Summary
Endotelyal endotel / glycocalyx yüzey tabakası ideal intravital mikroskobu kullanılarak incelenmiştir. Intravital mikroskop teknik gibi akciğer gibi hareketli bir organ zordur. Biz eş zamanlı aydınlık ve floresan mikroskop serbestçe-hareket eden endotel yüzey tabakasının kalınlığını belirlemede nasıl kullanılabileceğini göstermek
Abstract
Endotel glycocalyx vasküler lümeni döşeyen proteoglikanlar ve ilişkili glikozaminoglikanlar bir tabakadır. İn vivo olarak, glycocalyx endotel fonksiyonun korunmasında katkıda önemli bir endotel yüzey tabakası (ESL) oluşturan, son derece sulu olduğunu. Endotel glycocalyx genellikle in vitro olarak anormal bir doku ve standart tekniklerle tespit sırasında kaybolur gibi, ESL çalışma intravital mikroskopi kullanımını gerektirir. Alveoler mikrovasküler iyi yaklaşık karmaşık fizyolojisi için, pulmoner intravital görüntüleme ideal bir serbestçe hareket eden akciğer gerçekleştirilir. Bu preparatlar, bununla birlikte, genelde geniş hareket artefaktı muzdarip. Bir serbestçe hareket eden bir fare akciğer bölgesinin, kapalı göğüs intravital mikroskopisi endotel yüzey floresan-etiketli yüksek molekül ağırlıklı dekstranlar ve ESL dışlama yoluyla glycocalyx bütünlük ölçmek için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir. Gerektirir Bu non-kurtarma cerrahi teknik,eşzamanlı aydınlık ve fare akciğer floresan görüntüleme, karıştırıcı akciğer hasarı inducing delil olmadan subplevral mikrovasküler uzunlamasına gözlem için izin verir.
Introduction
Endotel glycocalyx damar intima astar proteoglikanlar ve ilişkili glikozaminoglikanların bir hücre dışı bir tabakadır. İn vivo olarak, glycocalyx nötrofil endotel sıvı geçirgenliği, 1 de dahil olmak üzere endotel çeşitli fonksiyonları düzenler önemli bir endotel yüzey tabaka (ESL) şekillendirme, yüksek hidratlanır yapışma 2, ve sıvı makaslama kuvveti 3 mechanotransduction.
Tarihsel olarak, glycocalyx dolayı standart doku fiksasyonu ve işleme 6 sırasında kültürlü Hücre preparatlarının 4, 5 ve degradasyon yılında aberrance için underappreciated olmuştur. Artan kullanımı intravital mikroskopi 7 (in vivo mikroskopi, IVM) sağlık ve hastalık sırasında damar işlev ESL önemi artan bilimsel ilgi ile çakıştı. ESL ışık mikroskobu ile görülemez ve kolayca etiketli edilemezRBC aglütinasyon 8 ve fatal pulmoner emboli (yayınlanmamış gözlemler) neden floresan glycocalyx-bağlayıcı lektin eğilimini verilen vivo,. Birçok dolaylı yaklaşımlar dolayısıyla böyle kremaster ve mezenterik mikrodolaşımını olmayan hareketli vasküler yataklarda ESL kalınlığı (ve, uzatma, glycocalyx bütünlüğü) anlamak için geliştirilmiştir. Bu teknikler, endotel yüzeyinden endotel zar (Mikropartikül görüntü velosimetri 9) yanı sıra, hantal, floresan-etiketli damar işaretleyicileri (örneğin dekstranlar) kapsamından ölçüm mesafe bir fonksiyonu olarak hız mikropartikül dolaşan farklılıklar ölçümü, (dekstran dışlama tekniği 10, 11). Bu teknikler, sadece dekstran dışlanma zaman içinde tek bir noktada yapılan ölçümlerden ESL kalınlığı tahmin yeteneğine sahiptir. Eşzamanlı olarak aydınlık mikroskobu (genişliği kullanılarak vasküler genişlikleri ölçerek"görünmez" ESL) ve ESL dışlanmış bir vasküler tracer floresan mikroskop clusive, ESL kalınlığı vasküler genişlikleri 2 arasındaki bir buçuk fark olarak hesaplanabilir.
ESL kalınlığı ani bir ölçü kullanılması pulmoner glycocalyx çalışmaları için çok uygundur. Akciğer intravital mikroskopi belirgin pulmoner ve kardiyak hareket artefaktı verilen zordur. Son gelişmeler vivo 12, 13 fare akciğer immobilizasyonu için izin iken, endişeleri akciğer staz fizyolojik etkileri ile ilgili hangi. Akciğer hareketsizlik 14 sinyalizasyon azalmış endotelyal nitrik oksit, nötrofil adezyonu 15 ve akciğer hasarı 16 hem de etkilediğini bir sinyal yolağı ile ilişkilidir. Dahası, klasik fizyolojik kavramlar doğrultusunda akciğer zararlı kesme kuvvetleri ("atelectrauma" denilen) mobil alveoller çevreleyen ortaya bir alanı immobilizasyonu,alveoler bağımlılık 17.
2008 yılında, Arata Tabuchi, Wolfgang Kuebler ve arkadaşları serbestçe hareket eden fare akciğer 18 intravital mikroskopi için izin veren bir cerrahi tekniği geliştirdi. Bu teknik kaynaklanan Solunum dışlayıcı aydınlık ve floresan mikroskobu ile eş zamanlı ölçüm da dahil olmak üzere yüksek hızlı görüntülemede kullanımı tarafından etkisiz olabilir. Anlık dekstran dışlama görüntüleme in vivo, serbestçe hareket fare akciğer subplevral mikrosirkülasyon ESL kalınlığını ölçmek için istihdam edilebilir Bu yazıda ayrıntılı. Bu teknik, kolayca, fonksiyon özellikle glycocalyx belirlemek için endotel yüzeyinden dolaşan elemanları dışarıda bırakmak ESL bir bozulmamış bir yeteneklerini değiştirilebilir. Biz son zamanlarda, sepsis 2 gibi sistemik inflamatuar hastalıklar sırasında akut akciğer hasarı gelişmesine pulmoner ESL bütünlüğünün önemini belirlemek için bu teknikler kullandık.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cerrahi Boru, Vasküler Kateterler, Göğüs Duvarı Pencere hazırlanması
- Intravital mikroskop sahne. Biz anestezi fare mikroskopi sırasında yatıyor bunun üzerine pleksiglas sahne ısmarlama. Bu aşama 10 cm esnek plastik kesme tahtası (fare anestezi indüksiyonu, trakeostomi yerleştirme ve venöz kateterizasyon sırasında yatıyor bunun üzerine) yanı sıra, benzer bir büyüklükte bir ısıtma elemanı (kesme tahtası altında bulunan) bir 15 cm de barındırmaktadır.
- Fare torakostomi tüpünün hazırlanması (Şekil 1). PE 50 tüpü (Intramedic, iç çapı 0.58 mm, dış çapı 0.965 mm) olan bir 10 cm uzunluğunda kesilir. Bir ucu kavisli bir 23 gauge iğneden kör ucuna takılır, bu iğne göğüs pencerenin kapanması öncesinde, göğüs duvarı (→ dışında içine) yoluyla tüp geçirmek için kullanılır.
Tüpünün distal ucu (ekteki 23 gauge karşısında uzunluğu 1.5 cm,iğne) art arda intratorasik hava etkili aspirasyon kolaylaştırmak için "yan port" oluştururken, 30 gauge iğne ile delinirse.
Bu fenestre kısmı daha sonra 04:00 ipek sütür çeşitli çevresel döngüler tarafından tüpün geri kalanından ayrılır; bu döngü sonuçta 1,5 cm göğüs boşluğu içinde kısmı fenestre ankraj, bir "stopper" olarak görev yapacak. - Juguler venöz kateterler. PE 10 boru (Intramedic, iç çapı 0.28 mm, dış çapı 0.61 mm) İki 15 cm uzunlukta kesilir. Bir bisturi böylece Damara kolaylığı artan konik borusunun uçları için kullanılır. Hortum hortumu-olmayan kesik ucuna bağlı% 6 150 kDa dekstran çözeltisi (PBS) ihtiva eden 1 ml şırınga yolu ile temizlendi.
- Göğüs duvarı pencere hazırlama (Şekil 2). Şeffaf poliviniliden membran (Yeni Kure Wrap, Kuresha, Tokyo) oval bir şekil (ana eksen 6 cm, ikincil eksende 4 cm) halinde kesilir. Dairesel 5 mm # 1 lamel (Bellco) α-siyanoakrilat yapıştırıcı kullanarak membran (Pattex flüssig, Henkel, Düsseldorf) yapıştırılmıştır.
- . Pnömotoraks indüksiyon ("darbe tüp"), bir boru sistemi 10 cm uzunluğunda (iç çapı 3 mm, çap 5 mm) için boru 5 ml'lik şırınga ile bağlanır; ucunu hayvan göğüs kafesinin içine hava tanıtmak için kullanılacaktır göğüs duvarı penceresi engraftman öncesinde.
- Amaca suya daldırma için şırınga. Bir 23 gauge iğne damıtık su içeren bir 30 mL şırınga ile eklenmiştir. İğne ucu amaç hasar görmesini önlemek için (bir metal dosya kullanılarak) bulanıklaştırılır.
2. Fare Anestezi
- Bir fare ketamin (10 mg / ml) ve ksilazin (2 mg / ml) fare gram vücut ağırlığı başına ul 8 arasında bir dozda intraperitonal karışımı ile anestezi. Sedasyon 3 içinde gerçekleşir - 6 dk ve spontan solunumu engel olmamalıdır.
- Elektrikli traş kullanarak, tıraşboğaz, göğüs, karın ve farenin sağ tarafında.
- Teyp kullanarak, ince bir plastik kesme tahtası için fareyi sabitleyin. Fare baş operatörü (Şekil 3) doğru olmalıdır. Üst dişlerin altında sütür geçen bir döngü tarafından sağlanan Nazik gerginlik baş uzantısı korumak için hizmet vermektedir. Kesme tahtası trakeostomi ve venöz kateter yerleştirilmesi sırasında fare euthermia koruyarak, bir ısıtma yastığı üzerine yerleştirilir.
- % 100 etanol ile Islak traş alanlar.
- Bir kuyruk / pençe tutam yeterli anestezi onaylayın. Minimal yanıt eğer devam; ketamin / xylazine değilse yeterli anestezi ekstra bir bolus sağlar.
3. Trakeostomi
- 1 cm'lik bir kesi boğaz üzerinde yapılır. Altta yatan bağ doku disseke edilir ve tükrük bezleri ayrılmış ve yanal yansıtılmaktadır. Trakeanın hemen anterior sternohyoid kas rezeke edilir.
- 04:00 sütür bir döngü inci altında ilerletilirE trakea (Şekil 4). Döngü sonra trakea yatan sütürün iki ayrı ipliklerini oluşturarak, kesilir. Kaudal sütür trakeostomi tüpü sabitlemek için kullanılır; kraniyal sütür trakeostomi yerleştirme sırasında trakea üzerindeki gerginliği sağlamak için kullanılacaktır.
- Iki parmak kullanılarak, üst dikiş kavranmasını ve yumuşak gerilim trakea uygulanır. Bir yatay kesik üst ve alt dikişler arasında, trakea yapılır. Bu kesi trakeal çevresi yaklaşık üçte ikisi geçmelidir. Bir flanşlı trakeostomi tüpü (Harvard Apparatus, 1.22 mm dış çap) trakeaya yerleştirilir ve kaudal trakeal dikiş kullanılarak yerine sabitlenir.
- Trakeostomi bir hacim kontrollü küçük hayvan ventilatör (Inspira, Harvard Apparatus) bağlanır ve fare% 40 solunan oksijen ve 9 ml / kg tidal hacimleri (ayarlar Laboratuvarımızda yeterli oksijenasyon / ventilasyon korumak için optimize) ile havalandırılır. Positive ekspirasyon sonu basınç (PEEP) bu noktada başlamış değildir. Unutmayın ki, ventilatör ayarları bireysel laboratuvarlar içinde benzersiz koşulları için optimize edilmelidir. Yedek tüp (ventilatör boru Y-konnektör ve trakeostomi arasına yerleştirilen) Farklı uzunluklarda seçilen herhangi bir tidal hacim için kararlı alveoler ventilasyon sağlanması, ölü boşluk ayarlamak için kullanılabilir.
4. Venöz Kateterizasyon
- Iç ve dış juguler venin birleşim proksimale Distal venöz dallarda izleme tarafından tespit edilebilir. Eksternal juguler yansıyan tükürük bezlerinin altında bulunursa, bu dış-iç juguler kavşak bulmak için proksimalde izlenebilmektedir.
- Bağ dokusu çevredeki juguler kavşak ayırmak için hafif künt diseksiyon kullanın.
- 04:00 sütürler kullanarak, juguler kavşağına (kranial) distal eksternal juguler ve internal jugular venler kapalı kravat.
- Karina içine küçük bir kesi olunjuguler kavşağın; kanama az olmalıdır.
- İki kateterler artımlı kesiden ve juguler gövde içine gelişmiş olabilir. Kanın geri dönüşünü sağlamak için nazik aspirasyon sonra, kateter 04:00 sütürler kullanılarak damar içinde sabitlenir.
- Bant venöz kazara yerinden çıkması karşı önlemek için kesme tahtası için kateterler.
5. Intravital Fare Akciğer Mikroskopi Cerrahisi (Tabuchi ark uyarlanmıştır. 18)
- Kalan cerrahi girişim uygulandı nereye kesme tahtası (ölçülü, anestezi fare yanı sıra bantlanmış venöz kateterler içeren), intravital mikroskop aşamasına geçilmiştir. Bir rektal ısı probu yerleştirilir, bu arabirimleri adaptif bir ısıtma sistemi (kesme tahtası altında bulunan), fare euthermia bakım sağlar.
- Bir jugular damar kateterin bir ketamin (10 mg / ml)-ksilazin (2 mg / ml) veren bir şırınga pompası bağlanırSaatte 200 ul at karışımı. Yeterli anestezi yine kuyruk / pençe tutam kullanılarak doğrulanır.
- Orta hattan bir kesik sonra (Şekil 5) sağ tarafına doğru yanal olarak devam edilerek, xyphoid işlemi boyun uzatılır.
- Elektrokoter kullanımı, göğüs kaslarının göğüs kafesinin açığa çıkarılır. Bakım tam hemostaz sağlamak için alınır.
- Sol tarafta ve bant üzerinde farenin sağ hindleg aşağı çapraz. Çıkan karın torsiyon ameliyatı kolaylığı iyileştirilmesi, hafif göğüs döner.
- 45 derecelik bir açıyla (Şekil 6) sahneye yerleştirin; Bu konumlandırma pnömotoraks indüklenir kez akciğer göğüs duvarı uzak düşmesini sağlar.
- 1. kaburga (en aşağı kaburga) bir forseps ile kavradı ve yükseltilmiş; kavisli bir forseps dobra dobra kaburga altında itilir. Bu göğüs duvarından parietal plevra ayırır. Plevra unpunctured kalmalıdır.
- Darbe tüp ve kullanmabir şırınga, hava zorla parietal plevra karşı tanıtıldı. Bu, alttaki akciğer hasar vermeden plevral yüzey ve pnömotoraksın yırtılmasına yol açar. Altta yatan akciğer akciğer zarar vermeden elektrokoter forseps tanıtımına olanak, göğüs duvarı uzak düşecek. Vantilatör gelgit hacmi azalma tipik bu adım sırasında gerekli değildir.
- Elektrokoter forseps kullanarak, göğüs duvarı kasları incelemek ve göğüs duvarı içine bir ~ 8 mm yuvarlak delik yaparak, 5 inci ve 6 inci kaburga / parietal plevra arasında kesti. Kanama varlığında mikroskobu (Şekil 7) belirsizleştirecektir gibi, tam hemostaz muhafaza edilmesi önem taşımaktadır.
- Bir iğne tornavida kullanarak, göğüs duvarı deliğe torakostomi tüpü yerleştirin. İğne ve göğüs duvarı torasik penceresi (Şekil 7) inferior ve lateral torasik kavite çıkmak gerekir. Diyaframı delen önlemek için dikkatli olun.Bu direnç tüp fenestre bölümünün kenarında bulunan dikiş "stopper" dan oluşuncaya kadar tüpü yavaşça göğüs duvarının dışarı çekilir.
- Sahne düz yerleştirin.
- Akciğer reekspansiyonu yardımcı yardımcı olmak için ventilatöre 3 cm H 2 O PEEP ekleyin.
- Tutkal (Pattex jel, Henkel) göğüs pencerenin etrafında çepeçevre yerleştirilir. Membran göğüs boşluğuna dış bakan cam kapak kayma ile takılır. Dikkatlice (ve çevresel olarak) yaklaşık bir pamuk aplikatör kullanarak tutkal membran.
- Bir akciğer recruitment manevrasına (PEEP ventilatörün portu tıkalıysa sırasında 3 tidal hacimleri) gerçekleştirirken, -3 mm Hg emme göğüs tüpü uygulanır. Serbestçe tidal ventilasyon (Şekil 8) esnasında hareket ederken akciğer ısrarla yaklaşık membran olmalıdır.
- Farenin sağ ön bacağını fare sol lateral dekübit pozisyonda sonuçlanan, sol tarafa geçti edilir.Sünger kamalar göğüs pencere mikroskopi suya daldırma objektif ile hizalanacak şekilde uygun bir şekilde fare yerleştirmek için kullanılabilir.
- Distile su bir su daldırma objektif kullanarak, akciğer görüntülenmesi için izin mikroskop önce kapak slipi üzerinde yerleştirilir. Su aralıklı görüntüleme doldurulan gerekir.
6. Pulmoner Endotel Yüzey Tabakası Kalınlığı Ölçümü
- Hemen göğüs duvarı kapatılmasından sonra, 500 ul FITC-etiketli 150 kDa dekstran (PBS içinde% 6 çözelti) ikinci (non-anestezi) juguler venöz kateter yoluyla uygulanır. Bu bolus hacmi resüsitasyon yanı sıra ESL ölçümü için vasküler izleyici olarak hizmet vermektedir. Dekstran bolus Nötrofil adezyon veya akciğer ödemi oluşumu 2 etkilemez.
- Su immersiyon objektif kapağı astar üzerine ortalanır. Objektif seçimi temel-olduğunu ESL kalınlık küçük farklılıklar Nümerik bir yüksek görselleştirmekHala 2 korurken cal diyafram (> 0.8) gerekli - 3 mm çalışma mesafesi (akciğer pencere ve plevral yüzey yoluyla girmesini sağlayarak). Bu amaçla 75 LWD 25x (NA 1.1) hedeflerine Nikon CFI 75 LWD 16x (NA 0,8) ve CFI kullanın.
- Doğru hareket eden bir organ ESL kalınlığını ölçmek için, aydınlık ve floresan vasküler genişlikleri aynı anda gerçekleştirilecektir esastır. Bu eşzamanlı yansıyan ışık diferansiyel girişim kontrast yakalama (DIC, aydınlık) ve FITC görüntüleri (Şekil 9) sağlayan bir görüntü ayırıcı (Dual View, Fotometrik) kullanılarak gerçekleştirilebilir.
- 5 saniye inspiratuar aralık sırasında sürekli görüntüleme yapılır ve kaydedilir. Daha sonra bu görüntüler odak çerçeveleri tanımlamak için gözden geçirilebilir.
- Bir in-odaklama çerçevesi, subplevral mikrodamar (<20 mikron çapında) tanımlanmıştır kullanma; en az 3 mikrodamar genellikle tek bir çerçeve bulunur. Deney, DIC tamamlanmasından sonrave FITC-dekstran vasküler genişlikleri mikrodamar başına üç dik yakaladığını uzunlukları ortalaması alınarak (bir kör gözlemci tarafından) ölçülür. Damar her ucunda eşit ESL kalınlık varsayarak, ESL boyut ve DIC gibi Örnek Sonuçlar bölümünde anlatılan FITC-dekstran damar genişliği arasındaki bir buçuk fark ile tanımlanabilir.
- Tipik olarak, intravital mikroskopi akciğer yaralanması veya hipotansiyon 2 görülmeksizin> 90 dakika süre ile gerçekleştirilebilir. Hazırlık deneyleri gözlem dönemi sırasında fare stabilite (kan basıncı, oksijenasyon, ventilasyon, akciğer hasarı) onaylamak için yapılmalıdır. Deneysel ilaçlar işlem sırasında herhangi bir noktada ikinci (non-anestetik) juguler kateter yoluyla sokulabilir.
7. Pulmoner Endotel Yüzey Katman Bütünlüğü Alternatif Ölçme
Intakt endotel yüzey tabakası fonksiyonları (kısmen) dolaşımdaki dışlamak içinendotel yüzeyi 2 ing elemanları. ESL bütünlüğünün bu nedenle giriş ve hücre yüzeyine yapışma molekülleri (örneğin, ICAM-1 gibi) ile etkileşim için bir döner elemanın becerisi (bir floresan mikrosfer gibi) ile ölçülebilir.
- Anti-ICAM-1 etiketli floresan mikrosferler ameliyattan önce hazırlanır. Streptavidin-kaplı 0.97 mikron floresan mikrosferler oda sıcaklığında 30 dakika için biyotinile anti-ICAM-1 (YN1/1.7.4 klon, 1:50, eBioscience) antikor veya izotip kontrolü ile inkübe edilir. Mikroküreler üç kez yıkandı ve ml başına 1 x 10 9 mikrosferler de PBS içinde süspansiyon haline getirilmiştir.
- Intravital mikroskopi sırasında, mikrosfer süspansiyon (100 ul) boyun kateteri venöz içine enjekte edilir. Dolaşımı 15 dakika sonra, fosforlu görüntü 5 dakikalık bir süre içinde elde edilir. > 5 dakika boyunca hareketsiz Mikroküreler yapışık ve görüntü işleme yazılımı kullanılarak sayısal olarak kabul edilir.
8. Ötenazi
<prosedürün tamamlanmasından sonra p class = "jove_content">, anestezi fareler direkt kardiyak ponksiyon ile kan kaybından tarafından ötenazi uygulanır. Ötenazi akciğerler daha sonra analiz için hasat ve ek dondurulmuş hangi sonrasında bilateral pnömotoraks, ile teyit edilir.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
1-6 adımları açıklanan deneysel yaklaşım eşzamanlı DIC (aydınlık) ve floresan görüntülerin birden çok kare yakalama izin verir. ESL kalınlığı belirlemek için, kaydedilen görüntülerin deneysel protokol tamamlandıktan sonra kör gözlemci tarafından incelenir. Bir in-odaklama çerçevesi, subplevral mikrodamar (<20 mikron çapında) tanımlanmıştır kullanma; en az 3 mikrodamar genellikle tek bir çerçeve (Şekil 10) bulunur. Görüntü analiz yazılımı (NIS Elemanları, Nikon) kullanarak, vasküler genişlikleri mikrodamar başına üç dik yakaladığını uzunlukları ortalaması alınarak (bir kör gözlemci tarafından) ölçülür. ESL DIC görüntüleme için görünmez olduğu gibi, DIC, vasküler endotel genişlikleri zar, endotel zar kapsar ve bu nedenle ESL kalınlık, 9, 10 dahildir. Buna karşılık, FITC-dekstran (150 kDa) ESL çıkarılmıştır. Sonuç olarak, FITC vasküler genişlikleri ESL kalınlığı dahil değildir. Eşit ESL kalın varsayarsakdamar her ucunda lik, ESL boyut bu nedenle DIC ve FITC-dekstran damar genişlikleri arasında bir buçuk fark ile tanımlanabilir.
Çeşitli potansiyel teknik tuzaklar deney sonuçlarının yorumlanması etkileyebilir. Mikroskopi alana kanama varlığı subplevral mikrovasküler DIC ve FITC görselleştirme hem de karanlık olacak, bu nedenle bakım pencere yerleştirme (5.9) hemostaz (elektrokoter kullanılarak) elde etmek için alınmalıdır. Ayrıca, akciğer recruitment manevrasına (5.14) sonra reapproximate torasik pencerede değil azamet; Bu genellikle göğüs penceresinin etrafındaki membranın eksik çevresel yapışma gösterir. Bu genellikle bir tekrar akciğer recruitment manevrasına ardından, torasik pencerenin etrafında tutkal tekrar uygulama tarafından düzeltilebilir. Nihayet, bakım fareye intravenöz hava kazara enjeksiyonu önlemek için alınmalıdır. Hava embolisi bile ölümcül değil, preferenti olacak görüntülenmiştir (nondependent) subplevral mikrovasküler FITC-dekstran perfüzyonu engelleyen nondependent akciğere müttefiki seyahat.
ESL genişlikleri ölçümü bir görüntü ayırıcı (eşzamanlı DIC ve floresan görüntüleme karşılayabilme) yanı sıra, özel bir mikroskop amaçları kullanımını gerektirir. Bu ekipman talepleri bizim protokolüne bazı değişikliklerle önlenebilir. Glycocalyx bütünlük dolaylı olarak kap yüzeyinden dolaşan mikro ESL dışlama belirlemek suretiyle ölçülebilir. ESL bozulma varlığı, bu nedenle, endotel yüzey yapışma molekülleri (örneğin ICAM-1 gibi) (Şekil 11) karşı hedeflenen mikro artan subplevral mikrovasküler yakalama ile gösterilir.
Şekil 1.
Şekil 2.
Şekil 3,.
Şekil 4.
Şekil 5,.
Şekil 6.
Şekil 7.
Şekil 8.
9 Şekil.
Şekil 10. Fare pulmoner ESL kalınlığının ölçülmesi. (A) Örnek fare subplevral mikrovasküler (ölçek çubuğu, 50 um) DIC ve floresan görüntüler eşzamanlı olarak yakalanmış. Mikrodamar genişlik üç dikey doğrusal kesicilerimizden ortalama kullanılarak ölçülür. ESL kalınlık, DIC (ESL dahil) ve floresan (ESL hariç olmak üzere) arasında bir buçuk farkı tespit edilebilecekmikrodamar genişlikleri. (b) DIC ölçümleri doğru olarak neredeyse özdeş DIC ve endotel-floresan TIE2-GFP fareler (Jackson Labs) yapılan GFP damar genişliği ölçümleri gösterdiği, subplevral damar duvarı sınırları belirlemek. Katı hat kimlik hattını temsil etmektedir. Intravenöz lipopolisakkarid (LPS). N = 3 fare sonra meydana gelen ESL kalınlığı sürekli bir şekilde azalması ile kanıtlandığı gibi (c) subplevral mikrovasküler, uzunlamasına olarak takip edilebilir. * P zamanlı varyans = 0 dak karşılaştırıldığında <0.05.
Film 1. Glycocalyx bütünlük subplevral mikrovasküler içinde anti-ICAM-1 mikrosfer yapışma için değerlendirilmesi suretiyle tespit edilebilir. Yüksek hızlı konfokal mikroskobu (Nikon A1R) intravenöz LPS (kg vücut ağırlığı başına 20 mg) sonra yapışık floresan mikrosferler 45 dk gösteriyor. Dolaşımdaki mikroküreler occasionall olabilir unutmayıny mikrosirkülasyon geçerken gördüm. (Yeşil floresan) mikroküre localisation görselleştirme geliştirmek için, adım 6.1 fareler FITC-dekstran yerine vasküler izleyici TRITC-dekstran (150 kDa,% 6) ile tedavi edildi. filmi görmek için buraya tıklayın .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vivo mikroskopi arasında genişleyen kullanımı ile çakışık, ESL önemli boyutu yanı sıra vasküler fonksiyonu olan sayısız katkıları hem artan takdir vardır. Bu ortaya çıkan veriler, ancak, esas olarak sistemik vasküler çalışmalarından elde edilir. Nitekim, akciğerde vivo mikroskobu kullanımı teknik olarak verilen belirgin pulmoner ve kardiyak hareket artefaktı, meydan okuyor.
Çeşitli yeni teknik gelişmeler akciğer mikro 12, 13 intravital tekniklerin iyi bir uygulama affording, hareketli fare akciğer stabilizasyonu için izin vermiş. Bu yaklaşımlar, ancak potansiyel olarak akciğer hareketsizlik fizyolojik etkileri karmakarışık hale gelmektedir. Akciğer teleolojik sürekli hareket için tasarlanmıştır bir organ olduğu için, akciğer stazı sezgisel pulmoner fizyoloji değiştirecektir. Gerçekten de, akciğer endotelyal durağanlık n değişiklikler ile ilişkiliitric oksit sinyalizasyon, sağlıklı ve yaralı akciğer 14, 16 hem çok sayıda downstream sonuçları olan bir yol. Ayrıca, vantilatör "atelectrauma" özelliği ile tutarlı zararlı kesme kuvvetlerine karşı alveolleri çevreleyen akciğer konulardan birisidir alanı, immobilizasyon akciğer hasarı 19 neden. Bunlar ve diğer yet-to-tespit edilmesi akciğer staz sonuçları pulmoner mikrovasküler (pato) fizyolojinin intravital gözlemler şaşırtmaya yorumlanması olasıdır.
Bu kaygıları göz önüne alındığında, pulmoner ESL serbestçe hareket eden, in vivo fare akciğer okudu olabilir hangi bir yöntem geliştirmeye çalıştılar. Biz Tabuchi ve Kuebler, akciğer hasarı 18 tahrik olmadan serbestçe hareket eden fare akciğer boyuna görselleştirme sağlayan bir yaklaşım tekniği uyarlamak için seçti. Önemlisi, bizim yaklaşımımız Tabuchi orijinal protokol birkaç ince değişiklikler içerir; bu alteraLaboratuvarımızda içinde benzersiz koşulları karşılamak için ihtiyaç evrimleştiği FONKSİYONLARIN. Benzer şekilde, ESL ölçüm bizim modelinin benimsenmesi başka fare hemodinamik stabilite, oksijenasyon, ventilasyon ve akciğer hasarı yokluğunda sağlamak için benzer optimizasyon gerektirir.
Biz ESL ölçümü için bizim öncelikli yaklaşım şekli olarak dekstran dışlama kullanmayı seçti. ESL ölçümler pulmoner ve kardiyak hareket artefaktı olumsuzlayan, zaman içindeki tek bir anı yapılmış olabilir gibi bu teknik, bizim model için çok uygundur. Sistemik mikrovasküler önceki çalışmalarda dekstran dışlanma küçük damarlar (<15 mikron 6) sadece doğru olduğunu ileri sürmüşlerdir ederken, çapı 30 mikron kadar damarlarda uyumlu ESL değişiklikleri kaydetti. Bu farklılıklar plevral yüzeyine özel optik karakteristiklerine bağlı olabilir.
Hareketli bir vasküler yatakta, bunun gerekli olduğunu Aydınlık ve floresan görüntüleme ogörüntü elde etme, hatta kısa bir gecikme (sıralı görüntüleri arasında örneğin deklanşör kapanması) eş zamanlı olarak ccurs, ölümcül ESL kalınlık ölçümleri bulandırabilir olurdu. Havalandırma duraklatma bu karıştırıcı azaltabilir ederken, bir inspiratuar aralık tamamen heterojen-şişirilmiş, yaralı akciğerlerde gaz dağıtılması veya kardiyak hareket artefaktı veya solunum artifact ("pendelluft") 20 engellemez. Biz aynı anda tek bir CCD kamera için aydınlık ve floresan görüntü göndermek için bir görüntü ayırıcı kullanmak için seçti. Alternatif yaklaşımlar potansiyel olarak eşzamanlı konfokal mikroskopi sırasında yansıyan ışık ve floresan görüntü yakalamak için dikroik aynalar kullanımını içerebilir.
Bizim modelin ek bir kritik talep uzmanlaşmış su daldırma hedeflerinin kullanılmasıdır. Bu hedefler damar genişliği küçük farklar çözünürlüklü hala BAKıMı ise izin için yeteri kadar büyük sayısal diyafram olmalıdırg torasik pencere ve plevra yüzeyine hem nüfuz yeterli çalışma mesafesi. Bu amaçlar, mevcut iken, son derece pahalıdır. DIC vasküler genişlik ölçümlerinin hassasiyeti artırır olarak yansıyan ışık diferansiyel girişim kontrast (DIC) mikroskop kullanımı, boyanmamış dokusu kenarları vurgular aydınlık tekniği, ayrıca arzu edilir.
Alternatif teknikler pulmoner ESL genişliği tespiti yapılmamış. Mikroküre velosimetri doğru hareket eden bir vasküler yatakta yapılamaz iken, mikroküre yapışma dolaylı pulmoner glycocalyx bütünlüğünü sınamak için istihdam edilebilir. Biz daha önce sağlam ESL fonksiyonlarını endotel yüzey adezyon moleküllerinin 2 mikroküreler dolaşan dışlamak olduğunu göstermiştir. Endotel yüzey, anti-ICAM-1 mikrosfer yapışma varlığı, bu nedenle glycocalyx ESL / bütünlük kaybı gösterir. Bu teknik, eşzamanlı brightf gerektirmezield / floresan görüntüleme, ne yüksek sayısal açıklık hedefleri gereklidir. Ancak, çok önemli bir unsur var: artan anti-ICAM-1 mikroküre yapışması için glycocalyx kaybını göstermek için, kontrol ve deney grupları arasında benzer ICAM-1 hücre yüzeyinde ifade olmalıdır. ICAM-1 endotel yüzey ekspresyonu sepsis kaynaklı akciğer hasarı 2 erken (<45 dk) sabit kalırken, yüzey ekspresyonu sonunda NF-KB bağımlı bir şekilde 21 artacak. Glycocalyx bütünlüğünün bir göstergesi olarak mikroküre yapışma kullanımı, bu nedenle, sadece erken enflamasyon sırasında geçerli olabilir.
Bizim cerrahi ve mikroskopi teknikleri akciğer hasarı 2 neden yok iken Unutmayın ki, bu deneysel akciğer hasarı (intratrakeal asit damlatılması ile tetiklenen örneğin yaralanma) ESL kalınlığı ölçümleri etkiler gelişen nasıl belirsizdir. Akciğer ödemi Gelişen potansiyel damar genişliği DIC ölçümleri bulandırabilir olabilirve / veya etkisi dekstran geçirgenliği. Bu belirsizlik, akciğer ESL içinde gözlenen değişiklikler teyit etmek için çoklu teknikler tamamlayıcı kullanımı (örneğin, dekstran dışlama, mikrosfer yapışma, aynı zamanda damar glikozaminoglikan içerik 2 doğrulayıcı histolojik değerlendirme) ile hafifletilebilir.
Özetle, başlangıçta Tabuchi ve Kuebler tarafından bildirilen cerrahi yaklaşım genişleterek, biz pulmoner ESL detaylı gözlem için izin veren bir deneysel model geliştirdik. Bu modelin kullanımı sağlık ve hastalıkta pulmoner vasküler fizyoloji endotel glycocalyx öneminin daha iyi anlaşılması için izin vermelidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Biz Dr teşekkür ederim. Arata Tabuchi ve intravital mikroskopi ile ilgili talimat Wolfgang Kuebler (Toronto Üniversitesi). Biz mikroskobu tasarımı ve uygulanmasında yardım için Andrew Cahill (Nikon Instruments) teşekkür ederim. Bu çalışma NIH / NHLBI hibe P30 HL101295 ve K08 HL105538 (EPS) tarafından finanse edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Name of Reagent | |||
| FITC-dextran (150 kDa) | Sigma | FD150S | |
| TRITC-dextran (150 kDa) | Sigma | T1287 | |
| Streptavidin-coated fluorescent microspheres | Bangs Laboratories | CP01F/10428 | Dragon Green fluorescence (similar to FITC) |
| Ketamine | Moore Medical | ||
| Xylazine | Moore Medical | ||
| Anti-ICAM-1 biotinylated antibody | eBioscience | Clone YN1/1.7.4 | 1:50 dilution |
| Isotype biotinylated antibody | eBioscience | IgG2b eB149/10H5 | 1:50 dilution |
| EQUIPMENT | |||
| Mechanical ventilator | Harvard Apparatus | Inspira | |
| Tracheostomy catheter | Harvard Apparatus | 730028 | |
| Electrocautery apparatus | DRE Medical | Valleylab SSE-2L | |
| Bipolar cautery forceps | Olsen Medical | 10-1200I | 9.9cm McPherson |
| Temperature control system | World Precision Instruments | ATC1000 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | Pump 11 Elite | |
| Microscope (widefield) | Nikon | LV-150 | |
| Microscope (confocal) | Nikon | A1R | |
| Image splitter | Photometrics | DV2 | |
| CCD camera | Photometrics | CoolSNAP HQ2 | |
| Image processing software | Nikon | NIS Elements | |
| Polyvinylidene membrane | Kure Wrap | ||
| Circular cover slip | Bellco | 5CIR-1-BEL | 5 mm, #1 thickness |
| Glue (cover slip to membrane) | Pattex | Flussig (liquid) | For affixing cover slip to membrane |
| Glue (cover slip to mouse) | Pattex | Gel | For attaching membrane to mouse |
| Surgical tubing | Intramedic | PE50, PE10 | |
| Suture | Fisher | 4:0 silk | |
| Electric razor | Oster | 78997 | |
| Curved surgical forceps | Roboz | ||
| Straight surgical forceps | Roboz | ||
| Surgical scissors | Roboz | ||
| Surgical microscissors | Roboz | ||
| Surgical needle driver | Roboz | ||
| Surgical tape | Fisher | ||
| Kitchen sponges (cut into wedges) | various | ||
References
- Negrini, D., Tenstad, O., Passi, A., Wiig, H. Differential degradation of matrix proteoglycans and edema development in rabbit lung. AJP - Lung Cellular and Molecular Physiology. 290, L470-L477 (2006).
- Schmidt, E. P., et al. The pulmonary endothelial glycocalyx regulates neutrophil adhesion and lung injury during experimental sepsis. Nat. Med. 18, 1217-1223 (2012).
- Florian, J. A., et al. Heparan sulfate proteoglycan is a mechanosensor on endothelial cells. Circ. Res. 93, e136-e142 (2003).
- Chappell, D., et al. The Glycocalyx of the Human Umbilical Vein Endothelial Cell: An Impressive Structure Ex Vivo but Not in Culture. Circulation Research. 104, 1313-1317 (2009).
- Potter, D. R., Damiano, E. R. The hydrodynamically relevant endothelial cell glycocalyx observed in vivo is absent in vitro. Circ. Res. 102, 770-776 (2008).
- Weinbaum, S., Tarbell, J. M., Damiano, E. R. The Structure and Function of the Endothelial Glycocalyx Layer. Annual Review of Biomedical Engineering. 9, 121-167 (2007).
- Pittet, M., Weissleder, R. Intravital Imaging. Cell. 147, 983-991 (2011).
- Kilpatrick, D. C., Graham, C., Urbaniak, S. J., Jeffree, C. E., Allen, A. K. A comparison of tomato (Lycopersicon esculentum) lectin with its deglycosylated derivative. Biochem. J. 220, 843-847 (1984).
- Smith, M. L., Long, D. S., Damiano, E. R., Ley, K. Near-wall micro-PIV reveals a hydrodynamically relevant endothelial surface layer in venules in vivo. Biophys. J. 85, 637-645 (2003).
- Vink, H., Duling, B. R. Identification of Distinct Luminal Domains for Macromolecules, Erythrocytes, and Leukocytes Within Mammalian Capillaries. Circ. Res. 79, 581-589 (1996).
- Marechal, X., et al. Endothelial glycocalyx damage during endotoxemia coincides with microcirculatory dysfunction and vascular oxidative stress. Shock. 29, 572-576 (2008).
- Presson, R. G. Jr, et al. Two-Photon Imaging within the Murine Thorax without Respiratory and Cardiac Motion Artifact. The American Journal of Pathology. 179, 75-82 (2011).
- Looney, M. R., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nat. Meth. 8, 91-96 (2011).
- Pearse, D. B., Wagner, E. M., Permutt, S. Effect of ventilation on vascular permeability and cyclic nucleotide concentrations in ischemic sheep lungs. J. Appl. Physiol. 86, 123-132 (1999).
- Hossain, M., Qadri, S., Liu, L. Inhibition of nitric oxide synthesis enhances leukocyte rolling and adhesion in human microvasculature. Journal of Inflammation. 9, 28 (2012).
- Schmidt, E. P., et al. Soluble guanylyl cyclase contributes to ventilator-induced lung injury in mice. AJP - Lung Cellular and Molecular Physiology. 295, L1056-L1065 (2008).
- Mead, J., Takishima, T., Leith, D. Stress distribution in lungs: a model of pulmonary elasticity. J. Appl. Physiol. 28, 596-608 (1970).
- Tabuchi, A., Mertens, M., Kuppe, H., Pries, A. R., Kuebler, W. M. Intravital microscopy of the murine pulmonary microcirculation. J. Appl. Physiol. 104, 338-346 (2008).
- Gattinoni, L., Protti, A., Caironi, P., Carlesso, E. Ventilator-induced lung injury: the anatomical and physiological framework. Crit. Care Med. 38, 539-548 (2010).
- Tabuchi, A., Kim, M., Semple, J. W., Kuebler, W. M. Acute Lung Injury Causes Pendelluft Between Adjacent Alveoli In Vivo. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 183, A2490 (2011).
- Roebuck, K. A., Finnegan, A. Regulation of intercellular adhesion molecule-1 (CD54) gene expression. J. Leukoc. Biol. 66, 876-888 (1999).
