Summary
endothelial सतह / glycocalyx endothelial परत आदर्श intravital माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके अध्ययन किया है. Intravital माइक्रोस्कोपी तकनीकी रूप से फेफड़ों के रूप में एक चलती अंग में चुनौती दे रहा है. हम प्रदर्शन कैसे युगपत brightfield और फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी के लिए एक स्वतंत्र रूप से बढ़ने में endothelial सतह परत मोटाई का अनुमान लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है
Abstract
endothelial glycocalyx proteoglycans और संबद्ध glycosaminoglycans संवहनी लुमेन अस्तर की एक परत है vivo में, glycocalyx अत्यधिक हाइड्रेटेड है, एक पर्याप्त endothelial सतह परत (ईएसएल) कि endothelial समारोह के रखरखाव के लिए योगदान के गठन. के रूप में endothelial glycocalyx अक्सर इन विट्रो में न्यायपालिका और मानक ऊतक निर्धारण तकनीक के दौरान खो दिया है, ESL के अध्ययन intravital माइक्रोस्कोपी का उपयोग की आवश्यकता है. सबसे अच्छा अनुमानित वायुकोशीय microvasculature की जटिल शरीर क्रिया विज्ञान, फेफड़े intravital इमेजिंग आदर्श एक आज़ादी से बढ़ फेफड़ों पर किया जाता है. इन तैयारी, तथापि, आम तौर पर व्यापक गति artifact से पीड़ित हैं. हम प्रदर्शन कैसे बंद छाती एक स्वतंत्र रूप से चलती माउस फेफड़ों के intravital माइक्रोस्कोपी fluorescently लेबल उच्च आणविक भार dextrans endothelial सतह से ESL अपवर्जन के माध्यम glycocalyx अखंडता को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यह गैर वसूली सर्जिकल तकनीक है, जो आवश्यकतायुगपत brightfield और माउस फेफड़ों के फ्लोरोसेंट इमेजिंग, confounding फेफड़ों की चोट उत्प्रेरण के सबूत के बिना subpleural microvasculature के अनुदैर्ध्य अवलोकन के लिए अनुमति देता है.
Introduction
vivo में, glycocalyx अत्यधिक हाइड्रेटेड है, एक पर्याप्त endothelial सतह (ईएसएल) परत है कि endothelial कार्यों का एक तरल पदार्थ पारगम्यता 1, न्युट्रोफिल endothelial सहित विभिन्न प्रकार को नियंत्रित बनाने endothelial glycocalyx proteoglycans और संबद्ध glycosaminoglycans संवहनी intima अस्तर के एक बाह्य परत है. 2 आसंजन, और तरल पदार्थ कतरनी तनाव 3 की mechanotransduction.
ऐतिहासिक, glycocalyx सभ्य सेल 4 तैयारी, 5 मानक ऊतक निर्धारण और 6 प्रसंस्करण के दौरान और उसके पतन में अपनी विषमता के कारण underappreciated किया गया है. बढ़ती उपयोग intravital माइक्रोस्कोपी का (vivo माइक्रोस्कोपी IVM) 7 ESL के स्वास्थ्य और बीमारी के दौरान नाड़ी समारोह को महत्व में बढ़ वैज्ञानिक ब्याज के साथ आया है. ESL प्रकाश माइक्रोस्कोपी के लिए अदृश्य है और आसानी से नहीं कर सकते हैं लेबलvivo फ्लोरोसेंट glycocalyx बाध्यकारी lectins आरबीसी 8 समूहन और घातक फेफड़े emboli (अप्रकाशित टिप्पणियों) के कारण की प्रवृत्ति को देखते हुए,. कई परोक्ष दृष्टिकोण इसलिए गैर चलती ऐसे cremasteric और mesenteric microcirculations के रूप में संवहनी बेड में ESL मोटाई (और विस्तार के द्वारा, glycocalyx अखंडता) परिणाम निकालना विकसित किया गया है. इन तकनीकों endothelial झिल्ली (microparticle छवि velocimetry 9) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से भारी, fluorescently लेबल संवहनी मार्कर (जैसे dextrans) के बहिष्कार के माप से endothelial सतह से दूरी के एक समारोह के रूप में microparticle वेग परिसंचारी में मतभेद की माप (dextran अपवर्जन तकनीक 10, 11). इन तकनीकों का, केवल dextran अपवर्जन समय में एक ही बिंदु पर किए गए माप से ESL मोटाई का आकलन करने के लिए सक्षम है. एक साथ संवहनी चौड़ाई को मापने में brightfield माइक्रोस्कोपी (चौड़ाई का उपयोग करके"अदृश्य") ESL और एक नाड़ी ESL से बाहर रखा अनुरेखक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी के clusive, ESL मोटाई एक आधा संवहनी 2 चौड़ाई के बीच अंतर के रूप में गणना की जा सकती है.
ESL मोटाई के एक तात्कालिक उपाय उपयोग फुफ्फुसीय glycocalyx के अध्ययन के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है. फेफड़ों के intravital माइक्रोस्कोपी चुनौतीपूर्ण है, महत्वपूर्ण फेफड़े और हृदय गति artifact दिया. जबकि हाल के अग्रिमों vivo 12, 13 में माउस फेफड़ों के स्थिरीकरण के लिए अनुमति देते हैं, चिंताओं फेफड़ों के ठहराव के शारीरिक प्रभाव के बारे में मौजूद हैं. फेफड़े गतिहीनता की कमी हुई endothelial नाइट्रिक ऑक्साइड, 14 संकेत एक संकेतन मार्ग कि दोनों न्युट्रोफिल आसंजन 15 और 16 चोट फेफड़ों प्रभावों के साथ जुड़ा हुआ है. इसके अलावा, हानिकारक कतरनी बलों (तथाकथित "atelectrauma") मोबाइल alveoli आसपास को उजागर फेफड़ों के एक क्षेत्र के स्थिरीकरण की क्लासिक शारीरिक अवधारणाओं के साथ अनुसार,वायुकोशीय अन्योन्याश्रय 17.
2008 में, Arata Tabuchi, वोल्फगैंग Kuebler और उनके सहयोगियों ने एक शल्य चिकित्सा एक स्वतंत्र रूप से चलती माउस 18 फेफड़ों के intravital माइक्रोस्कोपी के लिए अनुमति तकनीक विकसित की है. इस तकनीक से उत्पन्न होने वाले श्वसन artifact brightfield और फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी के साथ माप सहित, उच्च गति इमेजिंग के उपयोग द्वारा नकार दिया जा सकता है. इस रिपोर्ट में, हम विस्तार कैसे तात्कालिक dextran अपवर्जन इमेजिंग एक माउस vivo में स्वतंत्र रूप से चलती है, फेफड़ों के subpleural microcirculation में ESL मोटाई मापने के लिए नियोजित किया जा सकता है. इस तकनीक को आसानी glycocalyx निर्धारित करने के लिए कर सकते हैं समारोह में विशेष रूप से संशोधित, एक ESL बरकरार endothelial सतह से घूम तत्वों को बाहर की क्षमता. हमने हाल ही में इन तकनीकों का इस्तेमाल किया है 2 पूति जैसे प्रणालीगत भड़काऊ रोगों के दौरान गंभीर फेफड़ों की चोट के विकास के लिए फेफड़े ESL अखंडता के महत्व को निर्धारित करने के लिए.
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Protocol
1. सर्जिकल टयूबिंग, संवहनी कैथेटर, छाती दीवार खिड़की की तैयारी
- Intravital माइक्रोस्कोपी मंच. हम एक plexiglass मंच है जिस पर माउस anesthetized माइक्रोस्कोपी दौरान निहित कस्टम बनाया. इस चरण में 10 सेमी लचीला प्लास्टिक काटने बोर्ड (जिस पर माउस संज्ञाहरण के शामिल, बंधकछेदन प्लेसमेंट, और शिरापरक कैथीटेराइजेशन के दौरान निहित) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से एक इसी तरह के आकार के हीटिंग तत्व (काटने बोर्ड के नीचे स्थित है) द्वारा दोनों एक 15 सेमी accommodates.
- माउस thoracostomy ट्यूब तैयारी (1 चित्रा). पीई 50 ट्यूबिंग (Intramedic, भीतरी व्यास 0.58 मिमी, बाहरी व्यास 0.965 मिमी) की एक 10 सेमी लंबाई में कटौती की है. एक अंत एक घुमावदार 23 गेज सुई के कुंद अंत से जुड़ा हुआ है, इस सुई वक्ष दीवार (→ बाहर अंदर) के माध्यम से ट्यूब पारित वक्ष विंडो के बंद करने के लिए पहले किया जाएगा.
टयूबिंग के बाहर का अंत (लंबाई में 1.5 सेमी, संलग्न 23 गेज के विपरीतसुई) बार बार एक 30 गेज सुई से हवा निकाल दी है, "पक्ष पोर्ट" intrathoracic हवा के प्रभावी आकांक्षा की सुविधा बनाने.
इस गवाक्षित भाग तो 04:00 रेशम सीवन की कई घैरा loops द्वारा ट्यूब के बाकी हिस्सों से अलग है, इन loops एक "डाट" के रूप में सेवा, अंततः प्रस्तोता 1.5 सेमी छाती गुहा के भीतर भाग गवाक्षित. - गले शिरापरक कैथेटर दो पीई 10 ट्यूबिंग (Intramedic, भीतरी व्यास 0.28 मिमी, बाहरी व्यास 0.61 मिमी) के 15 सेमी लंबाई में कटौती कर रहे हैं. एक स्केलपेल ट्यूब के सिरों बेवल के लिए प्रयोग किया जाता है, जिससे venipuncture की आसानी बढ़ रही है. टयूबिंग 6% 150 केडीए dextran (पीबीएस में) समाधान टयूबिंग के अंत गैर beveled जुड़ी युक्त एक 1 मिलीलीटर सिरिंज के माध्यम से प्लावित है.
- छाती दीवार खिड़की (2 चित्रा) तैयारी पारदर्शी polyvinylidene झिल्ली (नई Kure लपेटें, Kuresha, टोक्यो). (प्रमुख धुरी 6 सेमी, मामूली अक्ष 4 सेमी) एक अंडाकार आकार में काटा जाता है. एक परिपत्र 5 मिमी # 1 coverslip (Bellcओ) α cyanoacrylate गोंद का उपयोग झिल्ली (Pattex flüssig, हेंकेल, डसेलडोर्फ) चिपका है.
- ट्यूब वातिलवक्ष प्रेरण ("झटका ट्यूब) टयूबिंग की एक 10 सेमी लंबाई (भीतरी व्यास 3 मिमी, बाहरी व्यास 5 मिमी) के लिए एक 5 मिलीलीटर सिरिंज से जुड़ा हुआ है, विपरीत अंत करने के लिए पशु वक्ष पिंजरे में हवा शुरू करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा छाती दीवार खिड़की engraftment पहले.
- उद्देश्य के पानी विसर्जन के लिए सिरिंज. एक 23 गेज सुई आसुत जल से युक्त एक 30 मिलीलीटर सिरिंज से जुड़ा हुआ है. सुई की नोक (एक धातु फ़ाइल का उपयोग कर पा रहा है) के क्रम में उद्देश्य के लिए नुकसान को रोकने के.
2. माउस संज्ञाहरण
- (10 मिग्रा / मिली) ketamine और xylazine (2 मिलीग्राम / एमएल), 8 के एक खुराक ग्राम माउस शरीर के वजन के प्रति μl प्रशासित intraperitoneally का एक मिश्रण के साथ एक माउस anesthetized है. बेहोश करने की क्रिया 3 के भीतर होता है - 6 मिनट और सहज श्वसन बाधित नहीं होना चाहिए.
- एक बिजली के रेजर का उपयोग दाढ़ी,गले, छाती, पेट, और माउस के दाईं ओर.
- टेप का प्रयोग, एक पतली प्लास्टिक काटने बोर्ड माउस सुरक्षित. माउस के सिर ऑपरेटर (3 चित्रा) की ओर इंगित करना चाहिए. कोमल ऊपरी दांत के नीचे सिवनी पासिंग की एक पाश द्वारा प्रदान तनाव सिर विस्तार को बनाए रखने के लिए कार्य करता है. काटने बोर्ड एक हीटिंग पैड पर रखा गया है, चिन्ह और शिरापरक कैथेटर प्लेसमेंट के दौरान माउस euthermia बनाए रखने.
- 100% इथेनॉल के साथ गीले मुंडा क्षेत्रों.
- एक चुटकी / पूंछ पंजा के साथ पर्याप्त संज्ञाहरण की पुष्टि करें. न्यूनतम प्रतिक्रिया अगर आगे बढ़ना, ketamine / xylazine अगर पर्याप्त रूप से नहीं anesthetized एक अतिरिक्त सांस प्रदान.
3. बंधकछेदन
- एक 1 सेमी चीरा गले से अधिक कर दिया है. अंतर्निहित संयोजी ऊतक dissected है, और लार ग्रंथियों रहे हैं और अलग laterally परिलक्षित. sternohyoid तुरंत ट्रेकिआ के लिए पूर्वकाल मांसपेशी resected है.
- 04:00 सीवन के एक पाश वें के तहत उन्नत हैई ट्रेकिआ (4 चित्रा). पाश तो कट जाता है, सिवनी के दो अलग - अलग किस्में ट्रेकिआ अंतर्निहित बनाने. दुम का सीवन बंधकछेदन ट्यूब सुरक्षित इस्तेमाल किया जाएगा; कपाल सीवन Tracheostomy प्लेसमेंट के दौरान ट्रेकिआ पर तनाव प्रदान करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा.
- दो उंगलियों का प्रयोग, ऊपरी सीवन समझा और कोमल तनाव ट्रेकिआ के लिए लागू किया जाता है. एक क्षैतिज चीरा ऊपरी और निचले sutures के बीच ट्रेकिआ में किया जाता है. यह चीरा tracheal परिधि के लगभग दो तिहाई को पार करना चाहिए. एक flanged बंधकछेदन ट्यूब (हार्वर्ड उपकरण, 1.22 मिमी बाहरी व्यास) डिस्टल ट्रेकिआ में डाला जाता है और लांगुलिय tracheal सीवन का उपयोग जगह में सुरक्षित है.
- बंधकछेदन एक मात्रा नियंत्रित छोटे जानवर वेंटीलेटर (इन्स्पिरा, हार्वर्ड उपकरण) से जुड़ा है, और माउस 40% प्रेरित ऑक्सीजन और 9 / एमएल किलो ज्वार की मात्रा (सेटिंग्स पर्याप्त / हमारी प्रयोगशाला में oxygenation वेंटिलेशन को बनाए रखने के लिए अनुकूलित) के साथ हवादार है. Posiेश्य दबाव अंत expiratory (झलक) इस बिंदु पर नहीं शुरू कर दिया है. ध्यान दें, वेंटीलेटर सेटिंग्स अलग - अलग प्रयोगशालाओं के भीतर अद्वितीय स्थितियों के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए. निरर्थक टयूबिंग (वेंटीलेटर टयूबिंग Y संबंधक और बंधकछेदन के बीच interposed) के विभिन्न लंबाई मृत अंतरिक्ष को समायोजित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, किसी भी चुना ज्वार की मात्रा के लिए स्थिर वायुकोशीय वेंटिलेशन सुनिश्चित करने.
4. शिरापरक कैथीटेराइजेशन
- आंतरिक और बाहरी गले नस के जंक्शन डिस्टल शिरापरक शाखाओं proximally पर नज़र रखने से पहचाना जा सकता है. बाहरी कंठ का परिलक्षित लार ग्रंथियों के नीचे पाया जाता है, इस proximally पता लगाया जा सकता है बाहरी आंतरिक कंठ जंक्शन.
- कोमल कुंद विच्छेदन का उपयोग करने के लिए संयोजी ऊतक के आसपास से कंठ का जंक्शन अलग.
- 04:00 sutures का प्रयोग, कंठ का बाहरी और आंतरिक कंठ कंठ का जंक्शन के बाहर का नसों (कपाल) टाई.
- कैरीना में एक छोटा सा चीराकंठ का जंक्शन के खून बह रहा है, कम से कम होना चाहिए.
- दो कैथेटर संवर्द्धित चीरा के माध्यम से और कंठ का ट्रंक में उन्नत किया जा सकता है. कोमल रक्त वापसी सुनिश्चित करने के लिए आकांक्षा के बाद, कैथेटर नस 04:00 sutures का उपयोग कर के भीतर सुरक्षित हैं.
- टेप काटने बोर्ड आकस्मिक शत्रु - निर्वासन के खिलाफ रोकने के लिए शिरापरक कैथेटर.
5. Intravital माउस फेफड़े माइक्रोस्कोपी सर्जरी (Tabuchi एट अल से रूपांतरित 18)
- काटने बोर्ड (स्र्द्ध, anesthetized माउस के रूप में के रूप में अच्छी तरह से टेप शिरापरक कैथेटर युक्त) intravital माइक्रोस्कोपी मंच transitioned है, जहां शेष शल्य हस्तक्षेपों का प्रदर्शन किया जाएगा. गुदा तापमान जांच रखा है, एक अनुकूली हीटिंग सिस्टम (काटने बोर्ड के तहत स्थित) के साथ इस इंटरफेस, माउस euthermia के रखरखाव अनुमति देता है.
- एक गले शिरापरक कैथेटर एक सिरिंज पंप है कि एक (10 मिग्रा / मिली) ketamine xylazine (2 मिलीग्राम / एमएल) उद्धार करने के लिए जुड़ा हुआ हैप्रति घंटे 200 μl में मिश्रण. पूंछ / चुटकी पंजा का उपयोग पर्याप्त संज्ञाहरण फिर से पुष्टि की है.
- midline चीरा गर्दन से xyphoid प्रक्रिया को बढ़ाया है, तो दाईं ओर laterally कार्यवाही (5 चित्रा).
- Electrocautery का प्रयोग, छाती मांसलता निकाल दिया जाता है केज थोरेसिक उजागर. देखभाल करने के लिए पूरा hemostasis को सुनिश्चित करने के लिए लिया जाता है.
- माउस के बाईं ओर और टेप पर सही hindleg क्रॉस नीचे. परिणामस्वरूप पेट में मरोड़ छाती थोड़ा rotates, सर्जरी के आराम में सुधार.
- एक 45 डिग्री के कोण (6 चित्रा) में मंच रखें, इस स्थिति फेफड़ों दूर छाती की दीवार से गिर एक बार वातवक्ष प्रेरित है की अनुमति देता है.
- 1 सेंट रिब (सबसे अवर रिब) एक संदंश के साथ समझा है और उठाया, एक घुमावदार संदंश दो टूक रिब के नीचे धकेल दिया है. इस पार्श्विका फुस्फुस का आवरण सीने में दीवार से अलग करती है. फुस्फुस का आवरण unpunctured रहना चाहिए.
- झटका ट्यूब का प्रयोग औरएक सिरिंज, हवा जबरन पार्श्विका फुस्फुस का आवरण के खिलाफ शुरू की है. यह अंतर्निहित फेफड़ों को नुकसान पहुँचाए बिना फुफ्फुस सतह और वातिलवक्ष के फटने के लिए होता है. अंतर्निहित फेफड़ों छाती दीवार से दूर गिर, फेफड़ों को नुकसान पहुँचाए बिना एक विद्युतदहनकर्म संदंश की शुरूआत की अनुमति होगी. वेंटीलेटर ज्वार की मात्रा में कमी आम तौर पर इस कदम के दौरान की आवश्यकता नहीं है.
- Electrocautery संदंश का प्रयोग, छाती दीवार मांसलता काटना और 5 वें और 6 वें पसलियों / पार्श्विका फुस्फुस का आवरण में कटौती, एक ~ 8 मिमी छाती दीवार में परिपत्र छेद बना. यह जरूरी है कि पूरा रक्तस्तम्भन बनाए रखा जाना चाहिए, क्योंकि रक्तस्राव की उपस्थिति माइक्रोस्कोपी (7 चित्रा) अस्पष्ट होगा.
- ड्राइवर का प्रयोग एक सुई, छाती दीवार छेद में thoracostomy ट्यूब डालने. सुई छाती दीवार पंचर और वक्ष अवर और पार्श्व गुहा वक्ष विंडो (7 चित्रा) से बाहर निकलें. ख्याल रखना डायाफ्राम puncturing से बचने के लिए.ट्यूब फिर धीरे से छाती की दीवार के बाहर खींच लिया जब तक यह प्रतिरोध सीवन "डाट" ट्यूब के गवाक्षित हिस्से के किनारे पर स्थित होता है.
- चरण फ्लैट रखें.
- 3 सेमी वेंटीलेटर फेफड़ों reexpansion सहायता एच 2 हे झलक जोड़ें.
- गोंद (Pattex जेल, हेंकेल) circumferentially सीने में खिड़की के आसपास रखा गया है. झिल्ली, कांच के कवर वक्ष गुहा के लिए बाहरी का सामना करना पड़ रहा पर्ची के साथ जुड़ा हुआ है. ध्यान (और circumferentially) लगभग गोंद एक कपास applicator का उपयोग करने के लिए झिल्ली.
- जबकि एक फेफड़ों भर्ती पैंतरेबाज़ी (3 ज्वारीय संस्करणों जो के दौरान झलक वेंटीलेटर बंदरगाह बाधित है) प्रदर्शन, -3 मिमी Hg चूषण छाती ट्यूब के लिए लागू किया जाता है. फेफड़ों लगातार लगभग झिल्ली चाहिए, जबकि ज्वारीय वेंटिलेशन (8 चित्रा) के दौरान स्वतंत्र रूप से घूम रहा है.
- माउस का सही अगली टांग पर बाईं तरफ पार कर जाता है, माउस के एक बाएं पार्श्व decubitus स्थिति में जिसके परिणामस्वरूप.स्पंज wedges ठीक माउस की स्थिति तो छाती खिड़की माइक्रोस्कोपी पानी विसर्जन उद्देश्य के साथ गठबंधन किया है के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
- आसुत जल कवर माइक्रोस्कोपी पहले पर्ची पर रखा गया है, एक पानी विसर्जन उद्देश्य का उपयोग फेफड़ों के दृश्य के लिए अनुमति देता है. जल रहकर इमेजिंग भर में मंगाया जा आवश्यकता होगी.
6. पल्मोनरी Endothelial सतह परत मोटाई के मापन
- छाती दीवार बंद करने के तुरंत बाद, 500 μl FITC लेबल 150 केडीए dextran (पीबीएस में 6% समाधान के) दूसरी (गैर संज्ञाहरण) कंठ का शिरापरक कैथेटर के माध्यम से किया जाता है. यह सांस की मात्रा के रूप में के रूप में अच्छी तरह से ESL माप के लिए संवहनी अनुरेखक पुनर्जीवन के रूप में कार्य करता है. dextran सांस न्युट्रोफिल आसंजन या फेफड़ों edema 2 गठन को प्रभावित नहीं करता है.
- पानी विसर्जन उद्देश्य कवर पर्ची पर केन्द्रित है. उद्देश्य के चुनाव के लिए आवश्यक है ESL मोटाई में छोटे मतभेदों, एक उच्च numeri कल्पनाकैलोरी एपर्चर (0.8) की जरूरत है, जबकि अभी भी बनाए रखने के एक 2 - 3 मिमी दूरी काम (फेफड़ों खिड़की और फुफ्फुस सतह के माध्यम से प्रवेश की अनुमति). हम Nikon CFI LWD 75 (0.8 एनए) 16x और CFI इस उद्देश्य के लिए 75 LWD 25x उद्देश्यों (1.1 एनए) का उपयोग करें.
- सही एक चलती अंग में ESL मोटाई मापने, यह जरूरी है कि brightfield और फ्लोरोसेंट संवहनी चौड़ाई के साथ प्रदर्शन कर रहे हैं. यह एक छवि (दोहरी देखें, Photometrics) अलगानेवाला कि परिलक्षित प्रकाश अंतर हस्तक्षेप विपरीत (डीआईसी, brightfield) के एक साथ कब्जा और FITC (9 चित्रा) छवियों के लिए अनुमति देता का उपयोग कर पूरा किया जा सकता है.
- एक 5 सेकंड inspiratory ठहराव के दौरान, निरंतर इमेजिंग और प्रदर्शन दर्ज की गई. बाद में, इन छवियों में फोकस फ्रेम की पहचान करने के लिए समीक्षा की जा सकती है.
- में फोकस फ्रेम, subpleural microvessels (<20 सुक्ष्ममापी व्यास) की पहचान कर रहे हैं एक का उपयोग करना, कम से कम 3 microvessels आम तौर पर एक भी फ्रेम पर पाए जाते हैं. प्रयोग, डीआईसी के पूरा होने के बादऔर FITC dextran संवहनी चौड़ाई (एक अंधा पर्यवेक्षक द्वारा) तीन microvessel प्रति सीधा अवरोध लंबाई औसत से मापा जाता है. पोत के दोनों किनारों पर बराबर ESL मोटाई मान लिया जाये कि, ESL आकार एक आधा डीआईसी और FITC dextran संवहनी चौड़ाई के रूप में प्रतिनिधि परिणाम खंड में वर्णित के बीच अंतर से परिभाषित किया जा सकता है.
- आमतौर पर, intravital माइक्रोस्कोपी फेफड़ों की चोट या 2 hypotension के बिना किसी सबूत के> 90 मिनट के लिए किया जा सकता है. प्रारंभिक प्रयोगों प्रेक्षण की अवधि के दौरान माउस (ब्लड प्रेशर, oxygenation, वेंटिलेशन, फेफड़ों की चोट) स्थिरता की पुष्टि करने के लिए किया जाना चाहिए. प्रायोगिक दवाओं की प्रक्रिया के दौरान किसी भी बिंदु पर 2 (गैर संवेदनाहारी) कंठ का कैथेटर के माध्यम से पेश किया जा सकता है.
7. पल्मोनरी Endothelial सतह परत वफ़ादारी वैकल्पिक मापन
बरकरार endothelial सतह परत कार्यों (भाग में) circulat को बाहर करने के लिएendothelial सतह 2 से आईएनजी तत्वों. ESL अखंडता इसलिए एक परिसंचारी तत्व की क्षमता (एक फ्लोरोसेंट microsphere जैसे) का उपयोग करने के लिए और सेल सतह आसंजन अणुओं (जैसे ICAM-1 के रूप में) के साथ बातचीत से मापा जा सकता है.
- विरोधी ICAM-1 लेबल फ्लोरोसेंट microspheres सर्जरी से पहले तैयार कर रहे हैं. Streptavidin लेपित 0.97 फ्लोरोसेंट microspheres सुक्ष्ममापी biotinylated विरोधी ICAM एक (YN1/1.7.4 क्लोन, 1:50, eBioscience) कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए एंटीबॉडी या निर्धारण नियंत्रण के साथ incubated हैं. microspheres तीन बार धोया जाता है और 1 x 10 9 मिलीग्राम प्रति microspheres में पीबीएस में निलंबित कर दिया.
- Intravital माइक्रोस्कोपी के दौरान, microsphere निलंबन (100 μl) गले शिरापरक कैथेटर में इंजेक्ट किया जाता है. संचलन के 15 मिनट के बाद, फ्लोरोसेंट छवियों 5 मिनट पर कब्जा कर रहे हैं. > 5 मिनट के लिए स्थिर Microspheres पक्षपाती और मात्रा निर्धारित इमेज प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर के उपयोग पर विचार कर रहे हैं.
8. सुखमृत्यु
<पी वर्ग = प्रक्रिया के पूरा होने के बाद "jove_content">, anesthetized चूहों प्रत्यक्ष कार्डियक पंचर के माध्यम exsanguination द्वारा euthanized हैं. इच्छामृत्यु द्विपक्षीय pneumothoraces, जिसके बाद फेफड़ों काटा और बाद में विश्लेषण के लिए तस्वीर जमी के माध्यम से इसकी पुष्टि की है.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
प्रयोगात्मक 1-6 चरणों में वर्णित दृष्टिकोण एक साथ (brightfield) डीआईसी और फ्लोरोसेंट छवियों के कई फ्रेम का कब्जा अनुमति देगा. ESL मोटाई को निर्धारित करने के लिए, दर्ज की छवियों प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल के पूरा होने के बाद एक अंधा पर्यवेक्षक द्वारा की समीक्षा कर रहे हैं. में फोकस फ्रेम, subpleural microvessels (<20 सुक्ष्ममापी व्यास) की पहचान कर रहे हैं एक का उपयोग करना, कम से कम 3 microvessels आम तौर पर एक ही फ्रेम (10 चित्रा) पर पाए जाते हैं. छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर (एनआईएस तत्वों, Nikon) का उपयोग करना, नाड़ी चौड़ाई (एक अंधा पर्यवेक्षक द्वारा) तीन microvessel प्रति सीधा अवरोध लंबाई औसत से मापा जाता है. रूप में ESL डीआईसी इमेजिंग अदृश्य है, डीआईसी संवहनी चौड़ाई endothelial झिल्ली के लिए endothelial झिल्ली अवधि और इसलिए ESL मोटाई 9, 10 के समावेशी. इसके विपरीत, FITC dextran (150 केडीए) ESL से बाहर रखा गया है. नतीजतन, FITC संवहनी चौड़ाई ESL मोटाई को शामिल नहीं करते. मान लिया जाये कि बराबर ESL मोटीपोत के दोनों किनारों पर रास, ESL आकार इसलिए एक आधा डीआईसी और FITC dextran संवहनी चौड़ाई के बीच अंतर से परिभाषित किया जा सकता है.
कई संभावित तकनीकी नुकसान प्रायोगिक परिणामों की व्याख्या के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं. माइक्रोस्कोपी क्षेत्र में खून बह रहा है की उपस्थिति दोनों subpleural microvasculature के डीआईसी और FITC दृश्य अस्पष्ट है, इसलिए देखभाल के लिए खिड़की स्थान (5.9) के दौरान hemostasis (विद्युतदहनकर्म का उपयोग करते हुए) प्राप्त करने के लिए लिया जाना चाहिए. इसके अतिरिक्त, फेफड़ों reapproximate भर्ती पैंतरेबाज़ी (5.14) के बाद वक्ष खिड़की नहीं हो सकता है, यह आम तौर पर वक्ष खिड़की के आसपास झिल्ली का अधूरा घैरा आसंजन इंगित करता है. यह वक्ष खिड़की के आसपास आम तौर पर गोंद की reapplication द्वारा सुधारा जा, एक दोहराने फेफड़ों भर्ती पैंतरेबाज़ी द्वारा पीछा किया. अंत में, देखभाल करने के लिए माउस में नसों में हवा का आकस्मिक इंजेक्शन से बचने के लिए लिया जाना चाहिए. एयर emboli, घातक नहीं तो भी, preferenti सहयोगी nondependent फेफड़ों के लिए यात्रा, FITC - dextran visualized (nondependent) subpleural microvasculature के छिड़काव को रोकने.
ESL widths के मापन के लिए एक छवि (युगपत डीआईसी और फ्लोरोसेंट इमेजिंग affording) फाड़नेवाला के रूप में के रूप में अच्छी तरह से विशेष माइक्रोस्कोपी उद्देश्यों के उपयोग की आवश्यकता है. इन उपकरणों की मांग हमारे प्रोटोकॉल के लिए कुछ संशोधनों के साथ से बचा जा सकता है. Glycocalyx अखंडता परोक्ष रूप से पोत सतह से परिसंचारी microspheres की ESL अपवर्जन का निर्धारण करके मापा जा सकता है. ESL गिरावट की उपस्थिति है, इसलिए, बढ़ा microspheres की subpleural microvascular कब्जा endothelial सतह आसंजन अणुओं (जैसे ICAM-1 के रूप में) (11 चित्रा) के खिलाफ लक्षित ने संकेत दिया है.
चित्रा 1.
चित्रा 2.
चित्रा 3.
चित्रा 4.
चित्रा 5.
6 चित्रा.
चित्रा 7.
चित्रा 8.
9 चित्रा.
10 चित्रा माउस फुफ्फुसीय ESL मोटाई की माप. (एक) प्रतिनिधि माउस subpleural microvasculature (पैमाने बार, 50 सुक्ष्ममापी) के डीआईसी और फ्लोरोसेंट छवियों के साथ कब्जा कर लिया. Microvessel चौड़ाई तीन सीधा रैखिक अवरोध के औसत का उपयोग कर मापा जाता है. ESL मोटाई एक आधा बीच डीआईसी (ESL के समावेशी) और फ्लोरोसेंट (ESL के अनन्य) अंतर द्वारा निर्धारित किया जा सकता हैmicrovessel चौड़ाई (ख) डीआईसी माप सही subpleural पोत दीवार सीमाओं की पहचान के रूप में लगभग समान डीआईसी और GFP पोत चौड़ाई माप endothelial फ्लोरोसेंट Tie2 GFP चूहों (जैक्सन लैब्स) में प्रदर्शन के द्वारा प्रदर्शन किया. ठोस लाइन पहचान की लाइन का प्रतिनिधित्व करता है (ग) subpleural microvasculature longitudinally पीछा किया जा सकता है, के रूप में ESL मोटाई के प्रगतिशील अंतःशिरा (LPS) lipopolysaccharide n = 3 चूहों के बाद होने वाली हानि से सबूत. * पी <एनोवा द्वारा = 0 मिनट के समय की तुलना में 0.05.
मूवी 1 glycocalyx अखंडता विरोधी ICAM-1 subpleural microvasculature भीतर microsphere पालन करने के लिए आकलन द्वारा निर्धारित किया जा सकता है. उच्च गति confocal माइक्रोस्कोपी (Nikon A1R) पक्षपाती अंतःशिरा LPS (प्रति किलोग्राम शरीर के वजन के 20 मिलीग्राम) के बाद फ्लोरोसेंट microspheres 45 मिनट दर्शाता है. नोट है कि परिसंचारी microspheres occasionall हो सकता हैy microcirculation के माध्यम से गुजरते हुए देखा. (हरी फ्लोरोसेंट स्थानीयकरण) microsphere के दृश्य में सुधार करने के लिए, कदम में 6.1 चूहों संवहनी TRITC dextran FITC - dextran के एवज में (150 केडीए, 6%) अनुरेखक के साथ pretreated रहे थे. फिल्म को देखने के लिए यहां क्लिक करें .
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Discussion
Vivo माइक्रोस्कोपी के विस्तार के उपयोग के साथ संपाती, वहाँ दोनों ESL के पर्याप्त आकार के रूप में के रूप में अच्छी तरह से इसके नाड़ी समारोह के लिए कई योगदान के लिए वृद्धि की सराहना की है. इन उभरते डेटा, तथापि, यह मुख्य रूप से प्रणालीगत vasculature की अध्ययन से प्राप्त कर रहे हैं. दरअसल, फेफड़ों में vivo माइक्रोस्कोपी में उपयोग करने के लिए तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है, यह देखते हुए महत्वपूर्ण फेफड़े और हृदय गति artifact.
हाल ही में कई तकनीकी अग्रिमों चलती माउस फेफड़ों के स्थिरीकरण के लिए अनुमति दी है, फेफड़े microcirculation 12, 13 intravital तकनीकों का बेहतर आवेदन affording. हालांकि इन तरीकों, संभावित फेफड़ों के गतिहीनता की शारीरिक असर से चकित कर रहे हैं. के रूप में फेफड़ों चरमकारणवाद या उद्देश्यवाद की दृष्टि से एक निरंतर गति के लिए अंग है, फेफड़ों ठहराव intuitively फेफड़े के शरीर क्रिया विज्ञान बदल जाएगा. दरअसल, फेफड़ों ठहराव endothelial n में परिवर्तन के साथ जुड़ा हुआ हैitric ऑक्साइड संकेतन, दोनों स्वस्थ है और घायल फेफड़ों 14, 16 में कई बहाव के परिणामों के साथ एक मार्ग है. इसके अलावा, फेफड़ों हानिकारक कतरनी बलों alveoli आसपास विषयों की एक क्षेत्र, वेंटीलेटर के atelectrauma विशेषता के साथ संगत के स्थिरीकरण फेफड़ों 19 चोट प्रेरित. इन और अन्य अभी तक की पहचान फेफड़ों के ठहराव के परिणामों फुफ्फुसीय (Patho) microvascular शरीर क्रिया विज्ञान के intravital टिप्पणियों के उलझाना व्याख्या की संभावना है.
इन चिंताओं को देखते हुए, हम करने के लिए एक विधि है जिसके द्वारा फेफड़े ESL एक स्वतंत्र रूप से चलती vivo में, माउस, फेफड़ों में अध्ययन किया जा सकता है विकसित करने की मांग की. हम Tabuchi और Kuebler, एक दृष्टिकोण है कि फेफड़े 18 चोट को उकसाने के बिना एक स्वतंत्र रूप से चलती माउस फेफड़ों के अनुदैर्ध्य दृश्य की अनुमति देता है की तकनीक के अनुकूल करने के लिए चुना. महत्वपूर्ण बात है, हमारे दृष्टिकोण Tabuchi मूल प्रोटोकॉल से कई सूक्ष्म परिवर्तन शामिल है, इन alteraहमारी प्रयोगशाला के भीतर अद्वितीय स्थिति को समायोजित करने के लिए जरूरत से विकसित माहौल. इसी तरह, ESL माप के हमारे मॉडल की गोद लेने कहीं इसी तरह अनुकूलन hemodynamics माउस की स्थिरता, oxygenation, वेंटिलेशन, और फेफड़ों की चोट के अभाव सुनिश्चित करने की आवश्यकता जाएगा.
हम हमारे ESL माप के लिए प्राथमिक दृष्टिकोण के रूप में dextran बहिष्करण का उपयोग करने के लिए चुना है. इस तकनीक हमारे मॉडल के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है, के रूप में ESL माप समय में एक ही पल से बनाया जा सकता है, फेफड़े और हृदय गति artifact negating. के जबकि प्रणालीगत microvasculature के पिछले अध्ययनों सुझाव दिया कि dextran बहिष्करण केवल छोटे जहाजों (<15 6 सुक्ष्ममापी) में सही है, हम जहाजों में सहमत ESL परिवर्तन का उल्लेख किया है व्यास की 30 सुक्ष्ममापी. इन विसंगतियों ऑप्टिकल फुफ्फुस सतह के लिए विशिष्ट विशेषताओं के कारण हो सकता है.
एक चलती संवहनी बेड में, यह जरूरी है कि brightfield और फ्लोरोसेंट इमेजिंग ओछवि अधिग्रहण में भी एक संक्षिप्त देरी (जैसे अनुक्रमिक छवियों के बीच शटर बंद) के रूप में एक साथ ccurs, fatally ESL मोटाई की माप उलझाना चाहते हैं. जबकि वेंटिलेशन pausing इस confounding कम हो सकती है, एक inspiratory रोक पूरी तरह से हृदय गति artifact या गैस पुनर्वितरण से सांस artifact विभिन्नतापूर्वक फुलाया, घायल फेफड़ों में ("pendelluft") 20 नहीं रोकने जाएगा. हम एक छवि अलगानेवाला का उपयोग करने के लिए एक साथ एक एकल सीसीडी कैमरा brightfield और फ्लोरोसेंट छवियों भेजने निर्वाचित. वैकल्पिक दृष्टिकोण संभावित dichroic दर्पण के उपयोग करने के लिए एक साथ confocal माइक्रोस्कोपी के दौरान परिलक्षित प्रकाश और फ्लोरोसेंट छवियों पर कब्जा करने के लिए शामिल हो सकते हैं.
हमारे मॉडल का एक अतिरिक्त महत्वपूर्ण मांग विशेष पानी विसर्जन उद्देश्यों के उपयोग है. इन उद्देश्यों को एक पर्याप्त बड़ी संख्यात्मक वाहिनियों की चौड़ाई में छोटे मतभेदों के समाधान जबकि अभी भी maintainin की अनुमति एपर्चर होना चाहिएजी एक पर्याप्त काम करने के लिए दोनों वक्ष खिड़की और फुफ्फुस सतह घुसना दूरी. इन उद्देश्यों, जबकि उपलब्ध है, बेहद महंगे हैं. परिलक्षित प्रकाश अंतर हस्तक्षेप विपरीत माइक्रोस्कोपी (डीआईसी) के उपयोग, एक brightfield तकनीक है कि अस्थिर ऊतक किनारों पर प्रकाश डाला गया है, इसके अलावा वांछनीय है, के रूप में डीआईसी संवहनी चौड़ाई माप की शुद्धता में सुधार.
वैकल्पिक तकनीक फेफड़े ESL चौड़ाई का निर्धारण करने के लिए मौजूद हैं. जबकि microsphere velocimetry सही एक चलती संवहनी बिस्तर पर नहीं प्रदर्शन किया जा सकता है, microsphere आसंजन को परोक्ष रूप से फेफड़े glycocalyx अखंडता का परीक्षण करने के लिए नियोजित किया जा सकता है. हम पहले से पता चला है कि अक्षुण्ण ESL कार्यों परिसंचारी microspheres endothelial सतह आसंजन अणुओं 2 से बाहर करने के लिए. विरोधी ICAM-1 microsphere endothelial सतह आसंजन की उपस्थिति इसलिए glycocalyx / ESL अखंडता के नुकसान को इंगित करता है. इस युगपत brightf तकनीक की आवश्यकता नहीं हैield / फ्लोरोसेंट इमेजिंग, और न ही उच्च संख्यात्मक एपर्चर उद्देश्यों जरूरी हैं. हालांकि, एक महत्वपूर्ण चेतावनी मौजूद: वृद्धि की विरोधी ICAM-1 आसंजन microsphere लिए glycocalyx नुकसान को इंगित करने के लिए, वहाँ इसी तरह नियंत्रण और प्रयोगात्मक समूहों के बीच ICAM-1 कोशिका की सतह अभिव्यक्ति होना चाहिए. जबकि ICAM-1 endothelial सतह अभिव्यक्ति जल्दी (<45 मिनट) पूति प्रेरित फेफड़ों 2 चोट में स्थिर बने रहे, सतह अभिव्यक्ति अंततः एक NF-κB निर्भर तरीके से 21 में वृद्धि होगी. Microsphere आसंजन के प्रयोग glycocalyx अखंडता के एक मार्कर के रूप में, इसलिए, केवल जल्दी सूजन के दौरान मान्य हो सकता है.
ध्यान दें, जबकि हमारे शल्य चिकित्सा और तकनीक माइक्रोस्कोपी फेफड़ों 2 चोट प्रेरित नहीं करते हैं, यह अनिश्चित है कि कैसे प्रयोगात्मक फेफड़ों (जैसे intratracheal एसिड टपकाना द्वारा प्रेरित चोट) चोट ESL मोटाई की माप को प्रभावित करती है तैयार. फेफड़ों के edema ढांचा तैयार संभावित पोत चौड़ाई के डीआईसी माप उलझाना सकताऔर / या प्रभाव dextran पारगम्यता. इस अनिश्चितता कई तकनीकों के पूरक उपयोग (जैसे dextran अपवर्जन, microsphere आसंजन, पोत ग्लाइकोसमिनोग्लाइकन 2 सामग्री के रूप में के रूप में अच्छी तरह से पुष्टिकारी histologic आकलन) फेफड़े ESL में मनाया परिवर्तन की पुष्टि के द्वारा कम किया जा सकता है.
सारांश में, शल्य चिकित्सा शुरू Tabuchi और Kuebler द्वारा रिपोर्ट दृष्टिकोण का विस्तार, हम एक प्रयोगात्मक मॉडल कि फेफड़े ESL के विस्तृत अवलोकन के लिए अनुमति देता है विकसित किया है. इस मॉडल का उपयोग एक बड़ा स्वास्थ्य और बीमारी में फेफड़े संवहनी endothelial glycocalyx के महत्व के शरीर क्रिया विज्ञान को समझने के लिए अनुमति चाहिए.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
हम डीआरएस धन्यवाद. Arata Tabuchi और intravital माइक्रोस्कोपी के बारे में निर्देश के लिए वोल्फगैंग Kuebler (टोरंटो विश्वविद्यालय के). हम माइक्रोस्कोपी डिजाइन और कार्यान्वयन में सहायता के लिए एंड्रयू काहिल (Nikon उपकरण) धन्यवाद. यह काम NIH / NHLBI अनुदान P30 HL101295 और K08 HL105538 (ईपीएस) द्वारा वित्त पोषित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Name of Reagent | |||
| FITC-dextran (150 kDa) | Sigma | FD150S | |
| TRITC-dextran (150 kDa) | Sigma | T1287 | |
| Streptavidin-coated fluorescent microspheres | Bangs Laboratories | CP01F/10428 | Dragon Green fluorescence (similar to FITC) |
| Ketamine | Moore Medical | ||
| Xylazine | Moore Medical | ||
| Anti-ICAM-1 biotinylated antibody | eBioscience | Clone YN1/1.7.4 | 1:50 dilution |
| Isotype biotinylated antibody | eBioscience | IgG2b eB149/10H5 | 1:50 dilution |
| EQUIPMENT | |||
| Mechanical ventilator | Harvard Apparatus | Inspira | |
| Tracheostomy catheter | Harvard Apparatus | 730028 | |
| Electrocautery apparatus | DRE Medical | Valleylab SSE-2L | |
| Bipolar cautery forceps | Olsen Medical | 10-1200I | 9.9cm McPherson |
| Temperature control system | World Precision Instruments | ATC1000 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | Pump 11 Elite | |
| Microscope (widefield) | Nikon | LV-150 | |
| Microscope (confocal) | Nikon | A1R | |
| Image splitter | Photometrics | DV2 | |
| CCD camera | Photometrics | CoolSNAP HQ2 | |
| Image processing software | Nikon | NIS Elements | |
| Polyvinylidene membrane | Kure Wrap | ||
| Circular cover slip | Bellco | 5CIR-1-BEL | 5 mm, #1 thickness |
| Glue (cover slip to membrane) | Pattex | Flussig (liquid) | For affixing cover slip to membrane |
| Glue (cover slip to mouse) | Pattex | Gel | For attaching membrane to mouse |
| Surgical tubing | Intramedic | PE50, PE10 | |
| Suture | Fisher | 4:0 silk | |
| Electric razor | Oster | 78997 | |
| Curved surgical forceps | Roboz | ||
| Straight surgical forceps | Roboz | ||
| Surgical scissors | Roboz | ||
| Surgical microscissors | Roboz | ||
| Surgical needle driver | Roboz | ||
| Surgical tape | Fisher | ||
| Kitchen sponges (cut into wedges) | various | ||
References
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