Summary
ودرس مثالي البطانية الطبقة السطحية الكنان السكري / البطانية باستخدام المجهر intravital. المجهر يمثل تحديا تقنيا Intravital في جهاز متحرك مثل الرئة. علينا أن نظهر كيف يمكن استخدام brightfield المجهري الفلورسنت في وقت واحد والبطانية لتقدير سمك الطبقة السطحية في الانتقال بحرية،
Abstract
والكنان السكري البطانية هي طبقة من بروتيوغليكان والجليكوزامينوجليكان المرتبطة بطانة التجويف الأوعية الدموية. في الجسم الحي، والكنان السكري هو رطب للغاية، وتشكيل الطبقة السطحية كبيرة البطانية (ESL) التي تساهم في الحفاظ على وظيفة بطانة الأوعية الدموية. كما الكنان السكري في كثير من الأحيان البطانية الشاذة في المختبر، ويتم فقدان القياسية خلال تقنيات تثبيت الأنسجة، دراسة ESL يتطلب استخدام المجهر intravital. علم وظائف الأعضاء لأفضل تقريبي الجملة الوعائية المجهرية المعقدة للالسنخية، يتم تنفيذ مثالي التصوير intravital الرئوي على الرئة بحرية الحركة. هذه الاستعدادات، ومع ذلك، تعاني عادة من قطعة أثرية الحركة واسعة النطاق. علينا أن نظهر كيف يمكن استخدام مغلقة الصدر المجهر intravital من الرئة الماوس بحرية الحركة لقياس سلامة الكنان السكري عن طريق الاستبعاد من fluorescently ESL التي تحمل علامات عالية الوزن الجزيئي dextrans من سطح البطانية. هذه التقنية غير الجراحية الانتعاش، الأمر الذي يتطلبbrightfield في وقت واحد والتصوير الفلورسنت في الرئة الماوس، ويسمح للمراقبة الطولي للالجملة الوعائية المجهرية تحت الجنبة دون وجود أدلة على إحداث التباس إصابة الرئة.
Introduction
والكنان السكري البطانية هو طبقة من خارج الخلية بروتيوغليكان والجليكوزامينوجليكان المرتبطة بطانة الأوعية الدموية البطانية. في الجسم الحي، والكنان السكري هو رطب للغاية، وتشكيل الطبقة السطحية كبيرة البطانية (ESL) الذي ينظم مجموعة متنوعة من الوظائف بما في ذلك البطانية نفاذية السوائل 1، العدلات البطاني التصاق 2، وmechanotransduction من السوائل 3 إجهاد القص.
تاريخيا، كان الكنان السكري بالتقدير نظرا لضلال في الاستعدادات خلايا مستنبتة 4 و 5 و تدهورها خلال تثبيت الأنسجة القياسية وتجهيز 6. تزايد استخدام المجهر 7 من intravital (في الجسم الحي المجهري، IVM) وتزامن مع تزايد الاهتمام العلمي في أهمية ESL إلى وظيفة الأوعية الدموية أثناء الصحة والمرض. وESL غير مرئي إلى المجهر الضوئي ولا يمكن وصفها بسهولة فيفيفو، نظرا لنزوع يكتينس الكنان السكري ملزم الفلورسنت تسبب RBC تراص 8 و الصمات الرئوية المميتة (الملاحظات غير منشورة). ولذلك تم تطوير العديد من الأساليب غير المباشرة للاستدلال ESL سمك (، وبالتالي، الكنان السكري سلامة) في غير متحرك الأسرة الأوعية الدموية مثل microcirculations مشمري والمساريقي. هذه التقنيات تشمل قياس الاختلافات في تعميم سرعة microparticle بوصفها وظيفة من المسافة من غشاء بطانة (microparticle velocimetry صورة 9) وكذلك قياس استبعاد الضخمة التي تحمل علامات علامات fluorescently، الأوعية الدموية (مثل dextrans) من سطح البطانية (ديكستران تقنية استبعاد 10، 11). من هذه التقنيات، إلا ديكستران استبعاد قادر على تقدير ESL سمك من القياسات التي أجريت عند نقطة واحدة في الوقت المناسب. في وقت واحد من خلال قياس الاعراض الأوعية الدموية باستخدام المجهر brightfield (أ عرض فيclusive من ESL "غير مرئية") والمجهر الفلورسنت من التتبع الأوعية الدموية استبعادها من ESL، يمكن حساب سمك ESL ونصف الفرق بين الاعراض الأوعية الدموية 2.
استخدام إجراء فوري من سمك ESL هو مناسبة تماما للدراسة من الكنان السكري الرئوي. المجهر Intravital من الرئة هو أمر صعب، نظرا قطعة أثرية هامة الحركة الرئوي والقلبي. التطورات الحديثة في حين تسمح لتجميد الماوس الرئتين في الجسم الحي 12 و 13، تبقى المخاوف بشأن تأثير فيزيولوجي من ركود الرئة. ويرتبط الجمود الرئة مع انخفاض أكسيد النيتريك مما يشير البطانية 14، مما يشير إلى أن مسار يؤثر كل من التصاق الخلايا المتعادلة 15 و الرئة إصابة 16. وعلاوة على ذلك، تجميد مساحة الرئة يعرض المحيطة الحويصلات الهوائية المحمول لقوى القص الضارة (ما يسمى ب "atelectrauma")، وفقا للمفاهيم الكلاسيكية الفسيولوجية للالسنخية الترابط 17.
في عام 2008، وضعت اراتا Tabuchi، فولفغانغ كوبلر وزملاؤه تقنية جراحية السماح للفحص المجهري intravital من الرئة الماوس بحرية الحركة 18. يمكن تبطل قطعة أثرية الجهاز التنفسي الناجمة عن هذه التقنية باستخدام التصوير عالية السرعة، بما في ذلك قياس وقت واحد من brightfield المجهري والفلورية. في هذا التقرير، إلا أننا بالتفصيل كيف يمكن استخدام التصوير الفوري استبعاد ديكستران لقياس سمك ESL في دوران الأوعية الدقيقة تحت الجنبة من الرئة الماوس بحرية الحركة، في الجسم الحي. ويمكن تعديل هذه التقنية بسهولة لتحديد وظيفة الكنان السكري على وجه التحديد، فإن قدرة على حالها ESL لاستبعاد العناصر المنتشرة من سطح البطانية. وقد استخدمنا هذه التقنيات في الآونة الأخيرة لتحديد أهمية سلامة ESL الرئوي في تطوير إصابة الرئة الحادة الأمراض الالتهابية الجهازية خلال مثل الإنتان 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد أنابيب الجراحية، القسطرات الأوعية الدموية، والصدر الجدار نافذة
- Intravital المرحلة المجهري. نحن العرف صنع زجاج شبكي مرحلة التي تقوم عليها الماوس تخدير تقع خلال المجهر. هذه المرحلة تستوعب كل من 15 سم 10 سم من البلاستيك المرن قطع المجلس (الذي تقوم عليه خلال الماوس يكمن تحريض التخدير، والتنسيب القصبة الهوائية، والقسطرة الوريدية)، وكذلك عنصر التدفئة مماثلة في الحجم (الموجود تحت لوح التقطيع).
- إعداد الماوس أنبوب فغر الصدر (الشكل 1). يتم قطع بطول 10 سم من أنابيب PE 50 (، الداخلية Intramedic قطر 0،58 ملم، وقطرها الخارجي 0،965 ملم). يتم إرفاق واحدة من نهاية إلى نهاية حادة من إبرة مقوسة قياس 23؛ سيتم استخدام هذه الإبرة لتمرير أنبوب من خلال جدار الصدر (داخل خارج →) قبل إغلاق نافذة الصدري.
نهاية البعيدة للأنابيب (1.5 سم في الطول، مقابل 23 مقياس المرفقوثقب الإبرة بشكل متكرر) بواسطة إبرة قياس 30، خلق "موانئ الجانب" لتسهيل تطلع فعالة من الهواء داخل الصدر.
ثم يتم فصل هذا الجزء عن بقية منوفذة من الأنبوب بواسطة حلقات كفافي العديد من خياطة الحرير 04:00، وهذه الحلقات سوف تكون بمثابة "سدادة"، في نهاية المطاف ترسيخ الطول 1،5 منوفذة جزء داخل تجويف الصدر. - القسطرة الوريدية الوداجي. يتم قطع أطوال الطول اثنين 15 من 10 أنابيب PE (، Intramedic الداخلية بقطر 0،28 ملم، وقطرها 0،61 ملم الخارجي). يتم استخدام مشرط لشطبة نهايات الأنبوب، وبالتالي زيادة سهولة بزل الوريد. يتم مسح أنابيب عبر حقنة 1 مل تحتوي على 6٪ 150 كيلو دالتون حل ديكستران (في PBS) تعلق على نهاية غير مشطوف من الأنابيب.
- يتم قطع الجدار نافذة إعداد الصدر (الشكل 2). الغشاء البولي فينيل شفاف (جديد كورى التفاف، Kuresha، طوكيو) في شكل بيضاوي (المحور الأكبر 6 سم، 4 سم محور طفيفة). A دائرية 5 مم رقم 1 ساترة (Bellcتم تثبيت س) إلى الغشاء باستخدام α-CYANOACRYLATE الغراء (Pattex flüssig، هنكل، دوسلدورف).
- ويرد أنبوب لتحريض استرواح الصدر ("أنبوب ضربة") A طول 10 سم من أنابيب (القطر الداخلي 3 مم، 5 مم القطر الخارجي) لحقنة 5 مل؛ سيتم استخدام الطرف الآخر لإدخال الهواء إلى القفص الصدري الحيوان قبل جدار الصدر engraftment النافذة.
- حقنة لغمر المياه من الهدف. وترد إبرة قياس 23 إلى 30 مل حقنة تحتوي على الماء المقطر. وقلل من رأس الإبرة (باستخدام ملف المعدنية) وذلك لمنع الأضرار التي لحقت الهدف.
2. الماوس التخدير
- A الماوس تخدير مع خليط من الكيتامين (10 ملغ / مل) وزيلازين (2 ملغ / مل)، الغشاء البريتونى تدار في جرعة من 8 ميكرولتر لكل غرام من وزن الجسم الماوس. التخدير يحدث خلال 3 - 6 دقائق وينبغي ألا تعوق التنفس من تلقاء أنفسهم.
- باستخدام الحلاقة الكهربائية، ويحلقالحلق والصدر والبطن، والجانب الأيمن من الفأرة.
- باستخدام الشريط، تأمين الماوس إلى لوحة بلاستيكية رقيقة القطع. ينبغي للرئيس أشر بالفأرة نحو المشغل (الشكل 3). التوتر التي تقدمها لطيف حلقة من مرور خياطة تحت الأسنان العلوية للحفاظ على التمديد يخدم الرأس. يتم وضع قطع المجلس على وسادة التدفئة، والحفاظ على الماوس euthermia خلال القصبة الهوائية ووضع القسطرة الوريدية.
- الرطب مع الإيثانول المناطق حلق 100٪.
- تأكيد التخدير الكافي مع قليل الذيل / مخلب. إذا المضي قدما استجابة الحد الأدنى لها، وتوفير البلعة إضافية من الكيتامين / زيلازين تخدير كاف إن لم يكن.
3. القصبة الهوائية
- يتم إجراء شق 1 سم فوق الحلق. يتم تشريح النسيج الضام الأساسية، ويتم فصل الغدد اللعابية وتنعكس أفقيا. ومقطوعة العضلة الأمامية قصي لامي على الفور إلى القصبة الهوائية.
- وتقدم حلقة من الدرز تحت ال 04:00ه القصبة الهوائية (الشكل 4). ثم يتم قطع الحلقة، وخلق خطين منفصلين للخياطة الكامنة وراء القصبة الهوائية. سيتم استخدام خياطة الذيلية لتأمين أنبوب القصبة الهوائية، وسيتم استخدام خياطة الجمجمة لتوفير التوتر في القصبة الهوائية القصبة الهوائية أثناء التنسيب.
- باستخدام اثنين من اصابعه، واستوعب خياطة العليا ويطبق التوتر طيف على القصبة الهوائية. يتم إجراء شق أفقي في القصبة الهوائية العليا والسفلى بين الغرز. وهذا ينبغي أن شق عبور ما يقرب من ثلثي محيط القصبة الهوائية. يتم إدخال أنبوب القصبة الهوائية ذات حواف (هارفارد جهاز، القطر الخارجي 1.22 مم) في القصبة الهوائية البعيدة وتأمين في مكانه باستخدام خياطة الذيلية القصبة الهوائية.
- توصيل القصبة الهوائية لجهاز التنفس الصناعي الذي تسيطر حجم الحيوانات الصغيرة (Inspira، جهاز هارفارد)، والتهوية الماوس مع الأكسجين 40٪ من وحي و 9 مل / كجم حجم المد والجزر (إعدادات الأمثل للحفاظ على الأوكسجين الكافي / التهوية في مختبرنا). POSIلا tive بدأت نهاية الزفير الضغط (PEEP) في هذه المرحلة. من ملاحظة، يجب أن يكون الأمثل لضبط التنفس الصناعي داخل المختبرات الظروف الفريدة الفردية. ويمكن استخدام أطوال مختلفة من أنابيب زائدة (موسط بين أنبوب التنفس الصناعي Y-موصل والقصبة الهوائية) لضبط الفضاء الميت، وضمان التهوية السنخية مستقرة لحجم المد والجزر أي اختيار.
4. وريدي قسطرة
- ويمكن تحديد نقطة التقاء الوريد الوداجي في الداخل والخارج من خلال تتبع الفروع البعيدة وريدي قريب. تم العثور على الوداجي الخارجي تحت الغدد اللعابية تنعكس، ويمكن تتبع هذا قريب للعثور على مفترق الخارجية، الداخلية الوداجي.
- استخدام تشريح حادة لطيف لفصل تقاطع الوداجي من النسيج الضام المحيطة.
- باستخدام الخيوط الجراحية 04:00، ربط قبالة عروق الوريد الوداجي الخارجي والداخلي البعيدة (الجمجمة) إلى تقاطع الوداجي.
- إجراء شق صغير في كارينامن مفترق الطرق الوداجي، ويجب أن يكون الحد الأدنى من النزيف.
- قد يكون اثنين القسطرة تقدمت تدريجيا من خلال شق والجذع الوداجي في. بعد الشفط لطيف لضمان عودة الدم، يتم تأمين القسطرة داخل الوريد باستخدام الخيوط الجراحية 04:00.
- القسطرة الوريدية الشريط إلى قطع المجلس لمنع الخلع ضد عرضي.
5. Intravital المجهر الرئة جراحة الماوس (مقتبس من Tabuchi وآخرون 18)
- وقطع المجلس (الذي يحتوي على ضبط النفس، والماوس، وكذلك تخدير وريدي مسجلة القسطرة) وانتقلت إلى المرحلة المجهري intravital، حيث سيتم تنفيذ التدخلات الجراحية المتبقية. يتم وضع مسبار درجة حرارة الجسم، وهذا اجهات مع نظام التدفئة التكيف (الموجود تحت لوح التقطيع)، مما يسمح للصيانة euthermia الماوس.
- ويرد أحد القسطرة الوريدية الوداجي إلى مضخة الحقنة التي توفر الكيتامين (10 ملغ / مل)-زيلازين (2 ملغ / مل)في 200 ميكرولتر مزيج للساعة الواحدة. ويؤكد مرة أخرى باستخدام التخدير الكافي الذيل / مخلب قرصة.
- ويمتد خط الوسط من شق في الرقبة إلى عملية سيفي الشكل، انطلاقا ثم أفقيا إلى الجانب الأيمن (الشكل 5).
- كاو كهربي باستخدام، تتم إزالة الجهاز العضلي الصدر، وفضح القفص الصدري. والحرص على ضمان الإرقاء كاملة.
- عبور hindleg الماوس، اليمنى على الجانب الأيسر أسفل الشريط و. والالتواء الناجمة البطن يدور الصدر قليلا، وتحسين سهولة الجراحة.
- ضع المرحلة بزاوية 45 درجة (الشكل 6)، وهذا يسمح لتحديد المواقع الرئة في الانخفاض بعيدا عن جدار الصدر بمجرد أشعل استرواح الصدر.
- وأدرك الضلع الحادي و1 (الضلع السفلي أكثر) مع ملقط وأثارت؛ يتم الضغط على ملقط المنحني بصراحة تحت الضلع. هذا غشاء الجنب الجداري يفصل من جدار الصدر. يجب أن تبقى unpunctured غشاء الجنب.
- باستخدام أنبوب ضربة وحقنة، هو عرض قسرا جوية ضد غشاء الجنب الجداري. هذا يؤدي إلى تمزق السطح الجنبي واسترواح الصدر دون الإضرار الرئة الأساسية. سوف الرئة الأساسية تقع بعيدا عن جدار الصدر، والسماح لإدخال ملقط كاو كهربي دون الإضرار الرئة. هو عادة انخفاض في حجم المد والجزر التنفس الصناعي غير مطلوب خلال هذه الخطوة.
- باستخدام ملقط كاو كهربي، تشريح الصدر وعضلات جدار تتقاطع الأضلاع ال 5 و 6 / غشاء الجنب الجداري، مما يجعل ~ ثقب دائري 8 ملم في جدار الصدر. من الضروري أن يتم الحفاظ الإرقاء كاملة، عن وجود نزيف سوف تحجب المجهري (الشكل 7).
- استخدام برنامج تشغيل الإبرة، يتم ادخال الانبوب فغر الصدر في صدره ثقب الجدار. ينبغي الإبرة ثقب جدار الصدر والخروج من تجويف الصدر السفلية والجانبية إلى إطار الصدري (الشكل 7). أن تحرص على تجنب ثقب في الحجاب الحاجز. الثم يتم سحبها بلطف أنبوب من جدار الصدر حتى يحدث من المقاومة "سدادة" خياطة يقع على حافة الجزء من الأنبوب منوفذة.
- ضع المرحلة المسطحة.
- إضافة 3 سم H PEEP O 2 إلى التنفس الصناعي للمساعدة في مساعدة الرئة reexpansion.
- يتم وضع الغراء (Pattex هلام، هنكل) محيطي حول نافذة في الصدر. ويرد الغشاء، مع زجاج غطاء تواجه زلة الخارجية لتجويف الصدر. بعناية (ومحيطي) تقريبي الغشاء إلى الغراء باستخدام قضيب من القطن.
- أثناء إجراء مناورة تجنيد الرئة (3 مجلدات المد والجزر التي عرقلت خلال منفذ التنفس الصناعي PEEP)، يتم تطبيق الشفط -3 ملم زئبق إلى أنبوب في الصدر. ينبغي الرئة تقريبي استمرار الغشاء بينما تتحرك بحرية خلال المد والجزر التهوية (الشكل 8).
- وعبرت الرجل الاماميه حق الماوس فوق إلى الجانب الأيسر، مما أدى إلى موقف استلقاء الجانبي الأيسر من الماوس.ويمكن استخدام إسفنجة لوضع أسافين صحيح الماوس بحيث يتم محاذاة نافذة في الصدر مع الغمر الهدف المجهر المياه.
- يتم وضع الماء المقطر على زلة غطاء قبل المجهري، مما يسمح لتصور من الرئة باستخدام الهدف الغمر بالماء. سوف تحتاج إلى المياه بشكل متقطع للتجديد طوال التصوير.
6. قياس الرئوي غشائي سمك طبقة السطحية
- مباشرة بعد إغلاق جدار الصدر، ويدير 500 ميكرولتر FITC-150 المسمى ديكستران كيلو دالتون (6٪ في حل PBS) عن طريق القسطرة الوريدية الثاني (غير التخدير) الوداجي. هذا البلعة بمثابة إنعاش حجم فضلا عن التتبع الأوعية الدموية لقياس ESL. والبلعة ديكستران لا يؤثر التصاق الخلايا المتعادلة أو الرئة تشكيل ذمة 2.
- ويتركز الهدف غمر الماء على انزلاق الغطاء. اختيار الهدف من ذلك هو الضرورية لتصور الفروق الصغيرة في سمك ESL، وnumeri عاليةوهناك حاجة كال الفتحة (> 0.8) مع الحفاظ على 2-3 ملم مسافة العمل (السماح الاختراق من خلال نافذة سطح الرئة والجنبة). نستخدم CFI نيكون 75 LWD 16X (NA 0.8) وCFI 75 LWD 25X (NA 1.1) أهداف لهذا الغرض.
- لقياس سمك بدقة ESL في جهاز متحرك، فمن الضروري أن يتم تنفيذ brightfield وعرض الأوعية الدموية الفلورسنت في وقت واحد. ويمكن تحقيق هذا باستخدام صورة الخائن (عرض مزدوجة، Photometrics) الذي يسمح لالتقاط الضوء المنعكس في وقت واحد الفرق المقابل تدخل (DIC، brightfield) والصور FITC (الشكل 9).
- خلال وقفة 5 ثوانى الشهيق، يتم تنفيذ التصوير المستمر وتسجيلها. في وقت لاحق، قد يكون استعراض هذه الصور لتحديد التركيز في الإطارات.
- باستخدام التركيز في الإطار، تم تحديد microvessels تحت الجنبة (<ميكرون قطر 20)؛ توجد عادة لا يقل عن 3 microvessels على إطار واحد. بعد الانتهاء من التجربة، مدينة دبي للإنترنتويتم قياس FITC-ديكستران بعرض الأوعية الدموية (بواسطة مراقب أعمى) عن طريق حساب متوسط أطوال اعتراض عمودي ثلاثة في microvessel. على افتراض تساوي ESL سمك في كل من حواف السفينة، يمكن تعريف حجم ESL من نصف الفرق بين مدينة دبي للإنترنت وFITC-ديكستران بعرض الأوعية الدموية، كما هو موضح في القسم الممثل النتائج.
- عادة، يمكن إجراء الفحص المجهري للintravital 90 دقيقة> دون أي دليل على إصابة الرئة أو نقص ضغط الدم 2. يجب أن يتم تنفيذ التجارب الأولية لتأكيد الاستقرار الماوس (ضغط الدم، والأوكسجين والتهوية وإصابة الرئة) خلال فترة المراقبة. يمكن إدخال الأدوية التجريبية عن طريق القسطرة الثانية (غير مخدر) الوداجي في أي لحظة أثناء العملية.
7. البديل القياس من السطح الرئوي غشائي النزاهة طبقة
والطبقة السطحية سليمة البطانية وظائف (جزئيا) لاستبعاد circulatعناصر من ال 2 جي سطح البطانية. وبالتالي، يمكن ESL سلامة أن تقاس قدرة عنصر تعميم (مثل الفلورسنت المكروية) للوصول والتفاعل مع جزيئات الخلية التصاق السطح (مثل ICAM-1).
- وتعد مكافحة ICAM-1 المسمى الفلورسنت قبل الجراحة المجهرية. يتم تحضين Streptavidin 0،97 ميكرون المغلفة المجهرية الفلورسنت مع الأجسام المضادة أو السيطرة المعقدة البيروكسيديز نمط إسوي مكافحة ICAM-1 (YN1/1.7.4 استنساخ، 1:50، eBioscience) لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تغسل المجهرية ثلاث مرات وعلقت في PBS في 1 × 9 10 المجهرية لكل مل.
- خلال الفحص المجهري intravital، يتم حقن التعليق المكروية (100 ميكرولتر) في القسطرة الوريدية الوداجي. بعد 15 دقيقة من التداول، يتم التقاط الصور الفلورسنت أكثر من 5 دقائق. وتعتبر المجهرية قادرة على الحركة ل5 دقائق> تمسكا وكميا باستخدام برامج معالجة الصور.
8. قتل رحيم
<ف الطبقة = "jove_content"> بعد الانتهاء من هذا الإجراء، يصرح باستخدامها من قبل تخدير الفئران عن طريق استنزاف ثقب في القلب مباشرة. القتل الرحيم ويؤكد عبر pneumothoraces الثنائية، وبعد ذلك يتم حصاد الرئتين والمفاجئة مجمدة لتحليلها لاحقا.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
والمنهج التجريبي وصفها في الخطوات 1-6 تسمح القبض على إطارات متعددة في وقت واحد من مدينة دبي للإنترنت (brightfield) والصور الفلورسنت. لتحديد سمك ESL، يتم مراجعة الصور المسجلة من قبل المراقب أعمى بعد الانتهاء من البروتوكول التجريبي. باستخدام التركيز في الإطار، تم تحديد microvessels تحت الجنبة (<ميكرون قطر 20)؛ توجد عادة لا يقل عن 3 microvessels على إطار واحد (الشكل 10). باستخدام برامج التحليل صورة (عناصر NIS، نيكون)، يتم قياس عرض الأوعية الدموية (بواسطة مراقب أعمى) عن طريق حساب متوسط أطوال اعتراض عمودي ثلاثة في microvessel. كما ESL غير مرئي لتصوير DIC، بعرض الأوعية الدموية DIC تمتد إلى غشاء بطانة الغشاء البطاني وبالتالي فهي تشمل سمك ESL 9 و 10. في المقابل، تم استبعاد FITC-ديكستران (150 كيلو دالتون) من ESL. وبناء على ذلك، بعرض FITC الأوعية الدموية لا تتضمن ESL سمك. على افتراض تساوي ESL سميكةنيس في كل من حواف السفينة، ويمكن بالتالي حجم ESL يحددها نصف الفرق بين مدينة دبي للإنترنت وFITC-ديكستران بعرض الأوعية الدموية.
قد العديد من المزالق المحتملة التقنية تتداخل مع تفسير النتائج التجريبية. فإن وجود نزيف في مجال المجهر يحجب كل من مدينة دبي للإنترنت والتصور FITC من الجملة الوعائية المجهرية تحت الجنبة، وبالتالي، يجب الحرص على الحصول على الإرقاء (باستخدام كاو كهربي) خلال نافذة الايداع (5.9). بالإضافة إلى ذلك، قد لا reapproximate الرئة إطار الصدري بعد مناورة التوظيف (5.14)، وهذا يشير عادة التصاق كفافي غير كامل للغشاء حول إطار الصدري. يمكن عادة يتم تصحيح هذا عن طريق إعادة استخدام الغراء في جميع أنحاء نافذة الصدري، تليها مناورة تجنيد تكرار الرئة. وأخيرا، لا بد من الحرص على تجنب الحقن في الوريد عرضية من الهواء في الماوس. الصمات الهواء، حتى ولو لم يكن قاتلا صح التعبير، preferenti السفر إلى حليف الرئة nondependent، ومنع FITC-ديكستران نضح من الجملة الوعائية المجهرية (nondependent) تصور تحت الجنبة.
قياس الاعراض ESL يتطلب استخدام وسيلة الخائن الصورة (تكفل في وقت واحد والتصوير DIC الفلورسنت) وكذلك الأهداف المجهر المتخصصة. ويمكن تجنب هذه المطالب المعدات مع بعض التعديلات على بروتوكول لدينا. ويمكن قياس غير مباشر الكنان السكري سلامة من خلال تحديد ESL استبعاد المجهرية يتناقل من سطح السفينة. وجود تدهور ESL، لذلك، يتبين من القبض على زيادة الاوعية الدموية الدقيقة تحت الجنبة من المجهرية التي تستهدف جزيئات الالتصاق سطح البطانية (مثل ICAM-1) (الشكل 11).
الشكل 1.
الشكل 2.
الشكل 3.
الشكل 4.
الشكل 5.
الشكل 6.
الشكل 7.
الشكل 8.
الشكل 9.
الشكل 10. قياس سمك الماوس ESL الرئوي. (أ) في وقت واحد، الممثل التقاط الصور وDIC الفلورسنت من الجملة الوعائية المجهرية الماوس تحت الجنبة (شريط النطاق، 50 ميكرون). يتم قياس عرض Microvessel باستخدام متوسط اعتراض خطي عمودي 3. ويمكن تحديد سمك ESL من نصف الفرق بين مدينة دبي للإنترنت (بما في ذلك ESL) والفلورية (الحصري للESL)microvessel بعرض (ب) تحديد القياسات بدقة DIC تحت الجنبة حدود جدار الوعاء الدموي، كما يتبين من مدينة دبي للإنترنت تقريبا متطابقة والقياسات GFP عرض السفينة التي أجريت في الفئران Tie2-GFP البطانية-الفلورسنت (جاكسون مختبرات). خط متصل يمثل خط الهوية. (ج) يمكن أن يتبع الجملة الوعائية المجهرية تحت الجنبة طوليا، كما يتضح من الفقدان التدريجي لسمك ESL وقع بعد عديد السكاريد الشحمي في الوريد (LPS). ن = 3 الفئران. * P <0.05 بالمقارنة مع الوقت = 0 دقيقة بواسطة ANOVA.
الفيلم 1. يمكن تحديد الكنان السكري من خلال تقييم سلامة للانضمام المكروية مكافحة ICAM-1 داخل الجملة الوعائية المجهرية تحت الجنبة. عالية السرعة المجهري متحد البؤر (نيكون A1R) يوضح تمسكا الفلورسنت المجهرية بعد 45 دقيقة عن طريق الوريد LPS (20 ملغ لكل كيلوغرام من وزن الجسم). علما أن يتناقل المجهرية يمكن أن يكون occasionallذ ينظر دوران الأوعية الدقيقة التي تمر عبر. لتحسين التصور من توطين المكروية (الفلورية الخضراء)، في خطوة كانت سابقة التجهيز الفئران مع 6،1 التتبع الأوعية الدموية TRITC-ديكستران (150 كيلو دالتون، 6٪) بدلا من FITC-ديكستران. انقر هنا لمشاهدة الفيلم .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تتزامن مع التوسع في استخدام المجهر في الجسم الحي، وهناك زيادة التقدير لحجم كل من كبير من ESL وكذلك مساهماته العديدة للعمل الأوعية الدموية. هذه البيانات الناشئة، ومع ذلك، تستمد أساسا من الدراسات من الأوعية الدموية الجهازية. في الواقع، واستخدام المجهر في الجسم الحي في الرئة يمثل تحديا تقنيا، نظرا قطعة أثرية هامة الحركة الرئوي والقلبي.
وقد سمح التقدم التقني الأخيرة عدة لتحقيق الاستقرار في الرئة الماوس المتحركة، وتكفل تطبيق أفضل التقنيات intravital إلى دوران الأوعية الدقيقة الرئوي 12 و 13. هذه النهج، ومع ذلك، يحتمل أن تكون مرتبك من التشعبات فيزيولوجي من الجمود الرئة. كما الرئة بشكل غائي جهاز المعدة للحركة مستمرة، وسوف يغير بشكل حدسي الرئة ركود علم وظائف الأعضاء الرئوي. في الواقع، يرتبط الرئة ركود مع بعض التعديلات في البطانية نitric إشارات أكسيد، طريقا لها عواقب عديدة في الرئة المصب على حد سواء صحية وجرح 14، 16. وعلاوة على ذلك، تجميد منطقة واحدة من المواضيع الرئة المحيطة الحويصلات الهوائية لقوى القص الضارة، بما يتفق مع ما يميز "atelectrauma" من التنفس الصناعي لحث على إصابة الرئة 19. هذه وغيرها بعد ليكون التي تم تحديدها من عواقب ركود الرئة من المرجح أن التفسير تفنيد الملاحظات intravital من الاوعية الدموية الدقيقة الرئوي (patho) علم وظائف الأعضاء.
ونظرا لهذه المخاوف، سعينا إلى تطوير طريقة يمكن من خلالها دراسة ESL الرئوي في التحرك بحرية والرئة الماوس في الجسم الحي. اخترنا للتكيف مع أسلوب Tabuchi وكوبلر، وهو نهج يسمح التصور طولية من الرئة الماوس بحرية الحركة دون التحريض على إصابة الرئة 18. الأهم من ذلك، يحتوي نهجنا تعديلات خفية عدة من بروتوكول Tabuchi الأصلي، وهذه فتافيتستعقد تطورت من الحاجة إلى استيعاب الظروف الفريدة في مختبرنا. وبالمثل، واعتماد نموذجنا القياس ESL يتطلب التحسين في أماكن أخرى مماثلة لضمان استقرار ديناميكا الدم الماوس، الأوكسجين والتهوية، وعدم وجود إصابة الرئة.
اخترنا لاستخدام ديكستران الإقصاء ونهجنا الأساسي لقياس ESL. وهذه التقنية مناسبة تماما لنموذجنا، كما يمكن إجراء قياسات ESL من لحظة واحدة في الوقت المناسب، ويلغي الرئوي القلبي قطعة أثرية الحركة. في حين أن دراسات سابقة من الجملة الوعائية المجهرية النظامية واقترح أن ديكستران استبعاد دقيقة فقط في السفن الصغيرة (<15 ميكرومتر 6)، لاحظنا تغييرات ESL متطابقة في الأوعية تصل إلى 30 ميكرون من القطر. قد تكون هذه التناقضات بسبب الخصائص البصرية محددة إلى السطح الجنبي.
في سرير متحرك الأوعية الدموية، فمن الضروري أن brightfield والتصوير الفلورسنت سوccurs في وقت واحد، وإبطاء، حتى وجيزة في الحصول على الصور (مثل إغلاق مصراع بين الصور المتسلسلة) نخلط قاتلة قياسات سمك ESL. بينما التوقف التهوية قد يقلل هذا الخلط، والشهيق وقفة لا يمنع تماما القلب قطعة أثرية الحركة أو قطعة أثرية من الجهاز التنفسي إعادة توزيع الغاز في الرئتين، heterogeneously نفخ المصاب ("سائب") 20. انتخبنا لاستخدام الصورة الخائن لإرسال الصور في وقت واحد وbrightfield الفلورسنت لكاميرا CCD واحدة. يمكن أن تشمل النهج البديلة المحتملة لاستخدام المرايا في وقت واحد مزدوج اللون لالتقاط الصور ينعكس ضوء الفلورسنت وخلال الفحص المجهري متحد البؤر.
والطلب الإضافي الحرجة من نموذجنا هو استخدام الغمر بالمياه الأهداف المتخصصة. يجب أن يكون هذه الأهداف فتحة كبيرة بما فيه الكفاية للسماح العددية حل الخلافات الصغيرة في سفينة بعرض حين لا يزال maintaininز على مسافة كافية تعمل على اختراق كل من النافذة وسطح الصدري الجنبي. هذه الأهداف، في حين المتاحة، هي مكلفة للغاية. استخدام ينعكس تدخل الفرق المجهر الضوئي (DIC) النقيض من ذلك، أن تقنية brightfield يبرز حواف الأنسجة غير ملوثين، أمر مرغوب فيه بالإضافة إلى ذلك، كما يحسن دقة DIC قياسات عرض الأوعية الدموية.
تقنيات بديلة موجودة لتحديد عرض ESL الرئوي. في حين لا يمكن أن يؤديها velocimetry المكروية بدقة على سرير متحرك الأوعية الدموية، ويمكن أن تستخدم لاختبار التصاق المكروية غير مباشر الرئوي سلامة الكنان السكري. لقد أظهرنا سابقا أن سليمة وظائف ESL استبعاد تعميم المجهرية من سطح جزيئات الالتصاق البطانية 2. وجود المضادة للالتصاق ICAM-1 المكروية إلى السطح البطانية يشير ذلك إلى فقدان الكنان السكري / ESL النزاهة. هذه التقنية لا تتطلب brightf في وقت واحددرع / الفلورسنت التصوير، ولا مرتفعة الفتحة العددية اللازمة الأهداف. ومع ذلك، واحدة تحذير هام موجود: لزيادة التصاق مكافحة ICAM-1 المكروية للإشارة إلى فقدان الكنان السكري، يجب أن يكون هناك سطح الخلية مماثلة ICAM-1 التعبير بين المجموعتين الضابطة والتجريبية. بينما ICAM-1 التعبير سطح البطانية ظلت مستقرة في وقت مبكر (<45 دقيقة) في الإنتان الناجم عن إصابة الرئة 2، والتعبير سطح زيادة في نهاية المطاف بطريقة NF-كيلوبايت تعتمد 21. استخدام التصاق المكروية كعلامة للسلامة الكنان السكري، وبالتالي، قد لا يكون صحيحا إلا أثناء الالتهاب في وقت مبكر.
من المذكرة، في حين لدينا تقنيات الجراحة والفحص المجهري لا تحث على إصابة الرئة 2، فمن غير المؤكد كيف تتطور إصابة الرئة التجريبية (مثل الإصابة الناجمة عن تقطير حمض داخل الرغامى) يؤثر قياسات سمك ESL. يمكن أن تتطور وذمة الرئة نخلط يحتمل القياسات DIC من عرض السفينةو / أو تأثير نفاذية ديكستران. ويمكن التخفيف من هذه الشكوك من خلال استخدام تقنيات متعددة التكميلية لل(مثل ديكستران الاستبعاد، التصاق المكروية، وكذلك تقييم نسيجية مؤكد من محتوى جلايكان السفينة 2) لتأكيد التغيرات الملحوظة في ESL الرئوي.
وباختصار، من خلال توسيع نطاق النهج الجراحية ذكرت في البداية من قبل Tabuchi وكوبلر، وضعنا نموذج تجريبي يسمح لرصد تفصيلي للESL الرئوي. ينبغي استخدام هذا النموذج يسمح لفهم أكبر لأهمية الكنان السكري البطانية الوعائية الرئوية لعلم وظائف الأعضاء في الصحة والمرض.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نشكر الدكاترة. اراتا Tabuchi وولفغانغ كوبلر (جامعة تورنتو) للتعليم فيما يتعلق المجهر intravital. نشكر أندرو كاهيل (نيكون الآلات) للمساعدة في تصميم وتنفيذ المجهري. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة / NHLBI HL101295 P30 المنح وK08 HL105538 (لEPS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Name of Reagent | |||
| FITC-dextran (150 kDa) | Sigma | FD150S | |
| TRITC-dextran (150 kDa) | Sigma | T1287 | |
| Streptavidin-coated fluorescent microspheres | Bangs Laboratories | CP01F/10428 | Dragon Green fluorescence (similar to FITC) |
| Ketamine | Moore Medical | ||
| Xylazine | Moore Medical | ||
| Anti-ICAM-1 biotinylated antibody | eBioscience | Clone YN1/1.7.4 | 1:50 dilution |
| Isotype biotinylated antibody | eBioscience | IgG2b eB149/10H5 | 1:50 dilution |
| EQUIPMENT | |||
| Mechanical ventilator | Harvard Apparatus | Inspira | |
| Tracheostomy catheter | Harvard Apparatus | 730028 | |
| Electrocautery apparatus | DRE Medical | Valleylab SSE-2L | |
| Bipolar cautery forceps | Olsen Medical | 10-1200I | 9.9cm McPherson |
| Temperature control system | World Precision Instruments | ATC1000 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | Pump 11 Elite | |
| Microscope (widefield) | Nikon | LV-150 | |
| Microscope (confocal) | Nikon | A1R | |
| Image splitter | Photometrics | DV2 | |
| CCD camera | Photometrics | CoolSNAP HQ2 | |
| Image processing software | Nikon | NIS Elements | |
| Polyvinylidene membrane | Kure Wrap | ||
| Circular cover slip | Bellco | 5CIR-1-BEL | 5 mm, #1 thickness |
| Glue (cover slip to membrane) | Pattex | Flussig (liquid) | For affixing cover slip to membrane |
| Glue (cover slip to mouse) | Pattex | Gel | For attaching membrane to mouse |
| Surgical tubing | Intramedic | PE50, PE10 | |
| Suture | Fisher | 4:0 silk | |
| Electric razor | Oster | 78997 | |
| Curved surgical forceps | Roboz | ||
| Straight surgical forceps | Roboz | ||
| Surgical scissors | Roboz | ||
| Surgical microscissors | Roboz | ||
| Surgical needle driver | Roboz | ||
| Surgical tape | Fisher | ||
| Kitchen sponges (cut into wedges) | various | ||
References
- Negrini, D., Tenstad, O., Passi, A., Wiig, H. Differential degradation of matrix proteoglycans and edema development in rabbit lung. AJP - Lung Cellular and Molecular Physiology. 290, L470-L477 (2006).
- Schmidt, E. P., et al. The pulmonary endothelial glycocalyx regulates neutrophil adhesion and lung injury during experimental sepsis. Nat. Med. 18, 1217-1223 (2012).
- Florian, J. A., et al. Heparan sulfate proteoglycan is a mechanosensor on endothelial cells. Circ. Res. 93, e136-e142 (2003).
- Chappell, D., et al. The Glycocalyx of the Human Umbilical Vein Endothelial Cell: An Impressive Structure Ex Vivo but Not in Culture. Circulation Research. 104, 1313-1317 (2009).
- Potter, D. R., Damiano, E. R. The hydrodynamically relevant endothelial cell glycocalyx observed in vivo is absent in vitro. Circ. Res. 102, 770-776 (2008).
- Weinbaum, S., Tarbell, J. M., Damiano, E. R. The Structure and Function of the Endothelial Glycocalyx Layer. Annual Review of Biomedical Engineering. 9, 121-167 (2007).
- Pittet, M., Weissleder, R. Intravital Imaging. Cell. 147, 983-991 (2011).
- Kilpatrick, D. C., Graham, C., Urbaniak, S. J., Jeffree, C. E., Allen, A. K. A comparison of tomato (Lycopersicon esculentum) lectin with its deglycosylated derivative. Biochem. J. 220, 843-847 (1984).
- Smith, M. L., Long, D. S., Damiano, E. R., Ley, K. Near-wall micro-PIV reveals a hydrodynamically relevant endothelial surface layer in venules in vivo. Biophys. J. 85, 637-645 (2003).
- Vink, H., Duling, B. R. Identification of Distinct Luminal Domains for Macromolecules, Erythrocytes, and Leukocytes Within Mammalian Capillaries. Circ. Res. 79, 581-589 (1996).
- Marechal, X., et al. Endothelial glycocalyx damage during endotoxemia coincides with microcirculatory dysfunction and vascular oxidative stress. Shock. 29, 572-576 (2008).
- Presson, R. G. Jr, et al. Two-Photon Imaging within the Murine Thorax without Respiratory and Cardiac Motion Artifact. The American Journal of Pathology. 179, 75-82 (2011).
- Looney, M. R., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nat. Meth. 8, 91-96 (2011).
- Pearse, D. B., Wagner, E. M., Permutt, S. Effect of ventilation on vascular permeability and cyclic nucleotide concentrations in ischemic sheep lungs. J. Appl. Physiol. 86, 123-132 (1999).
- Hossain, M., Qadri, S., Liu, L. Inhibition of nitric oxide synthesis enhances leukocyte rolling and adhesion in human microvasculature. Journal of Inflammation. 9, 28 (2012).
- Schmidt, E. P., et al. Soluble guanylyl cyclase contributes to ventilator-induced lung injury in mice. AJP - Lung Cellular and Molecular Physiology. 295, L1056-L1065 (2008).
- Mead, J., Takishima, T., Leith, D. Stress distribution in lungs: a model of pulmonary elasticity. J. Appl. Physiol. 28, 596-608 (1970).
- Tabuchi, A., Mertens, M., Kuppe, H., Pries, A. R., Kuebler, W. M. Intravital microscopy of the murine pulmonary microcirculation. J. Appl. Physiol. 104, 338-346 (2008).
- Gattinoni, L., Protti, A., Caironi, P., Carlesso, E. Ventilator-induced lung injury: the anatomical and physiological framework. Crit. Care Med. 38, 539-548 (2010).
- Tabuchi, A., Kim, M., Semple, J. W., Kuebler, W. M. Acute Lung Injury Causes Pendelluft Between Adjacent Alveoli In Vivo. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 183, A2490 (2011).
- Roebuck, K. A., Finnegan, A. Regulation of intercellular adhesion molecule-1 (CD54) gene expression. J. Leukoc. Biol. 66, 876-888 (1999).
