Summary
Este procedimiento produce neuronas telencefálicas pasando a través de los puntos de control que son similares a los observados durante el desarrollo humano. Las células se dejan a diferenciarse espontáneamente, están expuestas a factores que los empujan hacia el linaje neural, están aislados, y se sembraron sobre cubreobjetos para permitir la diferenciación terminal y la maduración.
Abstract
Aquí, un procedimiento por etapas para generar eficientemente telencefálicas neuronas glutamatérgicas a partir de células madre pluripotentes (PSC) se ha descrito. El proceso de diferenciación se inicia rompiendo las PSCs humanos en terrones que redondear hacia arriba hasta formar agregados cuando las células se colocan en un cultivo en suspensión. Los agregados se hacen crecer entonces en un medio de hESC 1-4 días para permitir la diferenciación espontánea. Durante este tiempo, las células tienen la capacidad de convertirse en cualquiera de las tres capas germinales. De día 5-8, las células se colocan en un medio de inducción neural para empujarlos en el linaje neural. Alrededor de 8 días, las células se dejan adherir a placas de 6 pocillos y se diferencian durante el cual la forma células neuroepiteliales. Estas células neuroepiteliales se puede aislar a día 17. Las células entonces se puede mantener como neuroesferas hasta que estén listos para ser chapada en cubreobjetos. El uso de un medio básico sin ningún factor de caudalizing, células neuroepiteliales son specified en los precursores telencefálicas, que luego pueden diferenciarse también en dorsal progenitores telencefálicas y neuronas glutamatérgicas eficiente. En general, nuestro sistema proporciona una herramienta para generar neuronas glutamatérgicas humanos para los investigadores para estudiar el desarrollo de estas neuronas y las enfermedades que les afectan.
Introduction
Las células madre pluripotentes (PSC), incluyendo tanto las células madre embrionarias humanas (hESCs) y células madre pluripotentes inducidas (iPS), tienen la capacidad de generar cualquier tipo de célula en el cuerpo, incluyendo las neuronas 1-3. Diferenciación dirigida de diversos subtipos neuronales de los CRP humanos es la clave para la aplicación de estas células en la medicina regenerativa. La generación de funcionales subtipos neuronales durante el desarrollo es un proceso complejo que implica la inducción de linaje neuronal, la especificación de los progenitores regionales a lo largo del eje rostro-caudal, y la diferenciación de tipos de neuronas post-mitóticas de los progenitores 4,5 regionales. A partir de 2001, varios sistemas se han establecido para generar linaje neural de hESCs, que han proporcionado una plataforma para la posterior generación de subtipos neuronales 6,7. Sobre la base de los principios de desarrollo, varios tipos de neuronas, como las neuronas espinales motor 8-12, mesencéfalo dopneuronas aminérgicos 13-15, y células de la retina neural 16,17 se han especificado de manera eficiente PSCs humanas. Esto se realizó mediante la aplicación de morfógenos críticos que son importantes para la especificación de estos tipos de neuronas durante el desarrollo in vivo. Otros protocolos también se han desarrollado para promover la diferenciación de hESCs en neuronas usando cualquiera de los factores adicionales 18-20, tales como pequeñas moléculas o mediante el cultivo conjunto con otros tipos de células para ayudar a promover la diferenciación 21.
El neocórtex humano está muy desarrollado y contiene muchos tipos de células, incluidas las neuronas glutamatérgicas que desempeñan un papel importante en el aprendizaje, la memoria y la función cognitiva 22,23. El primer paso en la generación de neuronas glutamatérgicas en cultivo es para especificar células progenitoras telencefálicas. Yoshiki Sasai del grupo por primera vez la diferenciación dirigida de precursores telencefálicas de ratón CES (mESCs) utilizando una suspensio libre de sueron cultivo en presencia de DKK1 (que inhibe la señalización de Wnt), así como LeftyA (que inhibe la señalización nodal) 24. Posteriormente, varios grupos incluyendo el nuestro también han informado de la especificación de precursores telencefálicas de PSCs humanos en suero libre de mediano 25-27. La generación de los precursores de los CRP humanos telencefálicas no requiere el uso de morfógenos exógenas y la eficiencia en la generación de estos precursores es mucho mayor que la de mESCs 26,27. Aquí, un sistema químicamente definido para la inducción neural que estaba bien establecida por el grupo de Zhang 7 se ha descrito. Sin la adición de factores exógenos caudalizing, este protocolo eficiente genera precursores telencefálicas de PSCs humanos 27. Estos progenitores entonces se pueden diferenciar en progenitores dorsal o ventral mediante la regulación de la señalización de Wnt y sonic hedgehog (SHH). Las células progenitoras más dorsales pueden diferenciarse en neuronas e glutamatérgicafficiently 27. Además, este protocolo también funciona bien para la generación de neuronas glutamatérgicas de humano iPSCs 28, que permite la generación de pacientes específicos de neuronas que se pueden utilizar para estudiar el mecanismo de acción, así como terapias potenciales para una gran variedad de enfermedades . Por otra parte, nuestro sistema también proporciona una plataforma para explorar el desarrollo y la especificación de los diversos tipos neuronales en el telencéfalo.
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Protocol
1. Generación de agregados humanos de células madre pluripotentes (D1-D4)
- Las células madre pluripotentes se cultivan en fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) alimentadores en presencia de medio suplementado con hESC factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF, 4 ng / ml). Después de 5-7 días en cultivo, cuando las colonias son grandes, pero todavía no diferenciado, que están listos para el siguiente paso.
- La primera solución enzimática debe estar preparado. En un tubo de 50 ml, se disuelve el dispasa (o colagenasa) a 1 mg / ml de concentración en medio DMEM/F12. Ya que estas soluciones mezclar mejor cuando se calienta, se coloca el tubo que contiene el medio y la enzima en un baño a 37 ° C durante 10-15 min y después esterilizar utilizando un filtro de Steriflip.
- Aspirar fuera el medio de las células, enjuáguelos con DMEM/F12, y aspirar esto fuera así. Añadir 1 ml de dispasa a cada pocillo y colocar en la incubadora durante 3-5 min para hESCs (hasta 10 min para iPSCs). Mira las células bajo el microscopio, cuandolos bordes se doblen ligeramente hacia arriba / mirar un poco más oscuro, las células están listos para el siguiente paso. Lo mejor es comprobar que las células después de 3 min y ponerlos de nuevo en caso necesario. Cuando se utiliza este protocolo para la primera vez, es mejor empezar con una sola placa de células en un momento, ya que es importante para eliminar las células de la dispasa lo más rápidamente posible.
- Aspirar fuera de la dispasa de las células. Suavemente (las células son muy vulnerables en esta etapa y se desprenderá de la placa con relativa facilidad) añadir 1,5 ml de DMEM/F12 medio a cada pocillo para enjuagar el dispasa. Aspirar fuera de la DMEM/F12 y añadir 1,5 ml de medio de células madre a cada pocillo.
- Para separar y romper las células, coloque la punta de una pipeta de vidrio de 10 ml hacia la esquina inferior derecha de un pozo (tocando las células) y pasar la pipeta hacia arriba y hacia abajo (verticalmente) - la cámara de calderas debe estar hacia arriba en las proximidades a la carrera hacia abajo procedimiento. Una vez que el otro lado de la bien se alcanza, repetir en la horizontal extremacción.
- Una vez que todas las células están en suspensión, colocarlos en tubos de 15 ml y centrifugar de ellos a 200 xg durante 2 min. Debe haber un pellet de células en la parte inferior del tubo. Aspirar el medio de apagado desde encima de la pastilla.
- El tamaño del matraz de cultivo de células que se deben utilizar para mantener los agregados en depende de la cantidad original de células. Para 6 pozos (1 placa) de hESCs, uno no tejido tratadas con cultivo matraz T75 con 50 ml de medio de células madre debe ser utilizado. Transferir las células a partir del paso 1,6 en el matraz y se incuba a 37 ° C.
- Con el fin de deshacerse de los desechos de células, el medio celular y el frasco debe ser reemplazado aproximadamente 12 horas más tarde. Para ello, coloque todos los medios / células en un tubo de 50 ml, girar las celdas hacia abajo (200 xg durante 2 min), y aspirar el medio de edad. A continuación, añadir 50 ml de medio fresco a las células madre, las células y el lugar en un nuevo frasco T75. Las células pueden ser alimentados diariamente siguiendo este mismo procedimiento (hasta el día 5).
- Transferir las células / medio a un tubo de 50 ml y centrifugar las células durante 2 minutos a 200 x g. A continuación, aspirar el sobrenadante, y transferir las células a una nueva (no tratadas con cultivo de tejido) matraz T75 con 50 ml de medio de inducción neural (NIM).
- Una vez que las células están en NIM, la mitad del medio se sustituye cada dos días. Los agregados deben ser lo suficientemente grande para donde se hunden hasta el fondo de un tubo cónico de 50 ml por sí solos después de unos minutos (sin centrifugación necesario). Después de 2-3 días en NIM (D7-D8 total), las células deben estar listos para la placa. La laminina o de suero fetal bovino (FBS) puede ser utilizado para ayudar a las células se unen a las placas.
- El número de cultivo de tejidos tratados placas de 6 pocillos que se necesitan depende de la densidad de las células en cada agregado debe ser capaz de crecer en la placa durante varios días más sin tocar ninguno de los otros. Por término medio, las células de unT75 frasco producirá alrededor de 4-6 placas de 6 pocillos valor de las células.
- Si se utiliza la laminina, diluirlo en NIM a 10-20 g / ml para recubrir el 6-así placa (~ 0,5 ml / pocillo). Después del recubrimiento durante 2-3 h, agregados de células en placas de 6 pocillos (~ 20-30 agregados por pocillo). Después de que los agregados han unido, añadir 1,5 ml de NIM.
- Si se utiliza FBS, preparar una mezcla de 90% NIM y FBS 10% (1,5 ml / pocillo). Añadir 1,5 ml de medio con las células a cada pocillo, agitar suavemente la placa de un lado a otro para esparcir los agregados, y permitir que las células se unan O / N en una incubadora. Asegúrese de cambiar el medio (2 ml / pocillo de NIM) a la mañana siguiente para quitar el FBS.
- Después de un día o dos de ser chapado, cada agregado se extiende para formar una monocapa. Dentro de un par de días, los centros de la mayoría de estas células morfológicamente tendrá un aspecto similar a las células columnares (alargada). Durante este período, el NIM cambiar cada dos días. Algunas líneas PSC (especially IPSC), pueden formar células columnares con menos eficiencia. Si esto sucede, la adición de BMP y TGF inhibidores (Dorsomorphin 29, SB431542 19 a 2 mM) durante la etapa 2 puede ser útil.
- Alrededor de los días 14-17, las células columnares aparecerá más compacto. A veces, estas células forman crestas o anillos visibles con luz interior. Además de la morfología columnar, las células en esta etapa expresan marcadores neuroepiteliales, tales como PAX6 y 12,26 SOX1.
- Antes de que el aislamiento puede comenzar, uno primero debe examinar las células para determinar si hay células presentes no neuroepiteliales. Un marcador de objetivo puede ser utilizada para indicar las colonias no neuroepiteliales. Estos pueden ser eliminados al quitarlas con una punta de pipeta.
3. Generación de Progenitores telencefálicas (D17-D24)
- Los centros de las colonias contienen las células neuroepiteliales, y deben ser aislados del resto de la colonia. Esto se puede hacer utilizandouna micropipeta estéril y 1 ml de filtrado punta de la pipeta. Cuando una pequeña cantidad de presión se aplica a la porción central de la colonia, que generalmente se levanta con bastante facilidad. Tener la precaución de no dejar que la porción exterior de la colonia separar también. Si los centros están siendo terco y no se caen por sí solos, pueden ser removidos por escisión de ellos con una aguja en un microscopio en una campana estéril. Transferir las partes centrales de las colonias a un tubo de 15 ml y centrifugar a 200 xg durante 2 min.
- El medio debe ser aspirado fuera de las células. Dos placas de células valor puede ser transferido a una cultura no-tejido tratado T25 matraz que contenía 10 ml de NIM con la adición de B27 (sin vitamina A, 1:50). Use 5-10 ml de medio por una placa de células.
- Cuando las células se vieron el día siguiente, deben tener una esfera, como la apariencia. Es necesario transferir estas células en un matraz de nuevo (en la presencia de NIM y B27 1:50,), ya que es a menudo las células periféricasque colarse y se adhieren a la parte inferior de la botella.
- El neuroesferas entonces deben cultivarse en suspensión durante una semana utilizando NIM suplementado con B27 (1:50). Con el fin de promover la resistencia y la proliferación celular, el AMP cíclico (AMPc, 1 mM), así como factor de crecimiento de insulina (IGF1, 10 ng / ml) puede ser añadido en el medio durante el cultivo en suspensión. En este punto, las neuroesferas contienen progenitores telencefálicas FOXG1 (+) y están listos para ser chapada en cubreobjetos para la diferenciación terminal.
4. Una mayor diferenciación en las neuronas telencefálicas (D25 +)
- Preparar los cubreobjetos recubiertos poly-ornithine/laminin (en placas de 24 pocillos) para placas las células. Los cubreobjetos se limpian primero, y se revisten entonces con estratagema-ornitina (a 0,1 mg / ml, 37 ° C, O / N, y se almacenan en el congelador).
Poly-ornitina revestimiento:- Esterilizar los cubreobjetos: Coloca el cubreobjetos en unavaso de precipitados que contiene ácido nítrico y agitar suavemente en la campana de humos durante una hora. Vierta el ácido nítrico, enjuagar varias veces con agua desionizada, y dejar los cubreobjetos bajo el chorro de agua desionizada durante al menos 15 min. Colocar el cubreobjetos en 95% de etanol y, o bien agitar durante 30 min (si se utiliza inmediatamente) o tienda en etanol a RT.
- En una campana estéril, verter el contenido del tubo de 50 ml que contiene cubreobjetos esterilizados en la tapa de una placa de 6-así. Con unas pinzas esterilizadas, recoger un cubreobjetos a la vez y fijar en posición vertical en un solo pocillo de una placa de 24 pocillos. Repetir de manera que cada pocillo tiene un cubreobjetos.
- Después de que se seque por completo, toque las placas hasta cubreobjetos han caído plana en cada pocillo. Siguiente añadir 100 ml de poli-ornitina (0,1 mg / ml en agua estéril dH 2 O) a cada cubreobjetos e incubar las placas de O / N a 37 ° C.
- El día siguiente, retirar las placas de la incubadora y dejar que se enfríe a temperatura ambiente. Aspirar poli-ornitina fuera de cada cubreobjetos (desde el borde de tél cubreobjetos), asegurándose de no tocar ni rayar los cubreobjetos en el proceso. Permitir que los cubreobjetos se seque durante aproximadamente 30 min antes de lavar.
- Añadir 1 ml estéril dH 2 O a cada pocillo, dejar reposar durante 10 min, y se aspira el agua de cada pocillo. Repita este paso de lavado dos veces más. Después de que las placas se seque por completo, (licencia cubre fuera de la campana) colocar las tapas, cubra con papel de aluminio, y se almacena a -20 ° C.
- Para recubrir los cubreobjetos con laminina, añadir 50 l de una mezcla de medio de diferenciación neural y laminina (concentración final de 20 mg / ml) a cada cubreobjetos de poli-ornitina tratados con cuidado de tener sólo el líquido tocar la propia cubreobjetos (y no derramar off). Incubar ellos a 37 ° C durante 1-2 horas antes de preparar las células para la unión.
- Preparar los cubreobjetos recubiertos poly-ornithine/laminin (en placas de 24 pocillos) para placas las células. Los cubreobjetos se limpian primero, y se revisten entonces con estratagema-ornitina (a 0,1 mg / ml, 37 ° C, O / N, y se almacenan en el congelador).
- Recoger y centrifugar las neuroesferas a 200 xg durante 2 min en un tubo de 15 ml. Aspirar el sobrenadante. <li>
- Enjuagar las células con DMEM-F12 y centrifugar las células de nuevo. Si las neuroesferas son demasiado grandes para fijar correctamente, pueden ser disociados con Accutase en este paso.
- Si se utiliza Accutase: Después de lavar las células con DMEM-F12, las neuroesferas se disocian a pequeños grupos mediante la adición de Accutase (~ 2 ml) e incubando las células a 37 ° C durante 3 min. A continuación, añadir la misma cantidad de inhibidor de tripsina (~ 2 ml) y centrifugar las células a 200 xg durante 3 min. Las células entonces se resuspendieron en NDM y rompe utilizando una pipeta P200. Las agrupaciones pequeñas se pueden pre-chapada en cubreobjetos recubiertos.
- Aspirar fuera de la mayoría del medio y colocar las células en una placa de Petri de 6 cm en unas gotas de medio de manera que la selección de ellos se hace más fácil. Añadir aproximadamente 4-5 neuroesferas a cada cubreobjetos pre-revestido. No hay necesidad para aspirar fuera de la laminina primero.
- Que el neuroesferas adjuntar por lo menos 2-4 horas. Una vez que tienen unattached bien, más a medio (0,5 ml / cubreobjeto) debe ser agregada. Se debe consistir en medio de diferenciación neural complementado con B27 (1:50), cAMP (1 mM), y factores neurotróficos (BDNF, GDNF, y el IGF, todo a 10 ng / ml). En este punto, la mitad del medio puede ser cambiado cada dos días y estas células se pueden mantener durante varios meses.
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Representative Results
Aquí, un protocolo para diferenciar los CRP humanos en telencefálicas neuronas glutamatérgicas a través de varios pasos críticos: la formación de agregados PSC, la inducción de células neuroepiteliales, la generación de los progenitores telencefálicas, y la diferenciación terminal de estos progenitores en neuronas telencefálicas (Figura 1) tiene han descrito. Este sistema es robusto y eficiente en la generación de los progenitores y neuronas glutamatérgicas telencefálicas. Como un ejemplo (Figura 2), sin la adición de factores de caudalizing, las hESCs se diferenciaron en el linaje neural 27. En 24 días después de la diferenciación, la mayoría de los precursores neuronales fueron positivos para FOXG1 (un factor de transcripción expresado por telencéfalo) pero negativo para HOXB4 (un marcador para las células rombencéfalo y la médula espinal), sugiriendo que los progenitores telencefálicas se generaron con éxito (Figura 2D). Estos progenitores telencefálicas p ossess un fenotipo dorsal, como se indica por la expresión de PAX6 (un marcador expresado por progenitores dorsal) (Figura 2E), pero no NKX2.1 (un marcador de células progenitoras ventrales) (Figura 2F). Después de diferenciación, estas células progenitoras dorsales telencefálicas diferenciarse en neuronas glutamatérgicas, que eran positivas para el marcador glutamatérgica Tbr1 (alrededor de 80%) 27. Las neuronas que se tiñen positivo para Tbr1 fueron también positivas para marcadores neuronales tubulina βIII-(Figura 2G) o proteína asociada a microtúbulos 2 (MAP2, Figura 2H). Estas células también expresaron transportador de glutamato vesicular 1 (vGLUT1), un marcador de neuronas glutamatérgicas maduras, lo que sugiere la generación eficiente de telencefálicas neuronas glutamatérgicas en el cultivo (Figura 2I).
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Figura 1. Una línea de tiempo esquema para el proceso de diferenciación neuronal.
Figura 2. Imágenes destacando las células durante varias etapas críticas durante la diferenciación neuronal. (A) CME humanas se cultivaron durante 4 días. Las imágenes de fase que muestra la formación de agregados de ESC (B) y células neuroepiteliales (C). A los 24 días después de la diferenciación de hESCs, la mayoría de las células eran NE FOXG1 + pero HOXB4 - (D). Los progenitores telencefálicas FOXG1 (+) fueron PAX6 + (E) pero NKX2.1 - (F) después de 1 mes de diferenciación. Después de otros dossemanas (6 semanas en total) de la diferenciación de las células sobre los cubreobjetos, la mayoría de ellos se tiñeron positivas para el marcador glutamatérgica Tbr1 (G, H), así como los marcadores neuronales tubulina βIII-(G) y MAP2 (H). Después de ocho semanas de diferenciación, las células fueron positivas para el marcador madura glutamatérgica, vGLUT1 (I). Barras de escala: 100 micras (A), 50 m (BI). (DI han sido adaptadas de nuestra publicación anterior 27 con permiso).
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Discussion
Hay varios pasos críticos durante el proceso de diferenciación neural. Es importante asegurarse de que los PSCs humanas son pluripotentes, porque de lo contrario las células que ya pueden estar sesgados hacia convertirse en un linaje no neuronal. Esto se puede confirmar mediante tinción de las PSCs humanos con anticuerpos contra marcadores de pluripotencia, tales como Oct4, Sox2, Nanog, y 1-3 Tra-1-60. Si los CPs humanos no se adhieren muy bien después de pases ellos, inhibidor de ROCK (Y27632) se puede agregar para ayudar. Para aquellos que tienen dificultad en mantener su pluripotentes células, algunos problemas potenciales son la calidad / densidad de las células MEF, así como la gran cantidad de KOSR siendo utilizado como puede haber una variación de lote a lote. Aunque las células MEF alimentador se han utilizado para mantener PSCs en el protocolo anterior, este método también funciona para PSCs que se cultivan usando libres alimentador-sistemas.
Cuando las células se dividen para formar los agregados PSC, es importante limlo dispasa su exposición a sólo unos minutos (los bordes se redondeará hacia arriba). La duración del tiempo que pasa antes de los bordes de las iPSCs (hasta 10 min) es generalmente más largo que el de los CES (3-5 min). Es óptimo para agregar la dispasa a sólo una placa de PSCs humanos a la vez para asegurar que las células no están en la enzima durante demasiado tiempo ya que esto puede dañar o incluso destruir las células. Después de que las células están en la etapa de agregado PSC, es importante para mantener las células a una densidad baja. La densidad es también muy importante cuando los agregados son PSC chapado. Estas células se expandirá en el plato durante los próximos días y se deben tomar precauciones para asegurarse de que no va a tocar después de crecer más grande. Durante la etapa de fijación (2,2), es imperativo asegurar que las células no tienen una exposición prolongada a la FBS ya que esto podría afectar a la expresión génica. Antes de aislar las células neuroepiteliales, también es importante que rascar las agrupaciones no neuronales con el fin de producir un más puropoblación de células. Si se quisiera caracterizar si sus células están en el linaje neuronal, varios factores pueden ser visto como Pax6 o Sox1. Pax6 se enciende alrededor de 10 días durante la diferenciación neuronal, y Sox1 vueltas en las 2 semanas después de la diferenciación 12,26,30.
Este protocolo está a la vanguardia de la diferenciación neuronal como recapitula muchos pasos que tienen lugar durante el desarrollo del sistema nervioso humano. Sin el uso de factores caudalizing (ácido retinoico, FGF básico), las células neuroepiteliales eficientemente diferenciar en progenitores telencefálicas, lo que coincide con las células neuroectodermo primera adquisición de un fenotipo rostral durante el desarrollo in vivo 31. Estos progenitores telencefálicas poseen un fenotipo dorsal debido a la señalización de Wnt endógeno que dorsalizes las células 27. Este sistema genera progenitores dorsal que puede diferenciarse adicionalmente en células glutamatérgicas. Si bien este tipo de células es muy importante, es de ninguna manera el único tipo de células que este sistema es capaz de formar. Por ejemplo, la adición de SHH ha demostrado que ventralize las células, lo que les permite diferenciarse en células GABAérgicas 27,32. Se ha demostrado incluso que estas células madre derivadas neuronas GABAérgicas pueden ser trasplantados en ratones y que son capaces de corregir los defectos del aparato locomotor debido a lesiones cerebrales 32. Debido a que el protocolo que se muestra en este artículo pasa por los puntos de control paso a paso, ofrece una herramienta para producir una amplia variedad de células en el sistema nervioso humano que se limita solamente por nuestra comprensión del desarrollo y de nuestra imaginación.
La capacidad para formar neuronas humanas de PSCs abre un gran número de puertas, tanto desde la ciencia básica, así como una perspectiva clínica. Fuentes postmortem de tejidos son limitados y la calidad puede variar, mientras que el humano diferenciación PSC permite a los investigadores para producir unsuministro ilimitado y consistente de células a trabajar. Con la llegada de células madre pluripotentes inducidas (IPSC) 1,3,33,34 tecnología, ahora es factible para obtener como hESC-células de fibroblastos de pacientes incluidos aquellos con diversas enfermedades 35-38. Como se muestra por nuestro grupo 28, así como muchos otros, la generación exitosa de las neuronas de la IPSC ha sido y seguirá siendo una herramienta única y útil para aquellos que han buscado durante mucho tiempo después de que los modelos humanos de la enfermedad y el desarrollo. Además, varios grupos han demostrado que el PSC neuronas derivadas pueden modelar ciertos aspectos del proceso de la enfermedad 36,37,39-42 y por lo tanto puede ser utilizado para cribar compuestos terapéuticos 43. Esto es especialmente alentador porque sin un buen sistema modelo para probar fármacos candidatos para el sistema nervioso central, con sólo el 8% de ellas ha demostrado ser clínicamente efectivo 44. Sin embargo, este método y otros similares podrían ayudar a mejorar dramáticamente ªes el número.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto financieros.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer al Dr. Y. Sasai para ofrecer generosamente el anticuerpo FOXG1. Este trabajo fue apoyado por becas de investigación de Connecticut de células madre (08-SCB-UCHC- 022 y 11 SCB24-) y la Fundación Paraplejia espástica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's modified eagle medium with F12 nutrient mixture (DMEM/F12) | Gibco | 11330-032 | |
| Knockout Serum Replacer | Gibco | 10828-028 | |
| L-glutamine (200 mM) | Gibco | 25030 | |
| Non Essential Amino Acids | Gibco | 1140-050 | |
| 2-Mercapt–thanol (14.3 M) | Sigma | M-7522 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| N2 | Gibco | 17502-048 | |
| B27 | Gibco | 12587-010 | |
| Heparin | Sigma | H3149 | |
| Poly-L-ornithine hydrobromide (polyornithine) | Sigma | 116K5103 | |
| Laminin (human) | Sigma | L-6274 | |
| Laminin (mouse) | Invitrogen | 23017-015 | |
| FBS | Gemini | 100-106 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A-7906 | |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | |
| Collagenase | Invitrogen | 17104-019 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
| ROCK Inhibitor | Stemgent | 04-0012 | |
| SB431542 | Stemgent | 04-0010 | |
| Dorsomorphin | Stemgent | 04-0024 | |
| Fibroblast growth factor 2 (FGF2, bFGF) | Invitrogen | 13256-029 | |
| Trypsin inhibitor | Gibco | 17075 | |
| 0.1% gelatin | Millipore | ES-006-B | |
| Foxg1 antibody | Dr. Y. Sasai | ||
| Hoxb4 antibody (1:50) | Developmental Studies Hybridoma Bank | I12 | |
| Pax6 antibody (1:5000) | Developmental Studies Hybridoma Bank | PAX6 | |
| Nkx2.1 antibody (1:200) | Chemicon | MAB5460 | |
| Tbr1 antibody (1:2000) | Chemicon | AB9616 | |
| vGLUT1 antibody (1:100) | Synaptic Systems | 135302 | |
| Brain derived neurotrophic factor (BDNF) | PrepoTech Inc. | 450-02 | |
| Glial derived neurotrophic factor (GDNF) | PrepoTech Inc. | 450-10 | |
| Insulin growth factor 1 (IGF1) | PrepoTech Inc. | 100-11 | |
| Cyclic AMP (cAMP) | Sigma | D-0260 | |
| Sonic hedgehog (SHH) | R&D | 1845-SH | |
| 50 ml tubes | Becton Dickinson (BD) | 352098 | |
| 15 ml tubes | BD | 352097 | |
| 6 well plates | BD | 353046 | |
| 24 well plates | BD | 353047 | |
| T25 flasks (untreated) | BD | 353009 | |
| T75 flasks (untreated) | BD | 353133 | |
| Coverslips | Chemiglass Life Sciences | 1760-012 | |
| 6 cm Petri dishes | BD | 353004 | |
| 9'' glass pipetes | Fisher | 13-678-20D | |
| Steriflip filters (0.22 μM) | Millipore | SCGP00525 | |
| Stericup filters 1,000 ml (0.22 μM) | Millipore | SCGPU10RE | |
| Phase contrast microscope (Observer A1) | Zeiss | R2625 | |
| Carbon dioxide incubator (Hera Cell 150) | Thermo Electron Corporation | ||
| Biosafety hood (Sterilgard III Advance) | The Baker Company | ||
| Centrifuge (5702 R) | Eppendorf |
References
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