Summary
De endotheliale glycocalyx / endotheliale oppervlaktelaag is ideaal bestudeerd met behulp van intravitale microscopie. Intravitale microscopie is technisch uitdagend in een bewegend orgaan zoals de longen. We zien hoe gelijktijdige helderveld en fluorescentiemicroscopie kan worden gebruikt om endotheeloppervlak laagdikte schatten in een vrij bewegende
Abstract
De endotheliale glycocalyx is een laag van proteoglycanen en glycosaminoglycanen verbonden langs de vasculaire lumen. In vivo, de glycocalyx is sterk gehydrateerde, die een belangrijke endotheliale oppervlaktelaag (ESL) die bijdraagt aan het behoud van de endotheelfunctie. Aangezien de endotheliale glycocalyx is vaak afwijkend in vitro en gaat verloren tijdens normale weefsel fixatie technieken, studie van de ESL vereist het gebruik van intravitale microscopie. Om zo goed mogelijk benadert de complexe fysiologie van de alveolaire microvasculatuur, wordt pulmonale intravitale beeldvorming idealiter uitgevoerd op een vrij bewegende long. Deze preparaten echter gewoonlijk lijden uitgebreide bewegingsartefacten. We zien hoe closed-chest intravitale microscopie van een vrij bewegende muizenlong kan worden gebruikt om glycocalyx integriteit meten via ESL uitsluiting van fluorescentie-gemerkt hoog molecuulgewicht dextranen van het endotheeloppervlak. Dit terminaal chirurgische techniek, die vereistgelijktijdige helderveld en fluorescerende beeldvorming van de muis long, zorgt voor een longitudinale observatie van de subpleural microvasculatuur zonder aanwijzingen voor het induceren van confounding longschade.
Introduction
De endotheliale glycocalyx is een extracellulair laag van proteoglycanen en glycosaminoglycanen verbonden langs de vasculaire intima. In vivo, de glycocalyx is sterk gehydrateerde, die een belangrijke endotheliale oppervlaktelaag (ESL) die een verscheidenheid van functies zoals endotheliale vloeistof permeabiliteit 1, neutrofiel-endotheliale regelt adhesie 2 en de mechanotransductie vloeistof schuifspanning 3.
Historisch gezien is de glycocalyx is ondergewaardeerde vanwege zijn aberrance in gekweekte celpreparaten 4, 5 en de afbraak tijdens normale weefsel fixatie en verwerking 6. Het toenemende gebruik 7 van intravitale microscopie (in vivo microscopie, IVM) heeft samen met verhoogde wetenschappelijke belangstelling voor het belang van de ESL tot vaatfunctie bij gezondheid en ziekte. De ESL is onzichtbaar voor lichtmicroscopie en kunnen niet gemakkelijk worden geëtiketteerdvivo, gezien de neiging van fluorescerende glycocalyx-bindende lectinen te RBC agglutinatie 8 en fatale longembolie (niet gepubliceerde observaties) veroorzaken. Verschillende indirecte benaderingen zijn daarom ontwikkeld om ESL dikte (en, bij uitbreiding, glycocalyx integriteit) af te leiden in niet-bewegende vaatbedden zoals de cremasteric en mesenteriale microcirculations. Deze technieken omvatten het meten van verschillen in circulerende microdeeltje snelheid als functie van de afstand tot de endotheliale membraan (micropartikel image velocimetry 9) en het meten van de uitsluiting van volumineuze, fluorescentie-gemerkt vasculaire markers (bijv. dextranen) van het endotheeloppervlak (dextran uitsluiting techniek 10, 11). Van deze technieken alleen dextran uitsluiting kan schatten ESL dikte van metingen op een bepaald tijdstip. Door het gelijktijdig meten van vasculaire breedtes met helderveld microscopie (een breedte inclusive de "onzichtbare" ESL) en fluorescentiemicroscopie van een vasculair tracer buiten de ESL kan ESL dikte worden berekend als de helft van het verschil tussen vasculaire breedtes 2.
Het gebruik van een momentane meting van ESL dikte geschikt voor studie van de pulmonale glycocalyx. Intravitale microscopie van de long is een uitdaging, een grote mate van pulmonale en cardiale bewegingsartefact. Hoewel recente vorderingen maken voor immobilisatie van muizenlongen in vivo 12, 13 bestaan zorgen over de fysiologische gevolgen van long stasis. Lung immobiliteit wordt in verband gebracht met een verminderde endotheel NO signalering 14, een signaalweg die zowel neutrofiele adhesie 15 en longschade 16 beïnvloedt. Bovendien immobilisatie van een gebied van long bloot rond mobiele alveolen schadelijke afschuifkrachten (zogenaamde "atelectrauma"), in overeenstemming met de klassieke fysiologische begrippenalveolaire onderlinge afhankelijkheid 17.
In 2008, Arata Tabuchi, Wolfgang Kuebler en collega's ontwikkelden een chirurgische techniek waardoor intravitale microscopie van een vrij bewegende muizenlong 18. Respiratoire artefact als gevolg van deze techniek kan worden teniet gedaan door gebruik van snelle beeldvorming, met inbegrip gelijktijdige meting van helderveld en fluorescentiemicroscopie. In dit verslag wordt beschreven hoe momentane dextran uitsluiting imaging kunnen worden gebruikt om VSV dikte te meten in de subpleural microcirculatie van een vrij bewegende, in vivo muizenlong. Deze techniek kan eenvoudig worden aangepast om glycocalyx bepalen functie-specifiek, het vermogen van een intact ESL uitsluiten circulerende elementen van het endotheeloppervlak. We hebben onlangs deze technieken het belang van pulmonale ESL integriteit van de ontwikkeling van acute longbeschadiging te bepalen tijdens systemische ontstekingsziekten zoals sepsis 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Voorbereiding van chirurgische Tubing, vasculaire katheters, Borst Muur Raam
- Intravitale microscopie podium. We custom-made een plexiglas stadium waarop de verdoofde muis ligt tijdens microscopie. Deze fase geschikt zowel een 15 x 10 cm flexibele kunststof snijplank (waarop de muis ligt tijdens de inductie van de anesthesie, tracheostomie plaatsing en veneuze catheterisatie) en een even grote verwarmingselement (onder de snijplank).
- Muis thoracostomy tube preparaat (figuur 1). Een 10 cm lang PE 50 buis (Intramedic, inwendige diameter 0,58 mm, 0,965 mm buitendiameter) wordt gesneden. Een uiteinde is bevestigd aan het stompe uiteinde van een gebogen 23 gauge naald, deze naald wordt gebruikt om de buis door het borstwand (binnen → buiten) vóór het sluiten van de thoracale venster.
Het distale einde van de buis (1,5 cm lang, tegenover de bijgevoegde 23 gaugenaald) wordt herhaaldelijk doorboord door een naald van 30 gauge, het creëren van "poorten aan de zijkant" om effectieve aspiratie van intrathoracale lucht te vergemakkelijken.
Deze fenestratie deel wordt vervolgens gescheiden van de rest van de buis door verscheidene perifere lussen van 4:00 zijden hechtdraad, deze lussen zal als "stopper" uiteindelijk verankering van 1,5 cm fenestratie gedeelte in de borstholte. - Jugulaire katheters. Twee 15 cm lengte van PE 10 buis (Intramedic, inwendige diameter 0,28 mm, buitendiameter 0,61 mm) worden afgesneden. Een scalpel wordt gebruikt om de schuine uiteinden van de buis, waardoor het gemak van venapunctie. De buis wordt gespoeld met een 1 ml spuit met 6% 150 kDa dextranoplossing (in PBS) aan de niet-afgeschuinde uiteinde van de buis.
- Borstwand venster bereiding (figuur 2). Transparent polyvinylideen membraan (New Kure Wrap, Kuresha, Tokyo) wordt gesneden in een ovale vorm (6 cm hoofdas, nevenas 4 cm). Een ronde 5 mm # 1 dekglaasje (Bellco) is bevestigd aan het membraan met behulp α-cyanoacrylaat lijm (Pattex Flüssig, Henkel, Düsseldorf).
- . Buis voor pneumothorax inductie ("blow tube") Een 10 cm stuk buis (inwendige diameter 3 mm, buitendiameter 5 mm) is bevestigd aan een 5 ml spuit, het andere uiteinde wordt gebruikt om lucht in het dier borstkas voorafgaand aan de borstwand venster aanslaan.
- Injectiespuit voor water ondergedompeld doel. Een 23 gauge naald bevestigd aan een 30 ml spuit met gedestilleerd water. De punt van de naald wordt tegengewerkt (met een metalen vijl) om schade aan de doelstelling te voorkomen.
2. Muis Anesthesie
- Een muis wordt verdoofd met een mengsel van ketamine (10 mg / ml) en xylazine (2 mg / ml), intraperitoneaal toegediend in een dosis van 8 pi per muis gram lichaamsgewicht. Sedatie duurt 3 - 6 min en mogen op geen spontane ademhaling.
- Met behulp van een elektrisch scheerapparaat, scherende keel, borst, buik en rechterzijde van de muis.
- Met behulp van tape, zet de muis om een dun plastic snijplank. Het hoofd van de muis moet naar de operator (figuur 3). Gentle spanning geleverd door een lus van hechtdraad passeren onder de bovenste tanden dient te onderhouden hoofd extensie. De snijplank is geplaatst op een verwarmingselement, het onderhouden van de muis euthermia tijdens tracheostomie en veneuze katheter.
- Natte geschoren gebieden met 100% ethanol.
- Bevestig adequate anesthesie met een staart / poot knijpen. Ga als minimale respons; zorgen voor een extra bolus van ketamine / xylazine als onvoldoende verdoofd.
3. Tracheostomie
- A 1 cm incisie gemaakt over de keel. Onderliggende bindweefsel wordt ontleed en de speekselklieren worden gescheiden en zijdelings gereflecteerd. De sternohyoid spier direct anterieur van de trachea is weggesneden.
- Een lus van 04:00 hechtdraad wordt voortbewogen onder ee trachea (figuur 4). De lus wordt vervolgens gesneden, het creëren van twee aparte strengen van hechtdraad ten grondslag liggen aan de luchtpijp. De caudale hechtdraad wordt gebruikt om de tracheotomiecanule waarborgen; de schedelholte hechtdraad wordt gebruikt om spanning op de trachea bieden tijdens tracheostomie plaatsing.
- Met twee vingers, wordt de bovenste hechting vastgegrepen en zachte spanning op de trachea. Een horizontale incisie gemaakt in de trachea tussen bovenste en onderste hechtingen. Deze incisie moeten elkaar kruisen ongeveer twee derde van de tracheale omtrek. Een flens tracheotomiecanule (Harvard Apparatus, 1,22 mm buitendiameter) wordt in de distale trachea en vastgezet vast met de caudale tracheale hechtdraad.
- Tracheostomie is verbonden met een in volume geregelde ventilator klein dier (Inspira, Harvard Apparatus), en de muis ventilatie met 40% ingeademde zuurstof en 9 ml / kg teugvolumes (geoptimaliseerd voldoende zuurstof / ventilatie in ons laboratorium te houden). Positieve eind-expiratoire druk (PEEP) is niet begonnen op dit punt. Van de nota, dient ventilator instellingen worden geoptimaliseerd om unieke omstandigheden binnen de afzonderlijke laboratoria. Verschillende lengtes van overtollige buis (geplaatst tussen de ventilator buis Y-connector en tracheostomie) kan gebruikt worden om dode ruimte passen, een stabiele alveolaire ventilatie voor gekozen tidal volume.
4. Veneuze catheterisatie
- Het verbindingspunt van de interne en externe halsader kunnen worden geïdentificeerd door het volgen distale veneuze vertakkingen proximaal. De externe jugularis wordt gevonden onder de gereflecteerde speekselklieren, dit kan proximaal terug te voeren op de externe-interne halsader knooppunt te vinden.
- Gebruik zachte stompe dissectie tot de halsader knooppunt te scheiden van de omliggende bindweefsel.
- Met behulp van 04:00 hechtingen, binden uit de externe halsslagader en de interne jugular aderen distale (craniale) aan de halsader knooppunt.
- Maak een kleine incisie in de carinavan de jugulaire junctie; bloeding minimaal.
- Twee katheters kan stapsgewijs worden voortbewogen door de insnijding en in de halsader stam. Na een zachte aspiratie om bloed terugkeer te verzekeren, worden katheters bevestigd in de ader met behulp van 04:00 hechtingen.
- Tape veneuze katheters om de snijplank om te voorkomen dat tegen het per ongeluk losraken.
5. Intravitale Mouse Lung Microscopie Chirurgie (overgenomen van Tabuchi et al. 18).
- De snijplank (met de ingehouden verdoofde muis en opgenomen veneuze katheters) is overgezet naar de intravitale microscopie fase waarin de resterende chirurgische ingrepen worden uitgevoerd. Een rectale temperatuur sonde wordt geplaatst, dit interfaces met een adaptieve verwarmingssysteem (onder de snijplank), waardoor het onderhoud van de muis euthermia.
- Een jugular veneuze katheter bevestigd aan een spuitpomp met een ketamine (10 mg / ml)-xylazine (2 mg / ml) levertmengsel bij 200 ui per uur. Adequate anesthesie wordt opnieuw bevestigd met behulp van de staart / poot knijpen.
- De incisie wordt verlengd vanaf de hals naar de xyphoid proces verloopt dan zijdelings naar rechts (figuur 5).
- Met elektrocauterisatie, wordt de borstmuskulatuur verwijderd, waardoor de borstkas. Zorg is genomen om volledige hemostase te garanderen.
- Steek de muis recht achterbeen over de linker kant en band naar beneden. De resulterende abdominale torsie draait de thorax licht, een vereenvoudigd de operatie.
- Plaats de fase een hoek van 45 graden (figuur 6); deze positionering kan de long afvallen van de borstwand wanneer de pneumothorax wordt geïnduceerd.
- De 1 e rib (meest inferieure rib) wordt vastgepakt met een pincet en getogen, een gebogen pincet wordt botweg geduwd onder de rib. Dit scheidt pariëtale pleura van de borstwand. Het borstvlies moet blijven unpunctured.
- Met de blaaspijp eneen spuit, wordt de lucht met kracht ingezet tegen de pariëtale pleura. Dit leidt tot breuk van de pleurale oppervlak en pneumothorax zonder de onderliggende long. De onderliggende long zullen afvallen van de borstwand, waardoor invoering van een elektrocauterisatie pincet zonder beschadiging van de longen. Een afname in ventilator slagvolume is meestal niet nodig tijdens deze stap.
- Met behulp van elektrocauterisatie tang, ontleden de borstwand spieren en dwars door de 5 e en 6 e ribben / pariëtale pleura, het maken van een ~ 8 mm rond gat in de borstwand. Het is essentieel dat volledige hemostase wordt gehandhaafd, aangezien de aanwezigheid van bloeding zal verduisteren microscopie (figuur 7).
- Met behulp van een naald driver, plaatst u de thoracostomy buis in de borstwand gat. De naald moet doorprikken de borstwand en verlaat de borstholte inferieur en lateraal van de thoracale venster (Figuur 7). Pas op dat aanprikken van de membraan. Debuis wordt vervolgens voorzichtig teruggetrokken uit de borstwand totdat weerstand optreedt van het hechtmateriaal "stop" aan de rand van de fenestratie van de buis.
- Plaats het podium plat.
- Voeg 3 cm H 2 O PEEP om de ventilator te helpen te helpen long reexpansion.
- Lijm (Pattex gel, Henkel) is de omtrek geplaatst rond de borst venster. Het membraan is bevestigd, met de glazen dekglaasje naar buiten naar de borstholte. Voorzichtig (en in omtreksrichting) bij benadering het membraan naar de lijm met een katoenen applicator.
- Tijdens het uitvoeren van een long recruitment manoeuvre (3 teugvolumes waarin de PEEP ventilator poort geblokkeerd wordt), is -3 mm Hg zuigkracht toegepast op de thoraxdrain. De long moet voortdurend bij benadering het membraan terwijl ze vrij bewegen tijdens het getij ventilatie (figuur 8).
- De rechter voorpoot van de muis overgestoken naar links, waardoor de laterale decubitus positie van de muis.Spons wiggen kan worden gebruikt om de juiste positie muis zodat de borst venster uitgelijnd met de microscopie water immersie objectief.
- Gedestilleerd water wordt op het dekglaasje voor microscopie, waardoor visualisatie van de long met een water immersie objectief. Water moet met tussenpozen worden aangevuld door beeldvorming.
6. Meting van de Pulmonary endotheeloppervlak Laagdikte
- Onmiddellijk na sluiting borstwand wordt 500 ul FITC-gelabelde 150 kDa dextran (6% oplossing in PBS) toegediend via de tweede (niet-anesthesie) jugulaire veneuze katheter. Deze bolus dient als volume reanimatie en de tracer voor vasculaire ESL meting. De dextran bolus heeft geen invloed op neutrofiele adhesie of longoedeem vorming 2.
- Het water immersie objectief gecentreerd is over de dekglas. De keuze van objectieve essentieel te visualiseren kleine verschillen in dikte ESL, een hoge numeriekcal diafragma nodig is (> 0,8) met behoud van een 2 - 3 mm werkafstand (waardoor penetratie door de longen raam en pleurale oppervlak). We maken gebruik van de Nikon Gerecht van eerste aanleg 75 LWD 16x (NA 0,8) en CFI 75 LWD 25x (NA 1,1) doelstellingen voor dit doel.
- Een nauwkeurige meting ESL dikte in een bewegend orgaan, is het essentieel dat helderveld en fluorescent vasculaire breedtes gelijktijdig worden uitgevoerd. Dit kan worden bereikt met behulp van een afbeelding splitter (Dual View, Photometrics) waarmee tegelijkertijd nemen van gereflecteerd licht differentieel interferentie contrast (DIC, helderveld) en FITC beelden (Figuur 9).
- Tijdens een 5 sec inspiratoire pauze wordt continue beeldvorming uitgevoerd en opgenomen. Later kunnen deze beelden worden herzien om in-focus frames te identificeren.
- Met behulp van een in-scherpstelkader, subpleural microvaten (<20 micrometer diameter) worden geïdentificeerd; minstens 3 microvaten zijn meestal te vinden op een enkel frame. Na voltooiing van het experiment, DICen FITC-dextran vasculaire breedten worden gemeten (door een geblindeerde waarnemer) door het gemiddelde lengte van drie loodrechte intercepts per microvaatje. Bij gelijke dikte ESL aan beide randen van het vaartuig kan de ESL afmetingen worden bepaald door de helft van het verschil tussen DIC en FITC-dextran vasculaire breedtes, zoals beschreven in de sectie Representatieve resultaten.
- Meestal kan intravitale microscopie worden uitgevoerd voor> 90 min zonder enig bewijs van longschade of hypotensie 2. Voorlopige experimenten moeten worden uitgevoerd om de muis stabiliteit (bloeddruk, oxygenatie, ventilatie, longbeschadiging) bevestigen in de periode van waarneming. Experimentele geneesmiddelen worden via de tweede (niet-verdoving) jugulaire catheter op enig moment tijdens de procedure.
7. Meting van de alternatieve Pulmonary Endothelial oppervlaktelaag Integrity
De intacte endotheliale oppervlaktelaag functies (gedeeltelijk) te circulat sluitening elementen uit het endotheliale oppervlak 2. ESL integriteit kan derhalve worden gemeten door het vermogen van een circulerende element (bijv. een fluorescerend microbolletje) toegankelijk en interactie met celoppervlak adhesiemoleculen (zoals ICAM-1).
- Anti-ICAM-1 gemerkte fluorescerende microbolletjes worden voorbereid vóór chirurgie. Streptavidine beklede 0,97 um fluorescerende microbolletjes worden geïncubeerd met gebiotinyleerd anti-ICAM-1 (YN1/1.7.4 kloon, 1:50, eBioscience) of isotype controle antilichaam gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. De microsferen worden driemaal gewassen en gesuspendeerd in PBS met 1 x 10 9 microbolletjes per ml.
- Tijdens intravitale microscopie wordt de microsferensuspensie (100 ui) geïnjecteerd in de halsader katheter. Na 15 min van het verkeer, zijn fluorescerende beelden die zijn vastgelegd in 5 minuten. Microsferen onbeweeglijk gedurende> 5 min worden beschouwd als aanhanger en gekwantificeerd met behulp van beeldverwerking software.
8. Euthanasia
<p class = "jove_content"> Na afloop van de procedure, zijn verdoofde muizen gedood door verbloeding via directe hartpunctie. Euthanasie wordt bevestigd via bilaterale pneumothorax, waarna longen worden geoogst en snap-bevroren voor latere analyse.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De experimentele benadering beschreven in de stappen 1-6 zal vangst van meerdere frames van gelijktijdige DIC (helderveld) en fluorescerende beelden. Om ESL dikte ervan, worden opnamen beoordeeld door een geblindeerde waarnemer na voltooiing van de experimentele protocol. Met een in-focus frame, subpleural microvaatjes (<20 urn diameter) worden geïdentificeerd, tenminste 3 microvaatjes worden meestal op een frame (Figuur 10). Met beeldanalyse software (NIS Elements, Nikon) zijn vasculaire breedte gemeten (door een geblindeerde waarnemer) door het gemiddelde lengte van drie loodrechte intercepts per microvaatje. De ESL onzichtbaar is DIC imaging, DIC vasculaire endotheliale breedte uitstrekken membraan endotheliale membraan en dus inclusief ESL dikte 9, 10. Daarentegen wordt FITC-dextran (150 kDa) niet in de ESL. Bijgevolg zijn FITC vasculaire breedtes niet zijn voorzien van ESL dikte. Uitgaande van een gelijke ESL dikheid aan beide randen van het vaartuig kan de grootte ESL worden omschreven met de helft van het verschil tussen DIC en FITC-dextran vasculaire breedtes.
Verschillende potentiële technische valkuilen kunnen interfereren met de interpretatie van experimentele resultaten. De aanwezigheid van bloeden in de microscopie veld zal verduisteren zowel DIC en FITC visualisatie van de subpleural microvasculatuur, daarom, zorg moeten worden genomen om hemostase (met behulp van elektrocauterisatie) te verkrijgen tijdens het venster plaatsing (5,9). Bovendien, de longen misschien niet reapproximate de thoracale venster na de werving manoeuvre (5.14), dit geeft meestal onvolledig omtrek hechting van het membraan rond de thoracale venster. Dit kan meestal worden hersteld door opnieuw aanbrengen van lijm rond de borstkas venster, gevolgd door een herhaling longfunctie manoeuvre. Ten slotte moet erop worden gelet dat accidentele injectie van intraveneus lucht te vermijden in de muis. Luchtembolie, zelfs als ze niet dodelijk, zal preferenti bondgenoot reizen naar de nondependent longen, het voorkomen van FITC-dextran perfusie van de gevisualiseerde (nondependent) subpleural microvasculatuur.
Meting van de ESL breedtes vereist het gebruik van een afbeelding splitter (affording gelijktijdige DIC en fluorescerende beeldvorming) en gespecialiseerde microscopie doelstellingen. Deze apparatuur eisen kunnen worden voorkomen met een aantal aanpassingen aan ons protocol. Glycocalyx integriteit kunnen indirect worden gemeten door ESL uitsluiting van circulerende microsferen uit het vat oppervlak. De aanwezigheid van ESL afbraak wordt daarom aangeduid door een verhoging subpleural microvasculaire vangst van microsferen gericht tegen endotheeloppervlak adhesiemoleculen (zoals ICAM-1) (figuur 11).
Figuur 1.
Figuur 2.
Figuur 3.
Figuur 4.
Figuur 5.
Figuur 6.
Figuur 7.
Figuur 8.
Figuur 9.
Figuur 10. Meting van muis pulmonale ESL dikte. (A) Vertegenwoordiger tegelijkertijd-gevangen DIC en fluorescerende beelden van de muis subpleural microvasculatuur (schaal bar, 50 pm). Microvat breedte wordt gemeten met behulp van het gemiddelde van drie loodrechte lineair onderschept. ESL dikte kan worden bepaald door de helft van het verschil tussen DIC (inclusief de ESL) en fluorescente (exclusief de ESL)microvaatjes breedtes. (b) DIC metingen nauwkeurig te identificeren subpleural vaatwand grenzen, zoals blijkt uit bijna-identieke DIC en GFP schip breedte metingen die in endotheel-tl Tie2-GFP muizen (Jackson Labs). Doorlopende lijn staat voor identieke lijn. (C) De subpleural microvasculatuur kan de lengte worden gevolgd, zoals blijkt uit het progressieve verlies van ESL dikte die zich na intraveneuze lipopolysaccharide (LPS). N = 3 muizen. * P <0,05 in vergelijking met tijd = 0 min door ANOVA.
Film 1. Kalende haarvaten integriteit kan worden vastgesteld door beoordeling van anti-ICAM-1 microsfeer hechting in de subpleural microvasculatuur. Snelle confocale microscopie (Nikon A1R) toont hechtende fluorescerende microbolletjes 45 min na intraveneuze LPS (20 mg per kg lichaamsgewicht). Merk op dat circulerende microsferen kunnen worden occasionally gezien die door de microcirculatie. Om visualisatie van (groen fluorescerend) microsfeer lokalisatie te verbeteren, in stap 6.1 muizen werden voorbehandeld met de vasculaire tracer TRITC-dextran (150 kDa, 6%) in plaats van FITC-dextran. Klik hier om film te bekijken .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Samenvallend met het toenemende gebruik van in vivo microscopie, is er toenemende waardering voor zowel de aanzienlijke omvang van de ESL evenals de talrijke bijdragen tot vasculaire functie. Deze nieuwe gegevens, echter, zijn hoofdzakelijk afkomstig uit studies van de systemische vaatstelsel. Inderdaad, het gebruik van in vivo microscopie in de long technische uitdagingen, aangezien significante pulmonale en cardiale bewegingsartefacten.
Verschillende recente technische ontwikkelingen hebben geleid tot stabilisatie van de bewegende muis long, bieden een betere toepassing van intravitale technieken om de pulmonale microcirculatie 12, 13. Deze benaderingen zijn echter mogelijk verstoord door de fysiologische gevolgen van long immobiliteit. Omdat de longen is teleologisch een orgaan bedoeld voor continue beweging, zal long stasis intuïtief te veranderen pulmonale fysiologie. Inderdaad, long stasis geassocieerd met veranderingen in endotheliale nitric oxide signalering, een weg met talrijke downstream gevolgen in zowel gezonde long en gewonde 14, 16. Bovendien immobilisatie van een gebied van de long onderwerpen rond alveolen schadelijke afschuifkrachten, consistent met de "atelectrauma" kenmerkend ventilator induceren longschade 19. Deze en andere nog te worden-geïdentificeerde gevolgen van longkanker stasis waarschijnlijk verwarren interpretatie van intravitale waarnemingen van pulmonale microvasculaire (patho) fysiologie.
Gezien deze problemen, wilden we een methode waarmee de pulmonale ESL kunnen worden bestudeerd in een vrij bewegende, in vivo muizenlong ontwikkelen. We kozen ervoor om de techniek van het Tabuchi en Kuebler, een aanpak die longitudinale visualisatie van een vrij bewegende muizenlong mogelijk maakt zonder het aanzetten tot longschade 18 aan te passen. Belangrijk is dat onze aanpak bevat een aantal subtiele veranderingen van oorspronkelijke protocol Tabuchi's, deze alteraties is ontstaan uit de behoefte om unieke omstandigheden binnen ons laboratorium tegemoet te komen. Ook de goedkeuring van ons model van ESL meting elders zal vereisen vergelijkbare optimalisatie om de stabiliteit van de muis hemodynamiek, oxygenatie, ventilatie, en de afwezigheid van longschade te garanderen.
We kozen ervoor om dextran uitsluiting te gebruiken als onze primaire benadering van ESL meting. Deze techniek is zeer geschikt voor ons model, ESL metingen kunnen worden gemaakt van een enkel tijdstip, ontkennen pulmonale en cardiale bewegingsartefacten. Terwijl eerdere studies van de systemische microvasculatuur hebben gesuggereerd dat dextran uitsluiting alleen nauwkeurig in kleine bloedvaten (<15 urn 6), hebben we opgemerkt overeenstemmende ESL veranderingen in schepen tot 30 urn van diameter. Deze afwijkingen kunnen het gevolg zijn optische kenmerken specifiek voor de pleurale oppervlak.
In een bewegend vasculair bed, is het essentieel dat helderveld en fluorescerende beeldvorming occurs tegelijkertijd, als zelfs een korte vertraging in beeld acquisitie (bijv. sluitertijd sluiting tussen opeenvolgende beelden) zou dodelijk verwarren metingen van ESL dikte. Terwijl pauzeren ventilatie kunnen verminderen deze verwarrende, zal een inspiratoire pauze niet volledig voorkomen cardiale bewegingsartefact of respiratoire artefact uit gas herverdeling in heterogeen-opgeblazen, gewonde longen ("pendelluft") 20. We verkozen om een beeld splitter gebruiken om helderveld en fluorescerende beelden tegelijkertijd verzenden naar een CCD-camera. Alternatieve benaderingen zou kunnen zijn het gebruik van dichroitische spiegels gelijktijdig gereflecteerd licht en fluorescerende beelden vast te leggen tijdens confocale microscopie.
Een ander belangrijk vraag van ons model is het gebruik van gespecialiseerde water-onderdompeling doelstellingen. Deze doelstellingen moeten een voldoende grote numerieke apertuur om oplossen van kleine verschillen in breedten vat terwijl ONDERHOUDg een voldoende werkafstand om zowel de borst-venster en pleurale oppervlak doordringen. Deze doelstellingen, maar beschikbaar is, zijn zeer duur. Het gebruik van gereflecteerd licht differentieel interferentie contrast (DIC) microscopie, een helderveld techniek die ongekleurde weefsel randen benadrukt, is bovendien wenselijk, omdat DIC verbetert de precisie van vasculaire breedte metingen.
Alternatieve technieken bestaan voor het bepalen van pulmonale ESL breedte. Terwijl microsfeer velocimetry niet nauwkeurig kunnen worden uitgevoerd op een bewegend vaatbed kan microsfeer hechting worden gebruikt om indirect testen pulmonale glycocalyx integriteit. We hebben eerder aangetoond dat het intacte ESL functies uitsluiten circulerende microbolletjes uit endotheeloppervlak adhesiemoleculen 2. De aanwezigheid van anti-ICAM-1 microsfeer adhesie aan het endotheliale oppervlak geeft dus een verlies aan glycocalyx / ESL integriteit. Deze techniek vereist geen gelijktijdige brightfield / fluorescerende beeldvorming, noch zijn hoge numerieke apertuur doelstellingen noodzakelijk is. Echter, een belangrijk nadeel bestaan: een sterkere anti-ICAM-1 microsfeer adhesie te geven glycocalyx verlies, moet er vergelijkbare ICAM-1 celoppervlakexpressie tussen controle en experimentele groepen. Terwijl ICAM-1 endotheeloppervlak expressie stabiel vroeg (<45 min) in sepsis-geïnduceerde longbeschadiging 2 zal uiteindelijk oppervlakte-expressie te verhogen in een NF-kB afhankelijke wijze 21. Gebruik van microsfeer hechting als marker van glycocalyx integriteit kan daarom alleen geldig tijdens de vroege ontsteking.
Van de nota, terwijl onze chirurgische en microscopische technieken niet het braken longschade 2, het is onzeker hoe evolueert experimentele longbeschadiging (bv. schade veroorzaakt door intratracheale zuur instillatie) beïnvloedt metingen van ESL dikte. Evolving longoedeem zou kunnen verwarren DIC metingen van het schip breedteen / of invloed dextran permeabiliteit. Deze onzekerheid kan worden beperkt door het gebruik van meerdere complementaire technieken (bijv. dextran uitsluiting microsfeer adhesie, evenals bevestiging histologische beoordeling van het vaartuig glycosaminoglycan inhoud 2) de waargenomen veranderingen in de pulmonaire ESL bevestigen.
Samengevat, door uitbreiding van de chirurgische benadering aanvankelijk gerapporteerd door Tabuchi en Kuebler hebben wij een experimenteel model dat zorgt voor de gedetailleerde observatie van de pulmonaire ESL. Het gebruik van dit model moet het mogelijk maken voor een beter begrip van het belang van de endotheliale glycocalyx aan pulmonale vasculaire fysiologie in gezondheid en ziekte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Wij danken Drs. Arata Tabuchi en Wolfgang Kuebler (Universiteit van Toronto) voor instructies over intravitale microscopie. Wij danken Andrew Cahill (Nikon Instruments) voor hulp bij het microscopie ontwerp en uitvoering. Dit werk werd gefinancierd door NIH / NHLBI subsidies P30 HL101295 en K08 HL105538 (naar EPS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Name of Reagent | |||
| FITC-dextran (150 kDa) | Sigma | FD150S | |
| TRITC-dextran (150 kDa) | Sigma | T1287 | |
| Streptavidin-coated fluorescent microspheres | Bangs Laboratories | CP01F/10428 | Dragon Green fluorescence (similar to FITC) |
| Ketamine | Moore Medical | ||
| Xylazine | Moore Medical | ||
| Anti-ICAM-1 biotinylated antibody | eBioscience | Clone YN1/1.7.4 | 1:50 dilution |
| Isotype biotinylated antibody | eBioscience | IgG2b eB149/10H5 | 1:50 dilution |
| EQUIPMENT | |||
| Mechanical ventilator | Harvard Apparatus | Inspira | |
| Tracheostomy catheter | Harvard Apparatus | 730028 | |
| Electrocautery apparatus | DRE Medical | Valleylab SSE-2L | |
| Bipolar cautery forceps | Olsen Medical | 10-1200I | 9.9cm McPherson |
| Temperature control system | World Precision Instruments | ATC1000 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | Pump 11 Elite | |
| Microscope (widefield) | Nikon | LV-150 | |
| Microscope (confocal) | Nikon | A1R | |
| Image splitter | Photometrics | DV2 | |
| CCD camera | Photometrics | CoolSNAP HQ2 | |
| Image processing software | Nikon | NIS Elements | |
| Polyvinylidene membrane | Kure Wrap | ||
| Circular cover slip | Bellco | 5CIR-1-BEL | 5 mm, #1 thickness |
| Glue (cover slip to membrane) | Pattex | Flussig (liquid) | For affixing cover slip to membrane |
| Glue (cover slip to mouse) | Pattex | Gel | For attaching membrane to mouse |
| Surgical tubing | Intramedic | PE50, PE10 | |
| Suture | Fisher | 4:0 silk | |
| Electric razor | Oster | 78997 | |
| Curved surgical forceps | Roboz | ||
| Straight surgical forceps | Roboz | ||
| Surgical scissors | Roboz | ||
| Surgical microscissors | Roboz | ||
| Surgical needle driver | Roboz | ||
| Surgical tape | Fisher | ||
| Kitchen sponges (cut into wedges) | various | ||
References
- Negrini, D., Tenstad, O., Passi, A., Wiig, H. Differential degradation of matrix proteoglycans and edema development in rabbit lung. AJP - Lung Cellular and Molecular Physiology. 290, L470-L477 (2006).
- Schmidt, E. P., et al. The pulmonary endothelial glycocalyx regulates neutrophil adhesion and lung injury during experimental sepsis. Nat. Med. 18, 1217-1223 (2012).
- Florian, J. A., et al. Heparan sulfate proteoglycan is a mechanosensor on endothelial cells. Circ. Res. 93, e136-e142 (2003).
- Chappell, D., et al. The Glycocalyx of the Human Umbilical Vein Endothelial Cell: An Impressive Structure Ex Vivo but Not in Culture. Circulation Research. 104, 1313-1317 (2009).
- Potter, D. R., Damiano, E. R. The hydrodynamically relevant endothelial cell glycocalyx observed in vivo is absent in vitro. Circ. Res. 102, 770-776 (2008).
- Weinbaum, S., Tarbell, J. M., Damiano, E. R. The Structure and Function of the Endothelial Glycocalyx Layer. Annual Review of Biomedical Engineering. 9, 121-167 (2007).
- Pittet, M., Weissleder, R. Intravital Imaging. Cell. 147, 983-991 (2011).
- Kilpatrick, D. C., Graham, C., Urbaniak, S. J., Jeffree, C. E., Allen, A. K. A comparison of tomato (Lycopersicon esculentum) lectin with its deglycosylated derivative. Biochem. J. 220, 843-847 (1984).
- Smith, M. L., Long, D. S., Damiano, E. R., Ley, K. Near-wall micro-PIV reveals a hydrodynamically relevant endothelial surface layer in venules in vivo. Biophys. J. 85, 637-645 (2003).
- Vink, H., Duling, B. R. Identification of Distinct Luminal Domains for Macromolecules, Erythrocytes, and Leukocytes Within Mammalian Capillaries. Circ. Res. 79, 581-589 (1996).
- Marechal, X., et al. Endothelial glycocalyx damage during endotoxemia coincides with microcirculatory dysfunction and vascular oxidative stress. Shock. 29, 572-576 (2008).
- Presson, R. G. Jr, et al. Two-Photon Imaging within the Murine Thorax without Respiratory and Cardiac Motion Artifact. The American Journal of Pathology. 179, 75-82 (2011).
- Looney, M. R., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nat. Meth. 8, 91-96 (2011).
- Pearse, D. B., Wagner, E. M., Permutt, S. Effect of ventilation on vascular permeability and cyclic nucleotide concentrations in ischemic sheep lungs. J. Appl. Physiol. 86, 123-132 (1999).
- Hossain, M., Qadri, S., Liu, L. Inhibition of nitric oxide synthesis enhances leukocyte rolling and adhesion in human microvasculature. Journal of Inflammation. 9, 28 (2012).
- Schmidt, E. P., et al. Soluble guanylyl cyclase contributes to ventilator-induced lung injury in mice. AJP - Lung Cellular and Molecular Physiology. 295, L1056-L1065 (2008).
- Mead, J., Takishima, T., Leith, D. Stress distribution in lungs: a model of pulmonary elasticity. J. Appl. Physiol. 28, 596-608 (1970).
- Tabuchi, A., Mertens, M., Kuppe, H., Pries, A. R., Kuebler, W. M. Intravital microscopy of the murine pulmonary microcirculation. J. Appl. Physiol. 104, 338-346 (2008).
- Gattinoni, L., Protti, A., Caironi, P., Carlesso, E. Ventilator-induced lung injury: the anatomical and physiological framework. Crit. Care Med. 38, 539-548 (2010).
- Tabuchi, A., Kim, M., Semple, J. W., Kuebler, W. M. Acute Lung Injury Causes Pendelluft Between Adjacent Alveoli In Vivo. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 183, A2490 (2011).
- Roebuck, K. A., Finnegan, A. Regulation of intercellular adhesion molecule-1 (CD54) gene expression. J. Leukoc. Biol. 66, 876-888 (1999).
