Summary
此过程产生在前脑的神经元通过检查站，这是人类发展过程中所观察到的类似。细胞可自发地分化，暴露因素推动对神经系，是孤立的，并镀上盖玻片，以便终末分化和成熟。
Abstract
这里，已经描述了用于高效地生成从人多能性干细胞（PSCs）端脑谷氨酸能神经元的一个逐步的过程。的分化过程开始向上舍入到时形成聚集体的悬浮培养细胞被放置在成团块通过打破人类安全公司。聚集在人类胚胎干细胞培养基中生长1-4天，以允许自发分化。在这段时间内，将细胞有能力成为任何三种胚层。从5-8天，将细胞放置在一个神经诱导培养基中，推入神经谱系。第8天左右，细胞被允许连接到6孔板上，并分化期间的时间的神经上皮细胞形式。这些神经上皮细胞，可以隔离17天。这些细胞可以保持神经球，直到他们准备好盖玻片的培养皿上。使用碱性介质中没有任何caudalizing因素，神经上皮细胞specifieD插入端脑前体，然后可以进一步区分有效地背端脑祖细胞和谷氨酸能神经元的。总的来说，我们的系统提供了一个工具来生成人体谷氨酸能神经元的研究人员研究这些神经元疾病，影响到他们的发展。
Introduction
人多能性干细胞（PSCs），包括人类胚胎干细胞（胚胎干细胞），诱导式多能性干细胞（iPS细胞），具有的能力，以产生在体内的每一个细胞类型，包括神经元1-3。定向分化为各种神经元亚型人分成合同持有这些细胞在再生医学中的应用的关键。在开发过程中的功能神经元亚型的产生是一个复杂的过程，涉及诱导的神经系的区域沿rostro尾鳍轴祖细胞，该规范，并从区域4,5祖细胞的有丝分裂后的神经元类型的分化。从2001年开始，一些系统已建立了从人类胚胎干细胞，它提供了一个平台，为后续神经元亚型6,7代产生神经系。根据发展原则，一些神经元类型，如8-12脊髓运动神经元，脑DOP13日至15日 ，胺类神经元和神经视网膜细胞16,17已有效地从人的产品分成合同中指定。这样做是通过施加临界形态发生素体内发育过程中的规格，这些神经元类型是重要的。其他协议也得到了发展，促进人类胚胎干细胞分化成神经元可以使用其他的因素，如小分子或与其他类型的细胞共培养，以18-20帮助促进花芽分化21。
人类的大脑新皮质是高度发达的，包含许多类型的细胞，包括谷氨酸能神经元在学习，记忆和认知功能的22,23，其中扮演了重要的角色。产生谷氨酸能神经元在培养的第一个步骤是指定端脑的祖细胞。笹井芳树的组首次报道了端脑前体定向分化的小鼠胚胎干细胞（mESCs）使用无血清悬索桥的N培养物的存在下，DKK1（抑制Wnt信号）以及LeftyA（抑制节点信令）24。随后，几个研究小组还报告了包括我们在内的人类在无血清培养基25日至27日的物业服务端脑前体的规范。并不需要外源的形态发生和效率产生这些前体的使用是远高于从mESCs 26,27的端脑前体从人类安全公司代。在这里，神经诱导，以及设立的张的基7的化学定义的系统已被描述。此协议没有此外外源性caudalizing因素，有效地产生端脑前体从人类安全公司27。通过调节Wnt信号和Sonic Hedgehog（SHH）的信令，这些祖细胞可以分化成背侧或腹侧祖细胞，，背祖细胞进一步分化成谷氨酸能神经元Ëfficiently 27。此外，该协议还可以很好地用于谷氨酸能神经元的产生，从人类iPSCs 28，这允许针对具体患者的神经元的产生，可以利用机制的探索行动，以及潜在的治疗疾病的大型阵列。此外，我们的系统还提供了一个平台，探索不同的前脑的神经元类型的发展和规范。
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Protocol
1。代的人类多能干细胞聚集体（D1-D4）
- 人类多能干细胞对小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）的送料器，在胚胎干细胞的存在下与碱性成纤维细胞生长因子（bFGF，4纳克/毫升）的培养基中培养。经过5-7天的培养时，菌落大，但仍然未分化的，他们是为下一步做好准备。
- 应先来制备的酶溶液。在一个50毫升的试管中，溶解在1毫克/毫升的浓度成DMEM/F12培养基分散酶（或胶原酶）。由于这些解决方案，混合最好的，受热后，将管中介质和酶，37℃水浴10-15分钟，然后它使用Steriflip过滤器进行消毒。
- 吸介质的细胞，将其冲洗DMEM/F12，并吸取这一关。 3-5分钟为胚胎干细胞（iPS细胞）最多10分钟，加入1毫升分离酶在孵化器中的各孔和地点。的细胞在显微镜下看;边缘微微蜷缩/看起来有点暗，细胞，为下一步做好准备。最好是，检查细胞后3分钟，如有必要，将它们放回。当首次使用此协议，它是最好的开始与在同一时间只有一个板的细胞，因为它重要的是尽可能快地从分离酶以除去细胞。
- 吸液从细胞中分离酶。轻轻地（在这个阶段的细胞是非常脆弱的，并会在板相对容易）加入1.5毫升的DMEM/F12培养基，每孔以冲洗掉分离酶。吸液DMEM/F12和1.5毫升的人类胚胎干细胞培养基添加到各孔中。
- 要分离，打破了细胞，将10毫升的玻璃吸管的尖端对右下角的良好（触摸细胞）和向上移液管和上下（垂直） - 向上的行程应该是在接近该法律程序的向下行程。一旦达到的井，另一侧，重复在水平可怕ction。
- 一旦所有的细胞是在悬浮液中，将它们放置在15ml试管中，并在200×g离心2分钟离心。应该有一个细胞在试管底部沉淀。吸液介质从上面的粒料。
- 应当被用来保持中的聚集体的细胞培养烧瓶中的大小取决于原始细胞的数量。 6口井（板）的胚胎干细胞，组织培养处理的T75烧瓶，用50毫升的人类胚胎干细胞培养基中应使用。从步骤1.6将细胞转移到烧瓶中并孵育在37℃下
- 为了摆脱的细胞碎片，细胞培养基和烧瓶中约12小时后，应更换。要做到这一点，将所有的介质/细胞到一个50毫升的试管中，向下旋转的细胞（200×g离心2分钟），并吸移的旧培养基。接下来，加50毫升的新鲜胚胎干细胞培养基中的细胞，并放置到一个新的T75烧瓶。跟随此相同的方法（直到第5天），然后，这些细胞可以每天供给。
- 细胞/培养基转移到一个50毫升的试管中，离心细胞，以200×g的2分钟。接着，抽吸除去上清液，将细胞转移到一个新的（非组织培养处理）的T75烧瓶中的神经诱导培养基（NIM）用50ml。
- 一旦细胞在NIM，有一半的介质应更换每一天。应该变得足够大，以在那里他们将下沉到自己的50毫升锥形管的底部，几分钟后（没有离心）的聚集体。经过2-3天NIM（D7-D8总），细胞板的准备。层粘连蛋白或牛胎儿血清（FBS），可以被用来帮助细胞附着到板。
- 组织培养处理的数量取决于所需要的6孔板中的细胞密度为每个聚合应该是能够生长在平板上的多个天，而不会接触任何其他。平均来说，从一个细胞T75烧瓶，将产生约4-6 6孔板价值的细胞。
- 如果使用的层粘连蛋白，它在NIM稀释至10-20μg/ ml到涂覆的6孔板中（〜0.5毫升/孔）。涂布后的2-3小时，板到6孔板中（〜20-30的总量每孔）的细胞聚集。后聚集附加，添加1.5毫升的NIM。
- 如果使用FBS，制备90％的NIM和10％FBS（1.5毫升/孔）的混合物。的细胞，每孔加入1.5毫升中，轻轻摇动板来回传播的聚集，使细胞附着在孵化器的O / N。第二天早上一定要改变介质（2毫升/ NIM）删除FBS。
- 经过一两天的电镀，每个聚集会蔓延到形成单分子膜。中心在一两天内，这些细胞形态出现类似的柱状细胞（拉长）。在此期间，改变NIM每一天。有些PSC线（尤其是LY IPSC），可能会形成柱状细胞的效率较低。如果发生这种情况，除了在第2阶段的BMP和TGF的抑制剂（Dorsomorphin 29，2μMSB431542 19），的能有所帮助。
- 大约14-17天，柱状细胞会出现更加紧凑。有时，这些细胞形成，可见肠腔内的隆起或环。除了 柱状形态，在此阶段的细胞表达神经上皮的标记物，如PAX6和SOX1 12,26。
- 的隔离就可以开始之前，必须先检查，以确定是否有任何非神经上皮细胞的细胞。可以利用的客观指标，以指示非神经上皮菌落。然后可以消除刮了一套吸头。
3。在前脑祖细胞的生成（D17-D24）
- 菌落的中心包含神经上皮细胞，和应分离的集落的其余部分的。这是可以做到使用微管和过滤，无菌1毫升移液枪枪头。当少量的压力被施加到的菌落的中央部，它通常很容易地升空。要小心不要让外部分的殖民地脱离。如果中心固执，不会脱落在他们自己的，他们可以被删除，他们在无菌罩在显微镜下用针切除。转移到一个15毫升的试管的菌落的中心部，和自旋在200×g离心2分钟。
- 介质应该吸气的细胞。两个板价值的细胞可以被转移到一个非组织培养处理的T25烧瓶中含有10毫升的NIM与B27的添加（不包括维生素A，1:50）。使用5-10毫升培养基，每一个板的细胞。
- 当细胞被查看过翌日，他们应该有一个球体状外观。这些细胞转移到一个新的烧瓶中（在存在的NIM和B27，1:50）是必要的，因为它往往是周边小区忙里偷闲，附着在烧瓶的底部。
- 然后悬浮培养的神经球一个星期用NIM补充B27（1:50）。为了促进细胞的耐力和增殖，环AMP（cAMP，1μM）以及胰岛素生长因子（IGF-1，10毫微克/毫升），可以添加到培养基中悬浮培养过程中。此时，神经球包含在前脑祖细胞（FOXG1 +）和准备终末分化的盖玻片的培养皿上。
4。进一步分化为大脑（D25 +）
- 准备的poly-ornithine/laminin涂布盖玻片（24孔板），电镀细胞。盖玻片首先清除，然后，涂覆有伎俩-鸟氨酸（0.1毫克/毫升，37℃下，O / N，并储存在冷冻机）。
聚鸟氨酸涂层：- 消毒盖玻片：在将盖玻片烧杯中含有硝酸，并轻轻摇动的通风柜中一小时。下运行至少15分钟，去离子水，倒出来的硝酸，用去离子水冲洗几次，并留下盖玻片。放置在95％乙醇和盖玻片要么振摇30分钟（立即如果使用），或存储在乙醇中，在RT。
- 在无菌罩中，倒入含有灭菌盖玻片的6孔板中的盖的50ml管中的内容。用灭菌镊子，拿起一个盖玻片的时间，并设置在一个单一的24孔板直立。如此重复，各孔有盖玻片。
- 他们完全干燥后，请点选板，直到的盖玻片已经落空，每孔。下一步加入100μl聚鸟氨酸（0.1毫克/毫升的无菌蒸馏水2 O），每个盖玻片和孵化板O / N，37°C。
- 第二天，取出板从培养箱中，并让他们冷却至室温。吸液聚-鸟氨酸每个盖玻片（从边缘吨他盖玻片）确保在这个过程中不要触摸或划伤盖玻片。允许盖玻片洗涤前干燥约30分钟。
- 加入1毫升无菌蒸馏水2 O，每孔，让我们坐了10分钟，从每口井的水吸出。重复清洗步骤两次。后板完全干燥，（休假覆盖在引擎盖）将盖子上，盖上铝箔，并储存在-20°C
- 与层粘连蛋白涂覆盖玻片，神经分化培养基和层粘连蛋白（终浓度为20微克/毫升）的混合物中加入50μl的每个聚-鸟氨酸处理盖玻片小心只有触摸盖玻片本身（的液体和不漏关闭）。在37°C孵育1-2小时，然后准备附件的细胞。
- 准备的poly-ornithine/laminin涂布盖玻片（24孔板），电镀细胞。盖玻片首先清除，然后，涂覆有伎俩-鸟氨酸（0.1毫克/毫升，37℃下，O / N，并储存在冷冻机）。
- 收集和神经球在200 XG离心2分钟在15毫升的试管。吸液上清液。 <李>
- 冲洗DMEM-F12细胞的细胞再次离心。如果神经球太大正确附加，它们可以是在此步骤中与Accutase分离。
- 如果使用Accutase：洗涤后的细胞用DMEM-F12中，神经球解离的通过添加Accutase（〜2毫升）和3分钟，在37℃下孵育细胞的小簇。接下来，添加相同量的胰蛋白酶抑制剂（〜2毫升）和离心处理，以使细胞在200×g离心3分钟。然后，将细胞重新悬浮在NDM破碎使用P200的吸移管。小群，然后镀上预包被的盖玻片。
- 吸干关闭大多数的培养基中，并将其放置到6厘米的陪替氏培养皿上的细胞在介质上，以便选择它们变得更容易几滴的。新增约4-5神经球到每个预包被的盖玻片。有没有必要第一吸入关闭的层粘连蛋白。
- 让我们的神经球贴壁至少2-4小时。一旦他们有了一个ttached，更介质（0.5毫升/盖玻片）应予以补充。它应该包括有B27（1:50）的神经分化培养基中，cAMP（1μM），和神经营养因子（BDNF，GDNF，和胰岛素样生长因子，所有在10纳克/毫升）。此时介质的一半可以隔日更换，这些细胞可以维持数月。
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Representative Results
在这里，一个协议来区分人类安全公司到端脑谷氨酸能神经元通过几个关键步骤：PSC的聚集体的形成，神经上皮细胞的诱导，在前脑祖细胞的生成，这些祖细胞的终末分化的成端脑的神经元（ 图1）具有被描述。此系统是稳健的和有效率的，在端脑祖细胞和谷氨酸能神经元的生成。作为一个例子（ 图2），未经此外caudalizing因素，胚胎干细胞分化为神经系27。在24天的分化，神经前体的大部分阳性为FOXG1（一种转录因子表达的端脑），但具有负HOXB4（后脑和脊髓细胞的标记物）端脑祖细胞成功地生成（ 图2D）。这些在前脑祖细胞p ossess背侧的表型，如所指示的表达PAX6（背祖细胞所表达的标记）（ 图2E），但不Nkx2.1的（腹侧祖细胞的标记）（ 图2F）。经过进一步的分化，这些在前脑的背祖细胞分化成谷氨酸能神经元，这是积极的谷氨酸的标记TBR1（约80％）27。神经元染色阳性TBR1的人也阳性神经元的标记物βIII-微管蛋白（ 图2G）或微管相关蛋白2（MAP2， 图2H）。这些细胞还表达囊泡膜谷氨酸转运体1（VGLUT1），成熟的谷氨酸能神经元的标记物，表明有效地产生端脑谷氨酸能神经元培养物（ 图2I）。
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图1。神经细胞的分化过程示意图时间表。
图2。图片突出显示细胞在神经细胞的分化过程中的几个关键阶段。（A）人类胚胎干细胞培养4天。相位图像，示出了形成的ESC聚集体（B）和（C）的神经上皮细胞。在24天的NE细胞从胚胎干细胞分化后，大部分为FOXG1 +，但HOXB4 - （D）。 PAX6端脑的祖（FOXG1 +）+（E），但Nkx2.1的- （F）1个月后的分化。经过两个额外的盖玻片上的细胞分化的周（共6周），其中大多数是染色阳性谷氨酸的标记TBR1（G，H），以及神经元的标记物βIII-微管蛋白（G）和微管相关蛋白2（H）。经过八周的分化，细胞阳性的成熟谷氨酸的的标记，VGLUT1（I）。比例尺：100微米（A），50微米（BI）。 （DI已经适应从我们以前出版的27许可）。
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Discussion
在神经细胞分化过程中有几个关键的步骤。重要的是要确保人的产品分成合同，因为否则的细胞是多能干细胞，可能已经偏向成为非神经元谱系。这可以通过以下的确认染色与多能性的标记物，如即Oct4，Sox2基因，Nanog基因，和的Tra-1-60 1-3的抗人类安全公司。如果人类安全公司不重视很好后传代，ROCK抑制剂（Y27632）可以被添加到帮助。对于那些有困难，保持其细胞多能性，一些潜在的问题是质量/密度的MEF细胞，以及大量的KOSR，被用作可以有变化的批次。虽然MEF饲养细胞已被用于维持在上述协议的安全公司，这种方法也适用于使用无馈线系统培养的安全公司。
当细胞被打破了形成PSC的聚集体，它是重要的限制他们的分离酶的接触只有几分钟（边整）。时间，它需要的iPSCs的前边缘（最多10分钟）是通常比的胚胎干细胞（3-5分钟）更长的长度。这是最佳的分离酶添加到只有人类安全公司的一个板，在一个时间，以确保细胞是不能太长，因为这可能会损害甚至杀死细胞中的酶。所述细胞是中的PSC聚合阶段之后，重要的是，低的密度，以保持细胞。 PSC聚集镀时，密度也是非常重要。这些细胞会在未来几天和扩展板，应采取预防措施，以确保他们不会接触后，他们做强做大。在附件的步骤（2.2），它是必要的，以确保该细胞不具有长时间曝光到该FBS，因为这可能会影响基因表达。分离神经上皮细胞之前，这也是很重要刮开为了产生更纯的非神经元集群的细胞群体。如果有人想是否进入细胞神经元谱系的特点，各种因素可以这样看着Pax6基因或SOX1。 Pax6基因开启神经细胞分化过程中，第10天左右，由2周后分化12,26,30 SOX1接通。
该协议是走在了前列，因为它概括发生的许多步骤，在开发过程中，对人体神经系统的神经分化。如果不使用caudalizing因素（视黄酸，碱性成纤维细胞生长因子），神经上皮细胞分化成端脑的祖细胞，这正好与神经外胚层细胞首先获得喙型在体内发育31。这些在前脑祖细胞具有背型，由于内生性的的Wnt信号dorsalizes的细胞27。此系统产生背祖细胞，然后可以将其进一步分化为谷氨酸细胞第虽然这种细胞类型是非常重要的，它是由绝不是唯一的信元类型，该系统是能够形成。例如，已加入SHH所示以ventralize细胞，使他们能够分化成GABA能细胞27,32。有人甚至表明，这些胚胎干细胞衍生的GABA能神经元可以移植到小鼠体内，他们能够纠正运动功能缺陷，由于大脑病变32。由于协议，本文中演示的经过逐步检查站的工具，它提供了一个广泛的细胞内产生对人体神经系统不仅限于我们的认识的发展和我们的想象。
无论是从基础科学和临床角度讲，人类的神经元的能力，形成从产品分成合同门打开大量。尸检组织来源有限，质量也有所不同，，而人PSC分化的使研究人员能够产生一个供应是无限的，一致的细胞一起工作。随着诱导式多能性干细胞（IPSC的）技术1,3,33,34的到来，现在是可行的胚胎干细胞样细胞从病人的成纤维细胞，包括那些与各种疾病35-38。如图28本集团，以及许多其他iPSC的神经元从成功的一代一直是，并将继续是一个独特的和有用的工具后，一直在寻求人类疾病模型和发展。此外，几组已示PSC衍生的神经元可以模拟疾病的进程36,37,39-42的某些方面，因此，可以利用筛选治疗化合物43。这特别是令人鼓舞的，因为没有良好的模型系统，以测试对于中枢神经系统的候选药物，只有约8％的人已被证明是临床上有效的44。然而，这种方法和其他人一样可以有助于大大提高日是数字。
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Disclosures
作者宣称，他们没有竞争的金融利益。
Acknowledgments
作者想感谢Y.笹井，慷慨提供FOXG1抗体。这项工作是由康涅狄格州干细胞研究资助（08-SCB-UCHC- 022和11-SCB24）和痉挛性截瘫基金会。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's modified eagle medium with F12 nutrient mixture (DMEM/F12) | Gibco | 11330-032 | |
| Knockout Serum Replacer | Gibco | 10828-028 | |
| L-glutamine (200 mM) | Gibco | 25030 | |
| Non Essential Amino Acids | Gibco | 1140-050 | |
| 2-Mercapt–thanol (14.3 M) | Sigma | M-7522 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| N2 | Gibco | 17502-048 | |
| B27 | Gibco | 12587-010 | |
| Heparin | Sigma | H3149 | |
| Poly-L-ornithine hydrobromide (polyornithine) | Sigma | 116K5103 | |
| Laminin (human) | Sigma | L-6274 | |
| Laminin (mouse) | Invitrogen | 23017-015 | |
| FBS | Gemini | 100-106 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A-7906 | |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | |
| Collagenase | Invitrogen | 17104-019 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
| ROCK Inhibitor | Stemgent | 04-0012 | |
| SB431542 | Stemgent | 04-0010 | |
| Dorsomorphin | Stemgent | 04-0024 | |
| Fibroblast growth factor 2 (FGF2, bFGF) | Invitrogen | 13256-029 | |
| Trypsin inhibitor | Gibco | 17075 | |
| 0.1% gelatin | Millipore | ES-006-B | |
| Foxg1 antibody | Dr. Y. Sasai | ||
| Hoxb4 antibody (1:50) | Developmental Studies Hybridoma Bank | I12 | |
| Pax6 antibody (1:5000) | Developmental Studies Hybridoma Bank | PAX6 | |
| Nkx2.1 antibody (1:200) | Chemicon | MAB5460 | |
| Tbr1 antibody (1:2000) | Chemicon | AB9616 | |
| vGLUT1 antibody (1:100) | Synaptic Systems | 135302 | |
| Brain derived neurotrophic factor (BDNF) | PrepoTech Inc. | 450-02 | |
| Glial derived neurotrophic factor (GDNF) | PrepoTech Inc. | 450-10 | |
| Insulin growth factor 1 (IGF1) | PrepoTech Inc. | 100-11 | |
| Cyclic AMP (cAMP) | Sigma | D-0260 | |
| Sonic hedgehog (SHH) | R&D | 1845-SH | |
| 50 ml tubes | Becton Dickinson (BD) | 352098 | |
| 15 ml tubes | BD | 352097 | |
| 6 well plates | BD | 353046 | |
| 24 well plates | BD | 353047 | |
| T25 flasks (untreated) | BD | 353009 | |
| T75 flasks (untreated) | BD | 353133 | |
| Coverslips | Chemiglass Life Sciences | 1760-012 | |
| 6 cm Petri dishes | BD | 353004 | |
| 9'' glass pipetes | Fisher | 13-678-20D | |
| Steriflip filters (0.22 μM) | Millipore | SCGP00525 | |
| Stericup filters 1,000 ml (0.22 μM) | Millipore | SCGPU10RE | |
| Phase contrast microscope (Observer A1) | Zeiss | R2625 | |
| Carbon dioxide incubator (Hera Cell 150) | Thermo Electron Corporation | ||
| Biosafety hood (Sterilgard III Advance) | The Baker Company | ||
| Centrifuge (5702 R) | Eppendorf |
References
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