har gitt en plattform for den påfølgende generasjonen av nevrale subtyper 6,7. Basert på utviklingsmessige prinsipper, flere neuron som for eksempel spinal motor 8-12 nevroner, midbrain dopaminergic nevroner 13-15, og nevrale retinal celler 16,17 er effektivt spesifisert fra menneskelige PSCs. Dette ble gjort ved å bruke kritiske morphogens som er viktige for spesifisering av disse neuron typer under in vivo utvikling. Andre protokoller er også utviklet for å fremme differensieringen av hESCs i nevroner ved hjelp av enten ytterligere faktorer 18-20 for eksempel små molekyler, eller ved ko-dyrking med andre celletyper å bidra til å fremme differensiering 21.

Den menneskelige neocortex er høyt utviklet og inneholder mange celletyper, inkludert glutamatergic nevroner som spiller en viktig rolle i læring, hukommelse og kognitiv funksjon 22,23. Det første trinnet i å generere glutamatergic nevroner i kultur er å spesifisere telencephalic stamceller. Yoshiki Sasai gruppe først rapporterte rettet differensiering av telencephalic forløpere fra mus ESCs (mESCs) med en serum-free suspension kulturen i nærvær av NOK1 (som hemmer Wnt signalering) samt LeftyA (som hemmer nodal signalering) 24. Senere har flere grupper inkludert vår også rapportert spesifisering av telencephalic forløpere fra menneskelige PSCs i serum fritt medium 25-27. Generering av telencephalic forløpere fra menneskelige PSCs krever ikke bruk av eksogene morphogens og effektiviteten i å generere disse forløperne er mye høyere enn det fra mESCs 26,27. Her har et kjemisk definert system for neural induksjon som var godt etablert av Zhang gruppe 7 blitt beskrevet. Uten tilsetning av eksogene caudalizing faktorer, genererer denne protokollen effektivt telencephalic forløpere fra menneskelige PSCs 27. Disse stamfedre kan deretter differensiert i dorsal eller ventral stamfedre ved å regulere signalering av Wnt og sonic hedgehog (ssh). De dorsale stamfedre kan videre skille ut glutamatergic nevroner efficiently 27. I tillegg fungerer denne protokollen også godt for generering av glutamatergic nevroner fra menneske 28 iPSCs, som gjør det mulig for generering av pasient-spesifikke nevroner som kan benyttes til å utforske virkningsmekanismen så vel som potensielle terapi for et stort utvalg av sykdommer . Dessuten gir systemet vårt også en plattform for å utforske utvikling og spesifisering av ulike nevrale typer i telencephalon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Generasjon av Human pluripotent Stem Cell Aggregater (D1-D4)

  1. Humane pluripotent stamceller dyrkes i mus embryonale fibroblast (MEF) forer i nærvær av hESC medium supplert med grunnleggende fibroblast vekstfaktor (bFGF, 4 ng / ml). Etter 5-7 dager i kultur når koloniene er stor, men likevel udifferensiert, er de klare for neste trinn.
  2. Enzym-oppløsningen bør først forberedt. I en 50 ml rør, oppløse dispase (eller kollagenase) ved 1 mg / ml konsentrasjon i DMEM/F12 medium. Siden disse løsningene blandes best når varmet, plassere røret som inneholder mediet og enzym i en 37 ° C vannbad i 10 til 15 minutter, og deretter sterilisere det ved hjelp av en Steriflip filter.
  3. Aspirer av mediet fra cellene, skyll dem med DMEM/F12, og aspirere dette av så vel. Tilsett 1 ml av dispase til hver brønn og plass i inkubator i 3-5 min for hESCs (opp til 10 min for iPSCs). Se på cellene i mikroskop, nårkantene krøller seg litt / ser litt mørkere, cellene er klare for neste trinn. Det er best å sjekke cellene etter 3 min og sette dem tilbake i om nødvendig. Ved bruk av denne protokollen for første gang, er det best å begynne med bare en plate av celler på et tidspunkt da det er viktig å fjerne cellene fra dispase så raskt som mulig.
  4. Aspirer av dispase fra cellene. Forsiktig (cellene er svært sårbare på dette stadiet, og vil komme ut av platen relativt lett) legger 1,5 ml DMEM/F12 medium til hver brønn for å skylle av dispase. Aspirer av DMEM/F12 og tilsett 1,5 ml hESC medium til hver brønn.
  5. Å løsne og bryte opp celler, plassere tuppen av en 10 ml glass pipette mot nedre høyre hjørne av en brønn (berøre cellene) og flytte pipetten opp og ned (vertikalt) - oppover stoke bør være i umiddelbar nærhet til rettssaken nedadgående slag. Når den andre siden av brønnen er nådd, gjentas i den horisontale direDette skjer.
  6. Når alle cellene er i suspensjon, plassere dem i 15 ml rør og sentrifuger dem ved 200 xg i 2 min. Det bør være en pellet av celler på bunnen av røret. Aspirer av medium fra over pelleten.
  7. Størrelsen på cellekultur kolbe som bør benyttes for å holde aggregatene i avhenger den opprinnelige mengden av celler. For 6 brønner (en plate) av hESCs, behandlet en ikke-vevskultur T75 kolbe med 50 ml hESC medium bør utnyttes. Overfør cellene fra trinn 1,6 til kolben og inkuber ved 37 ° C.
  8. For å kvitte seg med celleavfall, bør cellen medium og kolbe byttes omtrent 12 hr senere. For å gjøre dette, plassere alle medium / cellene inn i en 50 ml rør, spinne celler ned (200 xg i 2 min), og aspireres av det gamle mediet. Deretter legger 50 ml frisk hESC medium til cellene, og plassere inn i en ny T75 kolbe. Cellene kan deretter bli matet daglig etter samme prosedyre (før dag 5).

  1. Overfør celler / medium til en 50 ml rør, og sentrifuger cellene i 2 min ved 200 x g. Neste, aspireres av supernatanten, og overføre cellene til en ny (ikke-vevskultur behandlet) T75 kolbe med 50 ml av nevrale induksjon medium (NIM).
  2. Når cellene er i NIM bør halvdel av mediet byttes annenhver dag. Aggregatene skal bli stort nok til hvor de vil synke til bunnen av en 50 ml konisk rør på egen hånd etter noen minutter (ingen sentrifugering kreves). Etter 2-3 dager i NIM (D7-D8 totalt), bør cellene være klar til plate. Laminin eller føtal bovint serum (FBS) kan benyttes til å hjelpe cellene feste til platene.
  3. Antallet vevskultur behandlet 6 brønners plater som trengs avhenger av tettheten av cellene som hver aggregat skal kunne vokse på plate i flere dager uten å berøre noen av de andre. I gjennomsnitt, cellene fra enT75 kolbe vil gi ca 4-6 6 godt plater verdt av celler.
    1. Hvis du bruker laminin, spe den i NIM til 10-20 mikrogram / ml å belegge 6-brønners plate (~ 0,5 ml / brønn). Etter belegg for 2-3 timers, plate celleaggregatene bort på 6-brønn plater (~ 20-30 aggregater per brønn). Etter aggregatene har festet, legg 1,5 ml NIM.
    2. Hvis du bruker FBS, utarbeide en blanding av 90% NIM og 10% FBS (1,5 ml / brønn). Tilsett 1,5 ml medium med celler til hver brønn, rist plate og tilbake for å spre ut aggregatene, og la cellene å feste O / N i en inkubator. Sørg for å endre medium (2 ml / brønn NIM) følgende morgen for å fjerne FBS.
  5. Etter en dag eller to for å være belagt, vil hver samlet spre ut for å danne et monolag. Innen et par dager, vil sentrene for de fleste av disse cellene morfologisk ligne på columnar celler (langstrakt). I løpet av denne perioden, kan du endre NIM annenhver dag. Noen PSC linjer (særligly IPSC), kan danne columnar celler mindre effektivt. Hvis dette skjer, kan tillegg av BMP og TGF-hemmere (Dorsomorphin 29, SB431542 19 på 2 mikrometer) under trinn 2 være nyttig.
  6. Rundt dager 14-17, vil det spaltelignende cellene synes mer kompakt. Noen ganger disse cellene danner rygger eller ringer med synlige lumen inni. Foruten columnar morfologi, celler på dette stadiet uttrykke neuroepithelial markører, for eksempel PAX6 og SOX1 12,26.
  7. Før isolering kan begynne, må man først undersøke cellene for å fastslå om det er noen som ikke neuroepithelial celler til stede. En objektiv markør kan utnyttes for å indikere ikke-neuroepithelial kolonier. Disse kan deretter bli eliminert ved skraping dem av med en pipettespiss.

3. Generasjon av Telencephalic stamfedre (D17-D24)

  1. Sentrene av koloniene inneholder neuroepithelial celler, og bør være isolert fra resten av kolonien. Dette kan gjøres ved hjelpen mikropipette og en steril 1 ml filtrert pipettespissen. Når en liten mengde trykk påføres på den midtre delen av kolonien, løfter den generelt av ganske lett. Være forsiktig å ikke la den ytre delen av kolonien løsne også. Hvis sentrene blir sta og vil ikke komme ut på egen hånd, kan de fjernes ved excising dem ved hjelp av en nål under et mikroskop i et sterilt hette. Overfør de midtre partier av koloniene til et 15 ml rør og rotere ved 200 xg i 2 min.
  2. Mediet bør aspirated off av cellene. To plater verdt av celler kan deretter bli overført til en ikke-vevskultur behandlet T25 kolbe inneholdende 10 ml NIM med tillegg av B27 (uten vitamin A, 1:50). Bruk 5-10 ml medium pr en plate av celler.
  3. Når cellene er vist følgende dagen, bør de ha en sfære som utseende. Det er nødvendig å overføre disse cellene inn i en ny kolbe (i nærvær av NIM og B27, 1:50) som det er ofte de perifere cellersom snike seg inn og feste til bunnen av kolben.
  4. Den neurospheres skal da dyrkes i suspensjon i en uke med NIM supplert med B27 (1:50). For å fremme celle utholdenhet og spredning, syklisk AMP (cAMP, 1 uM) samt insulin vekstfaktor (IGF1, 10 ng / ml) kan legges inn i mediet under sperringen kultur. På dette punktet, neurospheres inneholder telencephalic stamfedre (FOXG1 +) og er klar til å bli belagt på dekkglass for terminal differensiering.

4. Ytterligere differensiering inn i Telencephalic Neurons (D25 +)

    1. Forbered poly-ornithine/laminin belagte dekkglass (i 24-brønners plater) for plating cellene. Dekkglass er først rengjort, og blir deretter belagt med knep-ornitin (ved 0,1 mg / ml, 37 ° C, O / N, og lagret i fryser).
      Poly-ornithine belegg:
      1. Sterilisere dekkglass: Plasser dekkglass i enbeger inneholdende salpetersyre og rist i avtrekksskap i én time. Hell ut salpetersyre, skylle flere ganger med DI vann, og la dekkglass under rennende DI vann i minst 15 min. Plasser dekkglass i 95% etanol og enten rist i 30 min (ved bruk umiddelbart) eller en butikk i etanol ved romtemperatur.
      2. I en steril hette, helle ut innholdet i 50 ml rør inneholdende sterilisert dekkglass i lokket av en 6-brønns plate. Bruke steriliserte tang, plukke opp en dekkglass gangen og satt oppreist i en enkelt brønn av en 24-brønns plate. Gjenta slik at hver brønn har et dekkglass.
      3. Etter at de tørker helt av, trykker platene før dekkglass har falt flatt i hver brønn. Deretter tilsettes 100 ul poly-ornitin (0,1 mg / ml i steril dH 2 O) til hver dekkglasset og inkuber platene O / N ved 37 ° C.
      4. Neste dag, fjerne platene fra inkubatoren og tillate dem å avkjøles til RT. Aspirer poly-ornithine ut av hver dekkglass (fra kanten av than dekkglass) sørge for ikke å berøre eller skrape dekkglass i prosessen. Tillat dekkglass tørke i ca 30 min før vask.
      5. Tilsett 1 ml steril dH 2 O til hver brønn, la sitte i 10 min, og aspireres av vannet fra hver brønn. Gjenta dette vasketrinnet to ganger til. Etter at platene tørke helt, (permisjon dekker av i panseret) plassere lokk på, dekk med aluminiumsfolie, og oppbevar ved -20 ° C.
      1. Å belegge dekkglass med laminin, tilsett 50 pl av en blanding av nevrale differensiering medium og laminin (endelig konsentrasjon på 20 ug / ml) til hver poly-ornitin behandlet dekkglass er forsiktig med å bare ha væsken berører dekkglasset selv (og ikke spilling av). Inkuber dem ved 37 ° C i 1-2 timer før forbereder cellene for vedlegg.
  2. Utlevering og sentrifuger neurospheres kl 200 xg i 2 min i en 15 ml rør. Aspirer av supernatanten.
    3. <li>
    1. Skyll cellene med DMEM-F12 og sentrifuger cellene igjen. Hvis neurospheres er for store til å feste riktig, kan de være dissosiert med Accutase på dette trinnet.
    2. Hvis bruker Accutase: Etter vasking av cellene med DMEM-F12, er neurospheres er dissosiert til små klynger ved tilsetning Accutase (~ 2 ml) og inkubering av cellene ved 37 ° C i 3 min. Deretter legger samme mengde trypsin inhibitor (~ 2 ml) og sentrifuger cellene ved 200 xg i 3 min. Cellene bør da bli re-suspendert i NDM og brutt ved hjelp av en P200 pipette. De små klynger kan deretter platet ut på forbelagte dekkglass.
  3. Aspirer utenfor flertallet av mediet og plassere cellene bort på en 6 cm petriskål i noen få dråper av mediet slik at velge dem blir enklere. Legg ca 4-5 neurospheres til hver pre-belagt dekkglass. Det er ikke nødvendig å aspirere av laminin først.
  4. La neurospheres feste for minst 2-4 timer. Når de har enttached godt, bør mer medium (0,5 ml / dekkglass) legges til. Det skal bestå av nevrale differensiering medium supplert med B27 (1:50), cAMP (1 uM), og neurotrofiske faktorer (BDNF, GDNF og IGF, alle på 10 ng / ml). På dette punktet halvparten av mediet kan endres hver dag og disse cellene kan opprettholdes i flere måneder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Her, med en protokoll differensiere menneskelige PSCs inn telencephalic glutamatergic nevroner gjennom flere kritiske trinn: dannelsen av PSC tilslag, har induksjon av neuroepithelial celler, produksjon av telencephalic progenitorer og terminal differensiering av disse stamfedre inn telencephalic nevroner (figur 1) blitt beskrevet. Dette systemet er robust og effektivt i produksjon av telencephalic forfedre og glutamatergic nevroner. Som et eksempel (figur 2), uten tilsetning av caudalizing faktorer ble hESCs differensiert i det nevrale avstamning 27. På 24 dager etter differensiering, var flertallet av nevrale forløpere positivt for FOXG1 (en transkripsjonsfaktor uttrykt av telencephalon), men negativt for HOXB4 (en markør for hindbrain og ryggmarg celler) foreslå telencephalic forfedre var vellykket generert (figur 2D). Disse telencephalic stamfedre p ossess en dorsal fenotype, som indikert ved ekspresjon av PAX6 (en markør uttrykt av dorsal progenitorer) (figur 2E), men ikke NKX2.1 (en markør for ventral progenitorer) (figur 2F). Etter ytterligere differensiering, disse telencephalic dorsal forfedre differensiert i glutamatergic nevroner, som var positivt for glutamatergic markør TBR1 (rundt 80%) 27. Nevroner som farget positivt for TBR1 var også positive for nevrale markører βIII-tubulin (figur 2G) eller microtubule-assosiert protein 2 (MAP2, figur 2H). Disse cellene uttrykte også vesikulær glutamat transportør 1 (vGLUT1), en markør for modne glutamatergic nevroner, noe som tyder effektiv produksjon av telencephalic glutamatergic nevroner i kultur (figur 2I).

highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50321/50321fig1.jpg "/>
Figur 1. En skjematisk tidsplan for nevronale differensiering prosessen.

Figur 2
Figur 2. Bilder fremhever celler under flere kritiske stadier under neuronal differensiering. (A) Menneskelige ESCs ble dyrket i 4 dager. Fase bilder som viser dannelsen av ESC aggregater (B) og neuroepithelial celler (C). Ved 24 dager etter differensiering fra hESCs, de fleste av NE celler var FOXG1 + men HOXB4 - (D). De telencephalic stamfedre (FOXG1 +) var PAX6 + (E), men NKX2.1 - (F) etter en måned av differensiering. Etter ytterligere touker (6 uker totalt) å differensiere cellene på dekkglass, farget fleste av dem positiv for glutamaterg markør TBR1 (G, H), så vel som de nevrale markører βIII-tubulin (G) og MAP2 (H). Etter åtte uker for differensiering, ble cellene positive for de modne glutamaterg markør, vGLUT1 (I). Skala barer: 100 mikrometer (A), 50 mikrometer (BI). (DI har blitt tilpasset fra vår forrige publisering 27 med tillatelse).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Det er flere kritiske trinnene under nevrale differensiering prosessen. Det er viktig å sikre at de menneskelige PSCs er pluripotent fordi ellers cellene kan allerede være forutinntatt mot å bli en ikke-nevronale avstamning. Dette kan bekreftes ved farging menneskelige PSCs med antistoffer mot pluripotency markører som Oct4, Sox2, Nanog, og Tra-1-60 1-3. Hvis de menneskelige PSCs ikke feste veldig godt etter passaging dem, kan ROCK inhibitor (Y27632) legges til hjelp. For de som har vanskeligheter med å holde sin celler pluripotent, noen potensielle problemer er kvaliteten / tettheten MEF celler, samt masse KOSR blir brukt som det kan være variasjon fra parti til parti. Selv MEF mater celler har blitt brukt til å opprettholde PSCs i ovennevnte protokoll, fungerer denne metoden også for PSCs som blir dyrket ved hjelp av mater-frie systemer.

Når cellene blir brutt opp for å danne PSC aggregater, er det viktig å begrendet deres dispase eksponering for bare noen få minutter (kantene vil runde opp). Lengden av tid som det tar før kantene av iPSCs (opp til 10 min) er vanligvis lenger enn de ESCs (3-5 min). Det er optimalt å legge dispase til bare en plate av menneskelige PSCs om gangen for å sikre at cellene ikke er i enzymet for lenge som dette kan skade eller til og med drepe cellene. Etter at cellene er i PSC samlet stadium, er det viktig å holde cellene på en lav tetthet. Tettheten er også ganske viktig når PSC aggregater er belagt. Disse cellene vil utvide på plate i løpet av de neste dagene og forholdsregler bør tas for å sikre at de ikke vil berøre etter at de blir større. Under vedlegget trinn (2.2), er det viktig å sikre at cellene ikke har en langvarig eksponering for FBS da dette påvirker genekspresjonen. Før isolere neuroepithelial celler, er det også viktig å skrape av de ikke-neuronale klynger for å gi en mer renpopulasjon av celler. Hvis man ønsker å karakterisere hvorvidt cellene deres går inn i neuronal avstamning, kan ulike faktorer bli sett på som Pax6 eller Sox1. Pax6 slås på rundt dag 10 under nevrale differensiering, og Sox1 svinger på av to uker etter differensiering 12,26,30.

Denne protokollen er i forkant av nevrale differensiering som det rekapitulerer mange trinn som finner sted under utviklingen av den menneskelige nervesystemet. Uten bruk av caudalizing faktorer (retinsyre, grunnleggende FGF), neuroepithelial celler effektivt skille ut telencephalic stamceller, som sammenfaller med neuroectoderm celler først anskaffe en rostral fenotype under in vivo utvikling 31. Disse telencephalic forfedre har en dorsal fenotype grunn endogent Wnt signalering som dorsalizes cellene 27. Dette systemet genererer dorsal forfedre som deretter kan ytterligere differensiert i glutamatergic celles. Mens denne celletype er svært viktig, er det på ingen måte den eneste celletype at dette systemet er i stand til å danne. For eksempel har tillegg av SHH vist seg å ventralize cellene, slik at de til å differensiere i GABAergic celler 27,32. Det ble også vist at disse hESC avledet GABAergic nevroner kan transplanteres inn i mus og at de er i stand til å korrigere bevegelsesapparatet mangler som skyldes hjerneskader 32. Fordi protokollen som er demonstrert i denne artikkelen går gjennom en trinnvis sjekkpunkter, og tilbyr et verktøy for å produsere et bredt utvalg av celler i menneskets nervesystem som er bare begrenset av vår forståelse av utvikling og fantasien.

Evnen til å danne humane nevroner fra PSCs åpner et stort antall dører fra både en grunnleggende vitenskap samt et klinisk perspektiv. Mortem vev kilder er begrenset, og kvaliteten kan variere, mens humant PSC differensiering tillater forskere å gi enubegrenset og jevn forsyning av celler til å arbeide med. Med bruk av induserte pluripotente stamceller (IPSC) teknologi 1,3,33,34, er det nå mulig å få hESC-lignende celler fra pasientens fibroblaster inkludert de med ulike sykdommer 35-38. Som vist av vår gruppe 28 så vel som mange andre, har den vellykkede generasjonen av nerveceller fra IPSC vært og vil fortsette å være et unikt og nyttig verktøy for de som har lenge søkt etter menneskelige modeller for sykdom og utvikling. I tillegg har flere grupper vist at PSC-avledede nevroner kan modellere visse aspekter av sykdomsprosessen 36,37,39-42 og dermed kan benyttes til å screene terapeutiske forbindelser 43. Dette er spesielt oppmuntrende fordi uten en god modell system for å teste kandidat narkotika for sentralnervesystemet med, bare omtrent 8% av dem har vist seg å være klinisk effektive 44. Imidlertid kan denne metoden og andre liker det hjelpe å dramatisk forbedre ther nummer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Forfatterne ønsker å takke dr. Y. Sasai for sjenerøst gi FOXG1 antistoff. Dette arbeidet ble støttet av Connecticut stamcelleforskning Grants (08-SCB-UCHC- 022 og 11-SCB24) og spastisk paraplegi Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco's modified eagle medium with F12 nutrient mixture (DMEM/F12) Gibco 11330-032
Knockout Serum Replacer Gibco 10828-028
L-glutamine (200 mM) Gibco 25030
Non Essential Amino Acids Gibco 1140-050
2-Mercapt–thanol (14.3 M) Sigma M-7522
Neurobasal medium Gibco 21103-049
N2 Gibco 17502-048
B27 Gibco 12587-010
Heparin Sigma H3149
Poly-L-ornithine hydrobromide (polyornithine) Sigma 116K5103
Laminin (human) Sigma L-6274
Laminin (mouse) Invitrogen 23017-015
FBS Gemini 100-106
Bovine serum albumin (BSA) Sigma A-7906
Dispase Gibco 17105-041
Collagenase Invitrogen 17104-019
Accutase Innovative Cell Technologies AT104
ROCK Inhibitor Stemgent 04-0012
SB431542 Stemgent 04-0010
Dorsomorphin Stemgent 04-0024
Fibroblast growth factor 2 (FGF2, bFGF) Invitrogen 13256-029
Trypsin inhibitor Gibco 17075
0.1% gelatin Millipore ES-006-B
Foxg1 antibody Dr. Y. Sasai
Hoxb4 antibody (1:50) Developmental Studies Hybridoma Bank I12
Pax6 antibody (1:5000) Developmental Studies Hybridoma Bank PAX6
Nkx2.1 antibody (1:200) Chemicon MAB5460
Tbr1 antibody (1:2000) Chemicon AB9616
vGLUT1 antibody (1:100) Synaptic Systems 135302
Brain derived neurotrophic factor (BDNF) PrepoTech Inc. 450-02
Glial derived neurotrophic factor (GDNF) PrepoTech Inc. 450-10
Insulin growth factor 1 (IGF1) PrepoTech Inc. 100-11
Cyclic AMP (cAMP) Sigma D-0260
Sonic hedgehog (SHH) R&D 1845-SH
50 ml tubes Becton Dickinson (BD) 352098
15 ml tubes BD 352097
6 well plates BD 353046
24 well plates BD 353047
T25 flasks (untreated) BD 353009
T75 flasks (untreated) BD 353133
Coverslips Chemiglass Life Sciences 1760-012
6 cm Petri dishes BD 353004
9'' glass pipetes Fisher 13-678-20D
Steriflip filters (0.22 μM) Millipore SCGP00525
Stericup filters 1,000 ml (0.22 μM) Millipore SCGPU10RE
Phase contrast microscope (Observer A1) Zeiss R2625
Carbon dioxide incubator (Hera Cell 150) Thermo Electron Corporation
Biosafety hood (Sterilgard III Advance) The Baker Company
Centrifuge (5702 R) Eppendorf

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Takahashi, K., Tanabe, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
  2. Thomson, J. A., Itskovitz-Eldor, J., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
  3. Yu, J., Vodyanik, M. A., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318, 1917-1920 (2007).
  4. Jessell, T. M. Neuronal specification in the spinal cord: inductive signals and transcriptional codes. Nat. Rev. Genet. 1, 20-29 (1038).
  5. Wilson, S. I., Edlund, T. Neural induction: toward a unifying mechanism. Nat. Neurosci. 4, 1161-1168 (2001).
  6. Reubinoff, B. E., Itsykson, P., et al. Neural progenitors from human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 19, 1134-1140 (2001).
  7. Zhang, S. C., Wernig, M., Duncan, I. D., Brustle, O., Thomson, J. A. In vitro differentiation of transplantable neural precursors from human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 19, 1129-1133 (2001).
  8. Hu, B. Y., Weick, J. P., et al. Neural differentiation of human induced pluripotent stem cells follows developmental principles but with variable potency. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 4335-4340 (2010).
  9. Singh Roy, N., Nakano, T., et al. Enhancer-specified GFP-based FACS purification of human spinal motor neurons from embryonic stem cells. Exp. Neurol. 196, 224-234 (2005).
  10. Lee, H., Shamy, G. A., et al. Directed differentiation and transplantation of human embryonic stem cell-derived motoneurons. Stem Cells. 25, 1931-1939 (2007).
  11. Boulting, G. L., Kiskinis, E., et al. A functionally characterized test set of human induced pluripotent stem cells. Nat. Biotechnol. 29, 279-286 (2011).
  12. Li, X. J., Du, Z. W., et al. Specification of motoneurons from human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 23, 215-221 (2005).
  13. Perrier, A. L., Tabar, V., et al. Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 12543-12548 (2004).
  14. Roy, N. S., Cleren, C., et al. Functional engraftment of human ES cell-derived dopaminergic neurons enriched by coculture with telomerase-immortalized midbrain astrocytes. Nat Med. 12, 1259-1268 (2006).
  15. Yan, Y., Yang, D., et al. Directed differentiation of dopaminergic neuronal subtypes from human embryonic stem cells. Stem Cells. 23, 781-790 (2005).
  16. Meyer, J. S., Shearer, R. L., et al. Modeling early retinal development with human embryonic and induced pluripotent stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 16698-16703 (2009).
  17. Osakada, F., Ikeda, H., et al. Toward the generation of rod and cone photoreceptors from mouse, monkey and human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 26, 215-224 (2008).
  18. Carpenter, M. K., Inokuma, M. S., et al. Enrichment of neurons and neural precursors from human embryonic stem cells. Exp. Neurol. 172, 383-397 (2001).
  19. Chambers, S. M., Fasano, C. A., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat. Biotechnol. 27, 275-280 (2009).
  20. Chambers, S. M., Qi, Y., et al. Combined small-molecule inhibition accelerates developmental timing and converts human pluripotent stem cells into nociceptors. Nat. Biotechnol. 30, 715-720 (2012).
  21. Kawasaki, H., Mizuseki, K., et al. Induction of midbrain dopaminergic neurons from ES cells by stromal cell-derived inducing activity. Neuron. 28, 31-40 (2000).
  22. Rubenstein, J. L., Beachy, P. A. Patterning of the embryonic forebrain. Curr. Opin. Neurobiol. 8, 18-26 (1998).
  23. Hevner, R. F., Hodge, R. D., Daza, R. A., Englund, C. Transcription factors in glutamatergic neurogenesis: conserved programs in neocortex, cerebellum, and adult hippocampus. Neurosci. Res. 55, 223-233 (2006).
  24. Watanabe, K., Kamiya, D., et al. Directed differentiation of telencephalic precursors from embryonic stem cells. Nat. Neurosci. 8, 288-296 (2005).
  25. Watanabe, K., Ueno, M., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 25, 681-686 (2007).
  26. Pankratz, M. T., Li, X. J., et al. Directed neural differentiation of human embryonic stem cells via an obligated primitive anterior stage. Stem Cells. 25, 1511-1520 (2007).
  27. Li, X. J., Zhang, X., et al. Coordination of sonic hedgehog and Wnt signaling determines ventral and dorsal telencephalic neuron types from human embryonic stem cells. Development. 136, 4055-4063 (2009).
  28. Zeng, H., Guo, M., et al. Specification of region-specific neurons including forebrain glutamatergic neurons from human induced pluripotent stem cells. PLoS One. 5, e11853 (2010).
  29. Kim, D. S., Lee, J. S., et al. Robust enhancement of neural differentiation from human ES and iPS cells regardless of their innate difference in differentiation propensity. Stem Cell Rev. 6, 270-281 (2010).
  30. Zhang, X., Huang, C. T., et al. Pax6 is a human neuroectoderm cell fate determinant. Cell Stem Cell. 7, 90-100 (2010).
  31. Stern, C. D. Initial patterning of the central nervous system: how many organizers. Nat. Rev. Neurosci. 2, 92-98 (2001).
  32. Ma, L., Hu, B., et al. Human embryonic stem cell-derived GABA neurons correct locomotion deficits in quinolinic acid-lesioned mice. Cell Stem Cell. 10, 455-464 (2012).
  33. Li, W., Wei, W., et al. Generation of rat and human induced pluripotent stem cells by combining genetic reprogramming and chemical inhibitors. Cell Stem Cell. 4, 16-19 (2009).
  34. Lowry, W. E., Richter, L., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from dermal fibroblasts. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2883-2888 (2008).
  35. Dimos, J. T., Rodolfa, K. T., et al. Induced pluripotent stem cells generated from patients with ALS can be differentiated into motor neurons. Science. 321, 1218-1221 (2008).
  36. Ebert, A. D., Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient. Nature. 457, 277-280 (2009).
  37. Lee, G., Papapetrou, E. P., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature. 461, 402-406 (2009).
  38. Park, I. H., Arora, N., et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell. 134, 877-886 (2008).
  39. Chamberlain, S. J., Chen, P. F., et al. Induced pluripotent stem cell models of the genomic imprinting disorders Angelman and Prader-Willi syndromes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 17668-17673 (2010).
  40. Kiskinis, E., Eggan, K. Progress toward the clinical application of patient-specific pluripotent stem cells. J. Clin. Invest. 120, 51-59 (2010).
  41. Koch, P., Tamboli, I. Y., et al. Presenilin-1 L166P mutant human pluripotent stem cell-derived neurons exhibit partial loss of gamma-secretase activity in endogenous amyloid-beta generation. Am. J. Pathol. 180, 2404-2416 (2012).
  42. Walsh, R. M., Hochedlinger, K. Modeling Rett syndrome with stem cells. Cell. 143, 499-500 (2010).
  43. Egawa, N., Kitaoka, S., et al. Drug Screening for ALS Using Patient-Specific Induced Pluripotent Stem Cells. Sci. Transl. Med. 4, (2012).
  44. Kola, I., Landis, J. Can the pharmaceutical industry reduce attrition rates. Nature Reviews Drug Discovery. 3, 711-716 (2004).

Tags

Stem Cell Biology nevrovitenskap nevrobiologi utviklingsbiologi cellebiologi molekylær biologi stamceller embryonale stamceller ESCs pluripotente stamceller Utførte pluripotente stamceller IPSC nevrale differensiering forebrain glutamatergic nervecellen nevrale mønster utvikling nevroner
Spesifikasjonen av Telencephalic glutamatergic Neurons fra menneskelige pluripotente stamceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Boisvert, E. M., Denton, K., Lei,… More

Boisvert, E. M., Denton, K., Lei, L., Li, X. J. The Specification of Telencephalic Glutamatergic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (74), e50321, doi:10.3791/50321 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter