Summary
内皮グリコカリックス/内皮表面層は、理想的には生体顕微鏡を用いて研究されています。生体顕微鏡検査は、肺などの臓器に移動技術的に困難である。私たちは、同時明視野と蛍光顕微鏡を自由に移動させる際に内皮表面層の厚さを推定するために使用することができる方法を示してい
Abstract
内皮グリコカリックスは、血管の内腔を裏打ちするプロテオグリカンおよび関連するグリコサミノグリカンの層である。 生体内では 、グリコカリックスは、内皮機能の維持に寄与する実質的な内皮表面層（ESL）を形成し、高度に水和される。内皮グリコカリックスはしばしばin vitroでの異常であり、標準的な組織固定技術の間に失われているように、ESLの研究では、生体顕微鏡を使用する必要があります。肺胞毛細血管の最良近似複雑な生理機能に、肺の生体内イメージングは、理想的には自由に動いて肺に実行されます。これらの製剤は、しかし、一般的に大規模なモーションアーチファクト苦しむ。我々は自由に動いてマウス肺の開胸生体顕微鏡が内皮表面から蛍光標識された高分子量デキストランのESLの除外を介して糖衣の整合性を測定するために用いることができる方法を示しています。必要な場合に、この非回復手術手技、同時明視野とマウス肺の蛍光イメージングは、交絡肺損傷を誘発する証拠がなく胸膜下の微小血管系の長期的観察が可能になります。
Introduction
内皮グリコカリックスは、血管内膜を裏打ちするプロテオグリカンおよび関連するグリコサミノグリカンの細胞外の層です。 生体内では、グリコカリックスは、高度に水和され、流体透過性1を含む内皮様々な機能を調節する実質的な内皮表面層（ESL）を形成し、好中球の内皮接着2、および流体せん断応力3のメカノ。
歴史的に、グリコカリックスは、標準的な組織固定し、処理6時に培養された細胞調製4,5、およびその分解に起因し、そのaberranceに過小評価されています。増加は生体顕微鏡の7（ 生体顕微鏡検査で 、IVM）を使用し、健康と病気の間に血管機能にESLの重要性の高まり科学的関心と一致した。 ESLは、光学顕微鏡には見えませんし、簡単にラベルを付けることができません赤血球凝集8と致命的な肺塞栓（未発表の観察）を引き起こす蛍光グリコカリックス結合レクチンの性癖与えられたin vivoで、。いくつかの間接的なアプローチは、したがって、そのような精巣挙筋および腸間膜microcirculationsとして非移動血管床にESLの厚さ（と、拡張による、グリコカリックスの整合性）を推定するために開発されている。これらの技術は、内皮細胞膜（微粒子画像流速9）と同様に内皮表面からかさばる、蛍光標識された血管マーカー（ 例えばデキストラン）の排除の測定からの距離の関数として微粒子速度を循環さの違いの測定を含む（デキストラン除外手法10、11）。これらの技術のうち、デキストラン除外とは、ある一時点で測定した値からESLの厚さを推定することができる。同時に明視野顕微鏡（の幅を使用して血管の幅を測定することにより、"見えない" ESL）とESLから除外血管トレーサーの蛍光顕微鏡のclusive、ESLの厚さは、血管幅2間の半分の差として計算することができます。
ESLの厚さの瞬間的な尺度の使用は肺糖衣の研究に適しています。肺の生体顕微鏡検査は重要な肺と心臓の動きのアーチファクト与えられ、やりがいがあります。最近の進歩は 、in vivo 12、13 にマウス肺の固定化を可能にしているが、懸念は、肺うっ血の生理学的影響について存在する。肺の不動は14のシグナリング減少内皮一酸化窒素、好中球の接着15と肺損傷16の両方に影響を与えるシグナル伝達経路に関連付けられています。さらに、肺の面積の固定化は、古典的な生理学的な概念による有害なせん断力（ "atelectraumaいわゆる"）にモバイル胞を取り巻く公開肺胞の相互依存17。
2008年、磯崎田淵、ヴォルフガング·キューブラーらが自由に動いてマウス肺18の生体内顕微鏡を可能にする手術法を開発しました。この手法から生じる呼吸アーティファクトは明と蛍光顕微鏡の同時測定など、高速イメージングの使用によって否定することができます。瞬時デキストラン除外イメージングは、生体内で 、自由に行動しているマウス肺の胸膜下微小循環のESLの厚さを測定するために用いることができる方法このレポートでは、我々は詳細。この手法は、簡単に、糖衣機能特異内皮表面から循環要素を除外するために無傷ESLの能力を決定するように変更できます。我々は最近、敗血症2などの全身性炎症性疾患時の急性肺損傷の発展に肺ESLの保全の重要性を決定するためにこれらの技術を使用している。
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Protocol
1。手術チューブ、血管カテーテル、胸壁窓の調製
- 生体顕微鏡ステージ。我々は麻酔マウスが顕微鏡の間にあるその上にプレキシガラスステージをカスタムメイド。このステージは、10cmフレキシブルなプラスチックまな板（マウスが麻酔導入、気管切開の配置、および静脈カテーテル中にあるその上に）だけでなく、同様のサイズの発熱体（まな板の下に位置する）で15 CMの両方に対応しています。
- マウス胸腔チューブの調製 （ 図1）。 PE50チュービング（Intramedic、内径0.58ミリメートル、外径0.965ミリメートル）の10 cmの長さをカットしています。一端が湾曲した23ゲージの針の鈍端部に取り付けられ、この針は、胸部窓の閉鎖の前胸壁（→外側内側）からチューブを渡すために使用されます。
チューブの先端（長さ1.5cm、付属の23ゲージに反対針）が繰り返し胸腔内の空気の効果的な吸引を容易にする "サイドポート"を作成し、30ゲージ針によって穿刺されています。
この有窓部分は、その後4時絹縫合糸のいくつかの円周ループによってチューブの残りの部分から分離され、これらのループは、最終的には胸腔内に穿破部分を1.5 cmのアンカー、 "ストッパー"として機能します。 - 頸静脈カテーテルは、PEチューブ10（Intramedic、内径0.28ミリメートル、外径0.61ミリメートル）の2つの15cmの長さがカットされています。メスはそれによって静脈穿刺の容易さを増加させる、ベベルに管の端部に使用されます。チューブはチューブの非面取り端部に取り付けられた6パーセント150 kDaのデキストラン溶液（PBS中）を含む1mlシリンジを介してフラッシュされます。
- 胸壁ウィンドウ準備します（図2）。透明ビニリデン膜（新呉ラップ、Kuresha、東京）が楕円形（長径6cmの短径4cm）ににカットされる。円形の5ミリメートル第1カバースリップ（Bellco）は、α-シアノアクリレート系接着剤を用いた膜（Pattexflüssig、ヘンケル、デュッセルドルフ）に貼付されています。
- 気胸の誘導のためのチューブ（ "ブロー管"）チューブの長さ10cm（内径3mm、外径5 mm）を5mlの注射器に接続されている;反対側の端部は、動物の胸郭内に空気を導入するために使用されます胸壁ウィンドウ移植に先立って。
- 目的の水浸用注射器23ゲージの針を蒸留水を含む30mlの注射器に取り付けられています。針の先端が目的の損傷を防止するために、（金属·ファイルを使用して）平滑末端化されています。
2。マウスの麻酔
- マウスは、グラムマウス体重当たり8μlの用量で腹腔内投与しケタミン（10 mg / ml）とキシラジン（2 mg / ml）を混合物で麻酔です。鎮静は3内で発生 - 6分と自発呼吸を妨げてはならない。
- 電気かみそりを使用して、ひげをそる喉、胸部、腹部、マウスの右側。
- テープを使用して、薄いプラスチックのまな板にマウスを固定します。マウスの頭部は、オペレータ（ 図3）に向かって指している必要があります。上の歯の下を通過縫合糸のループが提供する穏やかな緊張が頭拡張を維持するように働く。まな板は、気管切開、静脈カテーテル留置中にマウスの覚醒を維持し、加熱パッドの上に置かれている。
- 100％エタノールでウェット剃りエリア。
- テール/足ピンチで十分な麻酔を確認します。最小応答場合の処理;ケタミン/キシラジンの余分なボーラス十分に麻酔していない場合を示します。
3。気管開口術
- 1cmの切開が喉を介して行われます。下層の結合組織を切開され、唾液腺を分離し、横方向に反映されます。気管のすぐ前方胸骨舌骨筋を切除されています。
- 四時縫合糸のループが目の下に進められる電子気管（ 図4）。ループは、気管の根底に縫合糸の2つの別々の鎖を作成し、切断されている。尾縫合糸は、気管切開チューブを固定するために使用されます;頭蓋縫合は気管切開の配置中に気管の張力を提供するために使用されます。
- 2本の指を使用して、上部の縫合が把握されており、穏やかな張力が気管に適用されます。水平切開は、上下糸の間の気管内に作られています。この切開は気管の円周の約3分の2を越える必要があります。フランジ付き気管切開チューブ（ハーバード装置、1.22ミリメートル外径）は、遠位気管に挿入し、尾気管縫合糸を用いて、所定の位置に固定されています。
- 気管切開は、ボリューム制御の小動物ベンチレーター（インスピラ、ハーバード装置）に接続されており、マウスは40％吸入酸素と9 ml / kgを一回換気量（設定は我々の研究室では十分な酸素/換気を維持するために最適化された）で換気される。ポジtive呼気終末陽圧（PEEP）がこの時点で始まっていません。注目すべきは、人工呼吸器の設定は、個々の研究室の中でユニークな条件に最適化する必要があります。冗長チューブ（人工呼吸器のチューブをYコネクタと気管切開の間に介在さ）の異なる長さは任意の選択された一回換気量の安定した肺胞換気量を確保し、デッドスペースを調整するために使用することができます。
4。静脈カテーテル法
- 内部および外頸静脈の接合部は、近位、遠位静脈枝を追跡することによって同定することができる。外頸静が反映唾液腺の下に発見されたが、これは外部頸静接合を見つけるために近位にさかのぼることができます。
- 周囲結合組織から頸静接合を分離するために穏やかな鈍的切開を使用しています。
- 四時の縫合糸を使用し、頸静脈に合流（頭蓋）遠外頸静脈と頸静脈を結紮する。
- 気管分岐部に小切開を加える頸静接合の、出血は最小限であるべきです。
- 2つのカテーテルは、増分切開を通して、頸静脈幹に前進させることができる。返血を確実にするために穏やかな吸引後、カテーテルは午前4時の縫合糸を用いて静脈内に固定される。
- テープ静脈偶発脱落を防止するには、まな板にカテーテル。
5。生体マウス肺顕微鏡手術（田渕らから適応18）
- まな板は（拘束、麻酔マウスと同様にテープ静脈カテーテルを含む）残りの外科的介入が実行される生体顕微鏡のステージに移行します。直腸温度プローブが配置され、このインタフェースを適応加熱システム（まな板の下にあります）で、マウスの覚醒の維持を可能にします。
- 一頚静脈カテーテルはケタミン（10 mg / ml）を、キシラジン（2 mg / ml）を実現し、シリンジポンプに接続されている時間当たり200μlで混合。十分な麻酔が再びテール/足ピンチを使用して確認された。
- 正中切開します（ 図5）の右側に横方向に進む、xyphoidプロセスに首から拡張されています。
- 電気メスを使用して、胸の筋肉は胸郭を露出して、削除されます。ケアは、完全な止血を確実にするために取られる。
- ダウン左側とテープの上にマウスの右hindlegを渡ります。その結果腹部ねじり、手術のしやすさを向上させ、わずかに胸部を回転させます。
- 45度の角度（ 図6）でステージを配置し、この位置では、気胸が誘導されると、肺は胸壁から落下することができます。
- 1回目のリブ（最も劣っリブ）が鉗子で把持して上昇させ、湾曲した鉗子はぶっきらぼうに肋骨の下に押し込まれる。これは胸壁から壁側胸膜を分離します。胸膜はunpuncturedままにしてください。
- ブローチューブとを用いて注射器、空気が強制的に壁側胸膜に対して導入される。これは、基礎となる肺を損傷することなく、胸膜表面と気胸の破裂につながります。基盤となる肺は、肺を損傷することなく、電気メス、鉗子の導入を可能にする、胸の壁から落下します。人工呼吸換気量の減少は、通常、このステップの間に必要とされない。
- 電気メス、鉗子を使用して、胸壁の筋肉組織を解剖し、胸壁に〜8ミリメートル円形の穴を開け、5 番目と6 番目のリブ/壁側胸膜を横切る。出血の存在は顕微鏡（ 図7）が不明瞭になりますようにそれは、完全な止血を維持することが不可欠です。
- 針ドライバを使用して、胸壁の穴に胸腔ドレーンを挿入します。針は、穿刺胸壁と胸郭ウィンドウ（ 図7）に劣ると横胸腔を終了する必要があります。ダイアフラムを刺さないように注意してください。ザその抵抗は、管の有窓部の縁に位置して縫合糸 "ストッパ"から発生するまでチューブをゆっくり胸壁から引き出される。
- ステージは平坦な場所。
- 肺reexpansionを役立てるための人工呼吸器から3cm H 2 OのPEEPを追加します。
- 接着剤（Pattexゲル、ヘンケル）は胸ウィンドウの周りに円周に配置されます。膜が胸腔に外部に面するガラスカバースリップと、装着されている。慎重に（と円周方向に）おおよその綿棒を使用して接着剤への膜。
- 肺リクルートメント手技（PEEPの換気装置のポートが閉塞されている間の3回換気量）を実行している間、-3ミリメートルHgの吸引は胸管に適用されます。肺は自由に潮換気（ 図8）の間に移動させながら、持続的に近似膜べき。
- マウスの右前足は、マウスの左側臥位で、その結果、左側に渡っています。スポンジウェッジは胸ウィンドウが顕微鏡水浸対物レンズと位置合わせされるように適切にマウスを配置するために使用することができます。
- 蒸留水は、水浸対物レンズを用いた肺の可視化を可能にする、顕微鏡の前にカバースリップ上に配置されます。水が断続的にイメージングを通して補充する必要があります。
6。肺内皮表面層の厚さの測定
- 直ちに胸壁閉鎖後、500μlのFITC標識150 kDaのデキストラン（PBS中6％溶液）を第二（非麻酔）頚静脈カテーテルを介して投与される。このボーラスは、ボリューム蘇生だけでなく、ESLの測定のための血管トレーサーとして機能します。デキストランボーラスは、好中球の接着や肺浮腫形成2には影響しません。
- 水浸対物レンズは、カバーガラスの上中央に配置されます。目標の選択が不可欠である-ESLの厚さのわずかな違いは、高numeriを視覚化まだ2を維持したままCAL絞りが（> 0.8）が必要です - 3 mmの作動距離（肺ウィンドウおよび胸膜表面の貫通が可能）。我々は、この目的のためにニコン、CFI 75 LWD 16倍（NA 0.8）とCFI 75 LWD 25倍（NA 1.1）の目標を使用しています。
- 正確に動く臓器のESLの厚さを測定するためには、明視野、蛍光血管の幅が同時に行われることが不可欠である。これは、反射光微分干渉コントラスト（DIC、明視野）およびFITC画像（ 図9）の同時キャプチャが可能イメージスプリッタ（デュアルビュー、Photometrics）を使用して達成することができる。
- 5秒吸気ポーズ中、連続撮影が行われ、記録されます。後で、これらの画像は合焦フレームを識別するために見直される可能性があります。
- 合焦枠、胸膜下の微小血管を（<20μmの直径）を使用すると、識別され、少なくとも3つの微小血管は、通常、単一のフレーム上に発見されています。実験終了後、DICとFITC-デキストラン血管の幅が微小血管ごとに3つの垂直切片の長さを平均化することにより、（盲検観察者による）を測定する。代表的な結果セクションで説明したように、容器の両端に等しいESLの厚さを仮定して、ESLのサイズは、DICおよびFITC-デキストラン血管幅の間の半分の差によって定義することができます。
- 通常、生体顕微鏡、肺傷害や低血圧2のいずれかの証拠もなしに> 90分間行うことができます。予備実験では、観測期間中にマウスの安定（血圧、酸素化、換気、肺傷害）を確認するために実行する必要があります。実験的な薬は、手順中のどの時点でも第二（非麻酔）頸静脈カテーテルを介して導入することができる。
7。肺内皮表面層の整合性の代替測定
無傷の内皮表面層の機能は、（部分的に）circulatを除外する内皮表面2から要素をING。 ESLの整合性は、したがって、細胞表面接着分子（ICAM-1など）にアクセスし、対話するための循環要素の能力（蛍光ミクロスフェアなど ）によって測定することができる。
- 抗ICAM-1標識した蛍光マイクロスフェアは、手術前に用意されている。ストレプトアビジンでコーティングした0.97μmの蛍光マイクロスフェアは、室温で30分間、ビオチン化抗ICAM-1（YN1/1.7.4クローン、1:50、eBioscience社）抗体またはアイソタイプコントロールと共にインキュベートする。ミクロスフェアは、3回洗浄し、ml当たり1×10 9ミクロスでPBSに懸濁する。
- 生体顕微鏡検査の間に、マイクロスフェア懸濁液（100μl）を頚静脈カテーテルに注入される。循環の15分後、蛍光画像を5分かけて捕獲される。 > 5分間動かないマイクロスフェアは、付着し、画像処理ソフトを用いて定量化とみなされます。
8。安楽死
<Pクラス= "jove_content">手続きが完了した後、麻酔したマウスは、直接心臓穿刺を介して放血により安楽死させています。安楽死は肺を後の分析のために採取して瞬間凍結されてからの二国間気胸を介して確認された。Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
手順1-6で説明した実験的なアプローチは、同時DIC（明）と蛍光像の複数のフレームのキャプチャが可能になります。 ESLの厚さを決定するために、記録された画像は、実験プロトコルの完了後に盲検観察者によって審査されます。合焦フレームを使用して、胸膜下微小血管（<20μmの直径）が同定され、少なくとも3つの微小血管は、通常、単一のフレーム（ 図10）に発見されています。画像解析ソフト（NISの要素、ニコン）を使用して、血管の幅は微小血管ごとに3つの垂直切片の長さを平均化することにより、（盲検観察者による）を測定する。 ESLはDICのイメージングには見えないように、DICの血管幅は内皮細胞膜に血管内皮細胞膜にまたがるため、ESLの厚さ9,10が含まれています。これとは対照的に、FITC-デキストラン（150 kDa）をESLから除外されます。したがって、FITC血管幅はESLの厚みを内蔵していません。等しいESL厚いと仮定すると容器の両側にある岬は、ESLの大きさは、したがって、DICおよびFITC-デキストラン血管幅の間の半分の差によって定義することができます。
いくつかの潜在的な技術上の落とし穴は、実験結果の解釈に干渉する場合があります。顕微鏡分野への出血の存在は、胸膜下の微小血管系のDICとFITC可視化の両方を不明瞭になりますので、注意がウィンドウの配置（5.9）中に止血を（電気メスを使用して）取得するために注意しなければなりません。さらに、肺リクルートメント手技（5.14）後reapproximate胸部ウィンドウではないかもしれないが、これは通常、胸部ウィンドウの周りの膜の不完全な円周方向の接着性を示します。これは、通常、繰り返し肺リクルートメント手技が続き、胸部ウィンドウの周囲に接着剤を再度適用することで修正できます。最後に、注意がマウスに静脈内空気の偶然の注射を避けるために注意しなければなりません。空気塞栓は、たとえ致命的ではなく、意志preferenti可視化（非依存）胸膜下の微小血管系のFITC-デキストラン灌流を防止する非依存肺への同盟国の旅、。
ESLの幅の測定はイメージスプリッタ（同時DICと蛍光イメージングを与える）だけでなく、特殊な顕微鏡の目的を使用する必要があります。これらの機器の需要は、我々のプロトコルにはいくつかの修正を回避することができる。グリコカリックスの整合性は、間接的に容器表面から循環ミクロスフェアのESLの除外を決定することによって測定することができる。 ESLの劣化の存在は、したがって、内皮表面接着分子（例えば、ICAM-1など）（ 図11）を標的としたマイクロスフェアの増加胸膜下の微小血管のキャプチャによって示されます。
図1。
図2。
図3。
図4。
図5。
図6。
図7。
図8。
図9。
図10マウス肺ESLの厚さの測定。 （イ）代表者マウス胸膜下の微小血管系（スケールバー、50μm）のDICと蛍光画像を同時に捕獲した。微小血管幅が3垂直線形切片の平均を用いて測定される。 ESLの厚さは、DIC（ESLを含む）および蛍光（ESLの排他的な）の間の半分の差によって決定することができる微小血管の幅（b）は 、DICの測定が正確にほぼ同一のDICと内皮蛍光のTie2-GFPマウス（Jackson Labs）をで行わGFPの血管幅の測定によって実証、胸膜下の血管壁の境界を識別します。実線はアイデンティティの行を表します。静脈リポポリサッカライド（LPS）後に発生したESLの厚さの漸進的な損失によって証明されるように（c）の胸膜下の微小血管系は、縦方向に続くことができます。n = 3のマウスは。 * P時間と比較して、<0.05、ANOVAによって= 0分。
ムービー1。グリコカリックスの整合性は、胸膜下の微小血管内に抗ICAM-1微小球の付着のために評価することによって決定することができます。高速共焦点顕微鏡（ニコンA1R）は静脈内LPSの後に付着した蛍光ミクロスフェア45分（体重kgあたり20 mg）を示しています。循環微小球はoccasionall場合があることに注意してyは微小循環を通過見た。 （緑色蛍光）ミクロス局在の可視化を向上させるために、ステップ6.1のマウスはFITC-デキストランの代わりに血管トレーサーTRITC-デキストラン（150kDaで、6％）で前処理した。 ムービーを見るにはここをクリック 。
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Discussion
生体顕微鏡検査での利用拡大と一致し、ESLの実質的な大きさだけでなく、血管機能への多くの貢献の両方の増加感謝があります。これらの新たなデータは、しかし、主に全身の血管系の研究から派生しています。確かに、肺で生体顕微鏡での使用は重大な肺と心臓の動きのアーチファクトを考えると、技術的に困難である。
最近のいくつかの技術的な進歩は、肺微小循環12,13に生体技術の優れたアプリケーションを与える、移動マウス肺の安定化のために許可されています。これらのアプローチは、しかし、潜在的に肺の不動の生理学的影響によって混同されています。肺が目的論的に連続的な動きのために意図された臓器であるため、肺うっ血は、直感的に肺の生理機能を変化させる。確かに、肺うっ血、内皮nの変化に関連付けられているitric酸化シグナリング、健康で怪我をした肺14、16の両方で多数の下流の結果を伴う経路。また、人工呼吸器の"atelectrauma"特性と一致して有害なせん断力に肺胞を取り囲む肺科目の1つの地域の固定化は、肺損傷19を誘導する 。これらおよび他のまだ·ツー·ザ·識別することが肺うっ血の結果は肺微小血管（病態）生理学の生体観測の解釈に混乱させる可能性があります。
これらの懸念を考えると、我々は、肺のESLを自由に移動、in vivoでのマウス肺で研究することができた方法を開発しようとした。我々は、田淵とキュブラー、肺障害18を扇動することなく自由に動くマウス肺の長手方向の可視化を可能にするアプローチの手法を適応することを選んだ。重要なのは、私たちのアプローチは、田淵のオリジナルプロトコルからいくつかの微妙な変更を含んでいます。これらアルテラ我々の研究室内で一意である条件に対応する必要性から進化しtions。同様に、ESLの測定の我々のモデルの採用は、他の場所でマウスの血行動態の安定性、酸素化、換気、および肺損傷が無いことを保証するために同様の最適化が必要になります。
我々は、ESL測定への我々の主要なアプローチとしてデキストランの除外を使用することにしました。 ESLの測定は、肺と心臓の動きのアーチファクトを否定し、時間内に単一の瞬間から作ることができるように、この技術は、我々のモデルに適しています。全身の微小血管系の以前の研究では、デキストラン除外は小血管（<15μmの6）でのみ正確であることを示唆しているが、我々は直径30μmの血管における調和ESLの変更を指摘している。これらの不一致は、胸膜表面に特有の光学特性に起因することがあります。
移動血管床では、それは必要不可欠であることを明視野および蛍光イメージングO画像収集でも短い遅延（順次画像間例えばシャッター閉鎖）として同時にccursは、致命的にESLの厚さの測定を混乱させるだろう。換気はこの交絡を低下させる可能性が一時停止中に、吸気ポーズは完全に20（ "振り子空気"）不均一に膨張し、負傷した肺でガスの再分配から心臓の動きアーチファクトまたは呼吸アーチファクトを防ぐことはできません。我々は、同時に単一のCCDカメラに明視野と蛍光画像を送信するイメージスプリッタを使用することを選択。別のアプローチは、潜在的に同時に共焦点顕微鏡の間の反射光と蛍光画像をキャプチャするためのダイクロイックミラーの使用を含めることができます。
我々のモデルの追加の重要な需要は、特殊な水浸目的の利用である。これらの目標は、まだmaintaininながら血管幅のわずかな違いの分解能を可能にするために十分な大きさの開口数を持っている必要がありますグラム胸部ウィンドウと胸膜表面の両方に浸透するのに十分なワーキングディスタンス。これらの目的は、利用可能な一方で、非常に高価です。 DICは血管幅測定の精度を向上させるように反射光微分干渉コントラスト（DIC）顕微鏡の使用は、染色されていない組織の縁を強調明技術は、さらに望ましい。
代替技術は、肺ESLの幅を決定するために存在しています。マイクロスフェア流速を正確に移動血管床で実行することはできませんが、微小球の接着は、間接的に肺のグリコカリックスの整合性をテストするために使用することができる。我々は以前に無傷のESL機能は2内皮細胞表面接着分子からの微小球を循環除外することが示されている。内皮表面に抗ICAM-1の微小球癒着の存在が故に糖衣/ ESLの整合性が失われたことを示します。この手法は、同時brightfを必要としませんield /蛍光イメージング、また、高い開口度の対物レンズが必要です。しかしながら、1つの重要な注意点が存在します：糖衣損失を示すために増加した抗ICAM-1微小球の接着のために、対照群と実験群間で類似してICAM-1の細胞表面発現が存在しなければならない。 ICAM-1の内皮表面発現は敗血症誘発肺傷害2に早期（<45分）安定的に推移しているが、表面発現は、最終的に、NF-κB依存的に21に増加します。グリコカリックスの整合性のマーカーとしてミクロス接着の使用は、それゆえ、初期の炎症時にのみ有効であるかもしれません。
注目すべきは、我々の手術や顕微鏡技術が肺障害2を誘導しないが、それは実験的な肺障害を進化させる方法は不明である（気管内酸注入により誘発されるなどけが）ESLの厚さの測定に影響を与えます。進化肺水腫は、潜在的に血管幅のDICの測定値を混乱させる可能性がおよび/または影響デキストランの透過性。この不確実性は、肺のESLの観測された変化を確認するために、複数の技術の補完的な使用（ 例えばデキストラン排除、微小球の接着、並びに血管グリコサミノグリカンコンテンツ2の確証組織学的ア セスメント）によって軽減することができます。
要約すると、最初は田淵とキューブラーによって報告された外科的アプローチを拡大することによって、我々は、肺のESLの詳細な観察を可能にする実験モデルを開発しました。このモデルを使用することにより、健康と疾患における肺血管生理学に対する内皮グリコカリックスの重要性をより深く理解するために許可する必要があります。
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Disclosures
特別な利害関係は宣言されません。
Acknowledgments
我々は博士に感謝します。生体顕微鏡に関する命令のアラタ田淵とWolfgangキュブラー（トロント大学）。私たちは、顕微鏡の設計と実装を支援するためのアンドリュー·ケーヒル（ニコンインスツルメンツ）に感謝。この作品は、NIH / NHLBI助成P30 HL101295とK08 HL105538（EPSまで）によって賄われていた。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Name of Reagent | |||
| FITC-dextran (150 kDa) | Sigma | FD150S | |
| TRITC-dextran (150 kDa) | Sigma | T1287 | |
| Streptavidin-coated fluorescent microspheres | Bangs Laboratories | CP01F/10428 | Dragon Green fluorescence (similar to FITC) |
| Ketamine | Moore Medical | ||
| Xylazine | Moore Medical | ||
| Anti-ICAM-1 biotinylated antibody | eBioscience | Clone YN1/1.7.4 | 1:50 dilution |
| Isotype biotinylated antibody | eBioscience | IgG2b eB149/10H5 | 1:50 dilution |
| EQUIPMENT | |||
| Mechanical ventilator | Harvard Apparatus | Inspira | |
| Tracheostomy catheter | Harvard Apparatus | 730028 | |
| Electrocautery apparatus | DRE Medical | Valleylab SSE-2L | |
| Bipolar cautery forceps | Olsen Medical | 10-1200I | 9.9cm McPherson |
| Temperature control system | World Precision Instruments | ATC1000 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | Pump 11 Elite | |
| Microscope (widefield) | Nikon | LV-150 | |
| Microscope (confocal) | Nikon | A1R | |
| Image splitter | Photometrics | DV2 | |
| CCD camera | Photometrics | CoolSNAP HQ2 | |
| Image processing software | Nikon | NIS Elements | |
| Polyvinylidene membrane | Kure Wrap | ||
| Circular cover slip | Bellco | 5CIR-1-BEL | 5 mm, #1 thickness |
| Glue (cover slip to membrane) | Pattex | Flussig (liquid) | For affixing cover slip to membrane |
| Glue (cover slip to mouse) | Pattex | Gel | For attaching membrane to mouse |
| Surgical tubing | Intramedic | PE50, PE10 | |
| Suture | Fisher | 4:0 silk | |
| Electric razor | Oster | 78997 | |
| Curved surgical forceps | Roboz | ||
| Straight surgical forceps | Roboz | ||
| Surgical scissors | Roboz | ||
| Surgical microscissors | Roboz | ||
| Surgical needle driver | Roboz | ||
| Surgical tape | Fisher | ||
| Kitchen sponges (cut into wedges) | various | ||
References
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